N-糖基化改造提高Aspergillus fumigatus生淀粉糖化酶的催化效率

宋偉艷,佟毅,李義,陶進(jìn)*,梁穎超,劉松*,李江華

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(吉林中糧生化有限公司 玉米深加工國(guó)家工程研究中心,吉林 長(zhǎng)春,130033)

生淀粉酶是一類可以在低于淀粉糊化溫度下,直接作用于淀粉顆粒的水解酶類[1],包括α-淀粉酶、生淀粉糖化酶[2]、生淀粉普魯蘭酶等。其中生淀粉糖化酶(raw starch glucoamylase,RSGA)作為降解淀粉過程中最重要的淀粉酶之一,可以從淀粉分子非還原端依次水解α-1,4糖苷鍵,產(chǎn)物僅為葡萄糖。在低溫條件下直接降解淀粉不僅能簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝,提高生產(chǎn)效率,而且降低了能源消耗,具有廣闊的應(yīng)用前景。已報(bào)道的生淀粉糖化酶主要來源于黑曲酶[1]、米曲霉[3]、青霉菌[4]等,可以降解不同種類的生淀粉顆粒。然而,目前RSGA對(duì)生淀粉降解催化效率低,酶的最適反應(yīng)溫度較高,大都處于65～75 ℃[2, 5],難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。

N-糖基化修飾是蛋白質(zhì)生物合成中常見的翻譯后修飾之一[6]。通常氨基酸序列具有Asn-Xaa-Ser/Thr的排列特征,其中Xaa為除Pro以外的任意氨基酸[7]。蛋白糖基化途徑關(guān)鍵酶為寡糖轉(zhuǎn)移酶,它對(duì)Asn-Xaa-Thr的偏好高于Asn-Xaa-Ser。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,前者的糖基化頻率是后者的2～3倍[8]。一系列的研究強(qiáng)調(diào)了Asn-Xaa-Thr對(duì)蛋白質(zhì)催化效率的關(guān)鍵作用。例如,在56位點(diǎn)引入Asn-Xaa-Thr基序后,內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)CMC-Na和β-D-葡聚糖的催化效率(kcat/Km)分別提高到原來的1.20和1.28倍[9]。另外,前期對(duì)Aspergillusfumigatus來源的RSGA糖基化研究中,在113位點(diǎn)引入Asn-Xaa-Thr糖基化基序,突變體Q113T生玉米淀粉的降解效率提高21%[10]。因此,通過將糖基化基序中Ser突變?yōu)門hr,可能是一種提高RSGA催化效率有效的方法。

在以前研究中,我們成功在KomagataellaphaffiiGS115中表達(dá)A.fumigatus來源的RSGA,并發(fā)現(xiàn)糖基化對(duì)RSGA降解生淀粉的效率具有重要作用[5]。為提高RSGA對(duì)生玉米淀粉的催化效率,本研究基于NetNGlyc 1.0分析,將3個(gè)具有Asn-Xaa-Ser糖基化基序特征的位點(diǎn)替換為Asn-Xaa-Thr形式,通過對(duì)突變體酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析,獲得催化效率提高的突變體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

EscherichiacoliJM109 (Invitrogen, Carlsbad, USA) 用于基因克隆,E.coliBL21(DE3) 為大腸桿菌表達(dá)宿主,K.phaffiiGS115 (His-) (Invitrogen, Carlsbad, USA) 為酵母表達(dá)宿主。pPIC9K/α-RSGA和質(zhì)粒pET20b(+)/S-RSGA 質(zhì)粒為前期研究所構(gòu)建并保存[5]。

1.1.2 引物

該研究中使用的引物如表1所示。

1.1.3 試劑

Primer STAR DNA聚合酶、Primer STARMAX DNA聚合酶、SalI快切酶、DpnI消化酶,TaKaRa公司(大連);柱回收試劑盒、膠回收試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白電泳試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)蛋白,Invitrogen;質(zhì)粒提取試劑盒、無(wú)氨基酵母氮源(不含氨基酸)、氨芐青霉素、卡納霉素、G418及瓊脂糖,生工生物工程(上海)股份有限公司;玉米淀粉,吉林中糧生化有限公司;蛋白胨和酵母粉,OXIOD公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,pH 7.0。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。

TB(Terrific-Broth)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油5,蛋白胨12,酵母粉24,KH2PO42.31,K2HPO416.37。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB)(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖 20。

甘油緩沖復(fù)合培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,甘油10,無(wú)氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB) 13.4,生物素 4×10-4,pH 6.0的磷酸鉀緩沖液 0.1 mol/L,其中YNB、生物素采用膜過濾除菌。

誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium, BMMY) (g/L):酵母提取物 10,蛋白胨 20,甲醇 10,YNB 13.4,生物素 4×10-4,甲醇 10,pH 6.0的磷酸鉀緩沖液 0.1 mol/L。

最小糊精酶固體培養(yǎng)基(minimal extrase medium, MD) (g/L):葡萄糖 20,YNB 13.4,生物素 4×10-4,瓊脂 20。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

基于PCR原理進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以質(zhì)粒pPIC9K/α-RSGA和pET20b(+)/S-RSGA為模板,分別使用引物對(duì)S123T-F/R、S424T-F/R和S612T-F/R進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增,將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化模板后回收并轉(zhuǎn)化至JM109,涂布于含100 μg/mL氨芐抗生素的LB固體平板。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后將正確的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和序列鑒定,獲得重組質(zhì)粒20b-S123T、20b-S424T、20b-S612T、9K-S123T、9K-S424T和9K-S612T。質(zhì)粒提取參考試劑盒說明書,測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本研究使用的引物見表1。

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)

將重組質(zhì)粒20b-S123T、20b-S424T和20b-S612T轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài),涂布在氨芐抗性的LB固體平板并置于37 ℃培養(yǎng)箱9～12 h。將平板上出的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基并在37 ℃培養(yǎng)8～9 h,接下來以4%接種量轉(zhuǎn)接到TB發(fā)酵培養(yǎng)基,待OD600值達(dá)到1時(shí)添加0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),并在20 ℃培養(yǎng)48 h,于不同時(shí)間取樣并測(cè)定酶活性。

將重組質(zhì)粒9K-S123T、9K-S424T和9K-S612T經(jīng)SalI線性化并回收酶切產(chǎn)物。在電壓1 500 V、電容25 μF及電阻200 Ω條件下電擊轉(zhuǎn)化K.phaffiiGS115,涂布于MD平板并放置于30 ℃培養(yǎng)箱待轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)。長(zhǎng)出單菌落轉(zhuǎn)接到含有4 mg/mL G418的YPD平板,最終獲得3個(gè)突變體S123T、S424T和S612T。將以上突變體接種在裝有40 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃培養(yǎng)24 h。收集發(fā)酵液并離心,用無(wú)菌生理鹽水將菌體洗滌2～3次后重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基當(dāng)中,30 ℃甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá),發(fā)酵120 h,不同時(shí)間取樣測(cè)定酶活力。

1.2.3 重組蛋白的純化

將發(fā)酵結(jié)束的樣品經(jīng)4 000×g離心10 min并收集上清液。使用鎳親和層析純化柱(GE Healthcare)進(jìn)行蛋白及突變體的分離純化。目標(biāo)蛋白在75 mmol/L咪唑條件下洗脫下來。樣品經(jīng)脫鹽柱(GE Healthcare)脫鹽,獲得最終的純酶。

1.2.4 最適反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性測(cè)定

將純化后的純酶分別在40、50、60、70、80 ℃條件下反應(yīng)10 min,以可溶性淀粉為底物,pH 4.6的醋酸鈉緩沖液中測(cè)定糖化酶活性,以最高酶活力為100%計(jì)算其他溫度下的相對(duì)值[11]。將同樣濃度的純酶在60 ℃條件下保溫120 min,每間隔30 min取樣并測(cè)定殘余酶活力,以未處理前的酶活力為100%。

1.2.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定在含有0～2%生玉米淀粉的醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH 4.6)中進(jìn)行[12]。使用OriginPro 2021b進(jìn)行非線性回歸曲線的擬合。

1.2.6 酶活力的測(cè)定

糖化酶活力測(cè)定:底物為2%可溶性淀粉溶液,反應(yīng)體系為400 μL底物,400 μL pH 4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液,200 μL酶液,于40 ℃反應(yīng)10 min后,立即加入1 mL二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)終止反應(yīng),用DNS法測(cè)定體系中產(chǎn)生的還原糖(以葡萄糖計(jì)),對(duì)照為滅活后酶液,依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算酶活反應(yīng)體系中產(chǎn)生還原糖[13]。

糖化酶酶活力定義:在pH 4.6,40 ℃反應(yīng)條件下,1 min水解2%可溶性淀粉溶液產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

生淀粉糖化酶酶活力測(cè)定:以2%的生玉米淀粉懸浮液作為底物(用pH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制),反應(yīng)體系為20 mL底物,0.5 mL酶液,于40 ℃反應(yīng)60 min,立即加入0.5 mL 0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng),對(duì)照為滅活后酶液,反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液于8 000 r/min離心5 min,上清液用DNS法測(cè)定還原糖濃度(以葡萄糖計(jì))。

生淀粉糖化酶酶活力定義:在pH 4.6,40 ℃反應(yīng)條件下,1 h水解2%生玉米淀粉懸浮液產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)[13]。

1.2.7 蛋白分析

使用BCA試劑盒(天根生物,北京)測(cè)定純化蛋白濃度。采用120 g/L聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分析,并使用考馬斯藍(lán)R-250染色,分子凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶。蛋白去糖基化反應(yīng)體系為混合7 μL純酶(2～10 μg蛋白)、1 μL 10×糖苷緩沖液3和2 μL endo-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H(Endo H, New England Biolabs, USA),將該體系放置在37 ℃金屬浴處理12 h,樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.8 生物信息分析

N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過在線網(wǎng)站NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進(jìn)行分析?；赥richodermareesei葡萄糖淀粉酶(PDB ID:2vn4)的晶體結(jié)構(gòu),通過I-TASSER (https://zhanggroup.org/ITASSER/)生成RSGA的模型結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及分析

N-糖基化是畢赤酵母中常見的翻譯后修飾,且不同糖基化基序產(chǎn)生的糖基化效果具有一定差異[8]。通過RSGA氨基酸序列分析及糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)自身存在有2個(gè)糖基化位點(diǎn)N422(Asn422-Gly423-Ser424)和N610 (Asn610-Arg611-Ser612),均為Asn-Xaa-Ser形式的糖基化基序。為優(yōu)化糖基化位點(diǎn),將Ser424和Ser612分別替換為Thr,獲得突變體S424T和S612T。通過NetNGlyc 1.0 Server對(duì)突變后序列進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示突變體S424T糖基化預(yù)測(cè)閾值由0.541 1提高到0.610 2;突變體S612T預(yù)測(cè)閾值由0.515 0提高到0.581 4,表明氨基酸替換為Thr后被糖基化的效率更高(表2)。另外RSGA還存在一個(gè)特殊的糖基化位點(diǎn)N121(Asn121-Pro122-Ser123),將其糖基化基序替換為Asn-Xaa-Thr形式,N-糖基化評(píng)估結(jié)果顯示,該位點(diǎn)由原先的非糖基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔稽c(diǎn)(表2)。RSGA模擬結(jié)構(gòu)顯示糖基化位點(diǎn)處于不同結(jié)構(gòu)域,N121位于不規(guī)則loop區(qū),N422位于催化結(jié)構(gòu)域的α-螺旋,N610則處于淀粉結(jié)合域(圖1)。

圖1 RSGA潛在糖基化位點(diǎn)Fig.1 The potential N-glycosylation sites presented in the modeled structure of RSGA注:實(shí)線框?yàn)榇呋Y(jié)構(gòu)域;虛線框?yàn)榈矸劢Y(jié)合域。

表2 RSGA糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of N-glycosylation sites in RSGA

2.2 突變體表達(dá)純化與糖基化分析

K.phaffii表達(dá)系統(tǒng)具有天然的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)[6],是蛋白異源表達(dá)的優(yōu)勢(shì)宿主之一[14]。通過定點(diǎn)誘變方式構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒9K-S123T、9K-S424T和9K-S612T,經(jīng)SalI線性化轉(zhuǎn)化至K.phaffii進(jìn)行糖基化修飾,獲得突變體S123T、S424T和S612T。由于K.phaffii表達(dá)的重組蛋白C端均融合有6×His標(biāo)簽,因此通過鎳親和層析完成重組蛋白的純化。N-糖基化在不同酶之間存在顯著差異可導(dǎo)致酶在SDS-PAGE上的蛋白條帶變化。使用去糖基化酶EndoH對(duì)純酶進(jìn)行處理,如SDS-PAGE分析所示,RSGA以及突變體條帶上方均出現(xiàn)不同程度的彌散現(xiàn)象,分為主條帶和彌散條帶(圖2)。通常情況下在主條帶上面存在彌散條帶意味著發(fā)生不均一的糖基化[15]。對(duì)于RSGA,EndoH去糖基化僅去除彌散條帶,不影響其主條帶的位置,主要發(fā)生異質(zhì)糖基化。EndoH處理前后,S424T和S612T顯示出與RSGA相同的蛋白帶模式。而突變體S123T糖基化效果顯著,經(jīng)Endo H處理后,很明顯由原先的兩條帶變成一條帶,且條帶大小與主條帶相近,表明該突變體發(fā)生異質(zhì)糖基化[16]。

圖2 糖基化突變體SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of RSGA and mutants

2.3 糖基化對(duì)酶的比酶活力的影響

前期研究中,通過組合突變?nèi)コ齊SGA存在的糖基化修飾,結(jié)果引起比酶活力的急劇下降[5],表明糖基化修飾對(duì)RSGA催化活性的重要性。將RSGA氨基酸序列中存在的Asn-Xaa-Ser糖基化基序替換為Asn-Xaa-Thr,能有效促進(jìn)其比酶活力的提高。以生玉米淀粉為底物,在40 ℃,pH 4.6條件下測(cè)定的突變體活性以及蛋白濃度結(jié)果如圖3-a所示。突變體S123T和S424T生淀粉酶活力分別是RSGA酶活力的1.25倍和1.02倍。此外,相同處理?xiàng)l件下,突變體S123T的蛋白表達(dá)量提高了9.3%。進(jìn)一步對(duì)突變體的比酶活力分析發(fā)現(xiàn),它們都有不同幅度的提高(圖3-b)。突變體S424T和S612T比酶活力較RSGA分別提高10%和5%。另外,引入的糖基化突變體S123T對(duì)生玉米淀粉的催化活性提高17%,這可能是由于淀粉鏈和附著在Asn121上的額外聚糖鏈之間的動(dòng)態(tài)相互作用,促進(jìn)了酶與底物之間的降解反應(yīng)。此外,將突變體在E.coliBL21(DE3)中表達(dá),排除殘基突變帶來的影響。對(duì)重組突變體酶的比酶活力進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn),突變體比酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì),表明在S123T、S424T和S612T的催化反應(yīng)中糖基化起積極作用,而不是殘基突變(圖3-b)。

a-RSGA及突變體酶活力和蛋白質(zhì)量濃度分析;b-RSGA及突變體在K.phaffii和E.coli表達(dá)后的比酶活力

2.4 糖基化對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響

已有研究表明,糖基化會(huì)影響酶的穩(wěn)定性。將纖維二糖水解酶中的糖基化位點(diǎn)Asn384突變后,該酶在62 ℃條件下失活速度加快[17],表明糖基化修飾對(duì)穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用。然而,在內(nèi)切葡聚糖酶的63位點(diǎn)引入Asn-Xaa-Thr糖基化基序后,酶的熱穩(wěn)定性降低[9]。因此,為進(jìn)一步明確優(yōu)化后糖基化位點(diǎn)對(duì)RSGA酶學(xué)性質(zhì)的影響,以可溶性淀粉為底物,測(cè)定RSGA和糖基化突變體的最適反應(yīng)溫度和在60 ℃下酶的穩(wěn)定性。首先分析突變體的最適反應(yīng)溫度,在不同反應(yīng)溫度下孵育10 min后測(cè)定酶活力(40～80 ℃)。結(jié)果如圖4-a所示,突變體S123T最適反應(yīng)溫度下降到60 ℃,低于Penicilliumoxalicum來源的生淀粉糖化酶的最適反應(yīng)溫度65 ℃[2]。最適反應(yīng)溫度的降低更加有利于RSGA在低于淀粉糊化溫度下降解生淀粉的應(yīng)用,一定程度上降低能源消耗。進(jìn)一步將RSGA與突變體純酶在60 ℃條件下處理2 h,每間隔30 min取樣并測(cè)定樣品的殘余酶活力。結(jié)果如圖4-b所示,突變體S612T在孵育60 min后仍保留64%的殘余酶活力,較RSGA的殘余酶活力提高14%,酶的穩(wěn)定性有所提高,這可能與糖基化的位點(diǎn)有關(guān)。突變體S612T是在Asn610位點(diǎn)處附著聚糖鏈,該位點(diǎn)處于淀粉結(jié)構(gòu)域柔性區(qū)域部分[5]。通常情況下,柔性區(qū)域內(nèi)的聚糖鏈可能會(huì)限制構(gòu)象空間,從而提高其穩(wěn)定性[18]。突變體S123T和S424T在孵育30 min后,酶的活性急劇下降,僅保留了35%,酶的熱穩(wěn)定性降低。不同位點(diǎn)糖基化修飾對(duì)酶產(chǎn)生的穩(wěn)定效果具有差異,以上結(jié)果與前期引入不同位點(diǎn)的糖基化修飾結(jié)果是一致的[10]。

a-RSGA及突變體最適反應(yīng)溫度;b-RSGA及突變體溫度穩(wěn)定性分析

2.5 糖基化對(duì)酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)是酶的基本特征常數(shù)之一,反應(yīng)酶與底物之間的催化效果。糖基化使蛋白特定氨基酸上增加了多糖鏈,兩者之間共價(jià)調(diào)節(jié)糖蛋白從而影響動(dòng)力學(xué)性質(zhì)[19],從而一定程度上增加了底物和蛋白之間的親和力,促進(jìn)酶與底物結(jié)合[20]。以生玉米淀粉為底物,在40 ℃,pH 4.6條件下考察了RSGA以及糖基化突變體在催化反應(yīng)效率方面的變化及差異。結(jié)果表明,S123T、S424T和S612T的kcat/Km值分別是RSGA值的1.31、1.29和1.15倍(表3)。雖然突變體S123T和S424T的kcat值有所降低,但從降低的Km值可以看出,3個(gè)突變體均顯著提高了對(duì)生玉米淀粉的親和力,與催化效率提升的趨勢(shì)是一致的,表明親和力是突變體催化效率提高的主要原因(表3)。殘基Asn121處于相對(duì)靈活的loop區(qū)域,這可能促進(jìn)活性位點(diǎn)上氨基酸的功能,其附著的聚糖鏈不可避免與淀粉鏈發(fā)生相互作用,從而促進(jìn)對(duì)生玉米淀粉的降解效率[10]。另外,RSGA結(jié)構(gòu)模型顯示,Asn422和Asn610分別位于酶的催化域和淀粉結(jié)合域(圖1)。Asn422位點(diǎn)的糖基化可能引入了與殘基的相互作用,有利于增強(qiáng)酶與底物之間的親和力[5]。淀粉結(jié)合域包含2組淀粉結(jié)合位點(diǎn)S1和S2,對(duì)生淀粉的結(jié)合具有重要作用,而糖基化位點(diǎn)Asn610更加靠近淀粉結(jié)合位點(diǎn),這可能使連接在Asn610上的聚糖鏈通過氫鍵相互作用促進(jìn)淀粉結(jié)合位點(diǎn)與生玉米淀粉的結(jié)合,從而提高酶與底物之間的催化效率[5]。

表3 RSGA及突變體動(dòng)力學(xué)分析Table 3 Kinetic parameters of RSGA and its mutants against raw corn starch

3 結(jié)論

生淀粉糖化酶作為可以在淀粉糊化溫度下降解生淀粉的水解酶,簡(jiǎn)化了淀粉糖生產(chǎn)工藝并降低能源消耗。本研究為提高A.fumigatus來源的RSGA對(duì)生玉米淀粉的催化效率,將RSGA氨基酸序列中3個(gè)含有Asn-Xaa-Ser糖基化基序替換為Asn-Xaa-Thr并利用NetNGlyc 1.0進(jìn)行糖基化評(píng)估。突變體在K.phaffii中完成糖基化并獲得突變體S123T、S424T和S612T。經(jīng)去糖基化酶EndoH處理及SDS-PAGE分析確定突變體均成功糖基化。在此基礎(chǔ)上研究了突變體S123T、S424T和S612T糖基化對(duì)催化活性、熱穩(wěn)定性以及酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。通過將糖基化基序中的Ser突變?yōu)門hr,突變體S123T、S424T和S612T對(duì)生玉米淀粉催化效率分別提高到RSGA的1.31、1.29和1.15倍。此外,突變體S123T引入新的糖基化使其表達(dá)量提高了9.3%,且最適反應(yīng)溫度從70 ℃降低到60 ℃。本研究通過RSGA的糖基化基序改造,有效提高了酶的催化效率,是一種改善酶催化效率的新策略。