采食赭曲霉毒素A 污染日糧豬只的可食用組織及生物體液中OTA 殘留比較

朱秋鳳 ，張一諾 ，王夢晨 （編譯）

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.禾豐食品股份有限公司，遼寧 沈陽 110164）

赭曲霉毒素A（OTA）是一組由曲霉菌（較溫暖地區(qū)）或青霉菌（較寒冷地區(qū)）等真菌產(chǎn)生的次級代謝有毒產(chǎn)物，廣泛污染多種農(nóng)作物（Peraica 等，1999；Marin 等，2009）。環(huán)境溫度和水分含量是造成谷物收獲和儲存期間OTA 污染的主要因素（Abramson等，1987）。早期研究已經(jīng)引起人們對OTA 污染農(nóng)作物、飼料以及人類和動物接觸該污染物的關(guān)注（Petzinger and Weidenbach 2002；Binder 等，2007；PfohlLeszkowicz和 Manderville2007；Amezequ 等，2009）。

過去幾十年文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示，在中歐和東南歐地區(qū)，OTA 分布、檢出率、陽性率和濃度存在季節(jié)性變化（Pepeljnjak 等，2008；Mili?evi?等，2009；Stoev 等，2012）。歐盟委員會2006/576/ EC（歐盟委員會2006）規(guī)定了動物飼料中OTA 最大限量。除了植物來源的飼料和食品外，OTA 也可能殘留在肉類和畜禽內(nèi)臟中，其出現(xiàn)是由于動物攝入OTA 污染的谷物和飼料導(dǎo)致的。人會通過多種途徑接觸OTA，其中之一是食用動物源性產(chǎn)品，如臘肉制品，這是一種傳遞效應(yīng)，即動物采食自然污染飼料后轉(zhuǎn)移（Pleadin 等，2013；Per?i 等，2014）。另一種途徑是臘肉制品在發(fā)酵過程中其表面的二次污染和霉菌生長（Amezequeta 等，2009；Pleadin 等，2013；Markov 等，2013；Pleadin 等，2015 a，b）。

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將OTA 列為2B 級人類致癌物。此外，OTA 可引起線粒體損傷和氧化應(yīng)激，刺激脂質(zhì)過氧化，干擾氧化磷酸化，可能出現(xiàn)腎毒性、神經(jīng)毒性、突變性、致畸性和免疫毒性（Mally和 Dekant，2005；Abrunhosa 等，2010；Gupta，2011）。多項研究表明，OTA 與巴爾干地區(qū)地方性腎病（巴爾干地方性腎?。┌l(fā)展有關(guān)（Castegnaro 2006；Mili?evi? 等，2009）。OTA 及其代謝物毒性作用取決于許多因素：如劑量、采食時間和采食途徑（Pfohl-Leszkowicz 和Manderville， 2007）。

研究顯示，豬只對OTA 特別敏感，毒素在腎臟富集量最高，其次是肝臟和肌肉組織，脂肪組織中最低（Gareis 和Scheuer， 2000；Lusky等，1993；Pietri 等，2006；Persi等，2014）。OTA 主要通過胃腸道吸收，易與血漿蛋白結(jié)合（導(dǎo)致其在體內(nèi)半衰期較長），而腎小球濾過率有限。OTA 通過轉(zhuǎn)運蛋白穿過腎小管膜，并通過尿液排出（Gareis和Scheuer，2000）。體內(nèi)重吸收作用減慢了其排泄速度，可能導(dǎo)致毒素在腎臟中累積，從而增加其毒性（Pfohl-Leszkowicz 和 Manderville，2007；Dietrich 等，2005）。

過去研究僅涉及部分組織或生物體液，本研究目的是比較豬只采食受OTA 污染飼料后各種可食用組織和生物體液中OTA 水平。本試驗中動物攝入OTA 量與可能自然發(fā)生的OTA 攝入水平相對應(yīng)。采用半定量免疫測定法（ELISA）和高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FD）測定豬只可食用組織和生物體液中OTA水平。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)及試劑

OTA 標(biāo) 準(zhǔn) 品 購 自Acros Organics（吉爾，比利時）。所有其他化學(xué)品均為分析純級，而所有溶劑均為高效液相色譜（HPLC）純級。標(biāo)準(zhǔn)溶液分別制備為濃度10 000 ng/mL 和 20 ng/mL 的水溶液和工作溶液。OTA 檢測采用R-Biopharm（Darmstadt，Germany） 公司生產(chǎn)的生產(chǎn)的“BRIDASCREEN?赭曲霉毒素A30/15”ELISA 試劑盒。該試劑盒包括一個96 孔OTA 包被反應(yīng)板，以及OTA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0、50、100、300、900 和1 800 ng/mL），偶聯(lián)物（過氧化物酶偶聯(lián)OTA），底物/顯色劑溶液（四甲基聯(lián)苯胺），終止液（1 mol/L），稀釋緩沖液和洗滌緩沖液（10 mM 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）。

用 于HPLC-FD 分 析 樣 品制備的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH=7.4±0.1）是通過在去礦化水（MilliQ 系 統(tǒng)，Millipore， 美國Milford）中溶解NaCl（8.0 g）、Na2HPO4（1.16 g）、KH2PO4（0.2 g）和KCl（0.2 g）來準(zhǔn)備的，定容獲得總體積為1 L 的緩沖液。OTA 洗脫采用甲醇/乙酸溶液（98 ∶2，體積比）。HPLC-FD 方法中使用的流動相由乙腈/水/異丙醇/乙酸溶液組成， 各組分比例為46 ∶46 ∶6 ∶2。用于OTA 測定的所有其他化學(xué)試劑和溶劑分別為分析級和HPLC 級。

1.2 動物飼養(yǎng)管理和樣本采集

試驗選用10 頭體重63 ～68 kg雜交品系（Zeger）小母豬。試驗分為2 組，試驗組為5 頭豬只在育肥期連續(xù)4 周（28 d）飼喂OTA 強(qiáng)化飼料（250 μg/kg 飼料）；其余5 頭豬只作為對照組，即未接觸OTA 的組。對照組和試驗組豬只在相同條件下飼養(yǎng)，每天采食相同飼料量和自由飲水。28 d 屠宰后，采集血液和尿液，以及肌肉、脂肪、腦、肝、腎、心、肺和脾組織?？偣矎?0 頭豬身上取到檢測樣本100 份。將所有樣本分別分成兩份，使用ELISA和HPLC-FD 方法進(jìn)行OTA 分析（共200 個子樣品，100 個來自試驗動物，100 個來自對照動物）。通過2 000×g 離心5 min 分離血清后，將所有樣品儲存在-20 ℃，用于OTA 分析。

1.3 ELISA 樣品制備

采用Per?i 等人（2012、2014）在早期研究中血清、尿液、肝、腎、腦、肺、心臟和脾臟樣本制備方法。

將1 g 肌肉和脂肪組織均質(zhì)樣品用6 mL 乙酸乙酯稀釋，充分混合30 s。然后使用振蕩器將樣品再搖15 min。加入0.5 mL 1 mol/L 的H3PO4，攪拌15 s，后再攪拌15 min。離心后，轉(zhuǎn)移上清液（乙酸乙酯層），加入6 mL 乙酸乙酯重復(fù)提取過程。隨后，將3mL 0.26 mol/L NaHCO3加入到組合的乙酸乙酯層中，然后在振蕩器上充分混合15 s，再旋轉(zhuǎn)攪拌15 min。離心后，轉(zhuǎn)移下相0.8 mL，在100℃水浴中加熱5 min。加熱后，輕搖樣品，冷卻至室溫，用0.2 mL 0.225 mol/L HCl 和1 mL 0.13 mol/L NaHCO3稀釋。用50 μL 制備的樣品進(jìn)行分析。

1.4 ELISA 法測定OTA

按照ELISA 試劑盒提供的說明進(jìn)行。使用ChemWell 2910 分析儀（Awareness Technology，Inc，美國），在450 nm 處測定溶液的吸光度。通過六點校準(zhǔn)曲線計算OTA 濃度。

1.5 HPLC-FD 樣品制備

5 g 勻漿后的樣品，加入1%碳酸氫鈉水溶液（7.5 mL），混合5 min。然后加入甲醇（17.5 mL），旋渦離心1 min，均質(zhì)30 min。將樣品離心后（10 min，3 500×g，室溫），加入己烷（10 mL）， 搖勻3 min后靜置分層，去除上層己烷層，重復(fù)提取過程。向樣品（5 mL）中加入0.4 mol/L AgNO3溶液（0.25 mL）并再次離心（10 min，3 500×g，室溫），通過免疫親和柱（5 mL，O c h r a p r e p?，R-B i o p h a r m，Glasgow，英國）固相萃取純化上清液。樣品的純化、洗脫和稀釋步驟按照先前描述方法進(jìn)行（Pleadin等，2013）。

1.6 HPLC-FD 法測定OTA

采用Per?i 等人（2014）研究的色譜分析的條件以及HPLC-FD方法。

2 分析方法的驗證

兩種分析方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）根據(jù)從對照組中取10 個特定材料樣品的平均值加上3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)差計算。通過用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（50 μg/L）添加每種材料的對照樣品（每個濃度水平重復(fù)三次），在三個不同水平（2.0、5.0和10.0 μg/kg）測定回收率，并根據(jù)強(qiáng)化水平用于驗證。對于每個基質(zhì)，回收值表示為在三個強(qiáng)化水平和所有重復(fù)中獲得的平均值。

3 統(tǒng)計分析

使 用Statistica Ver 6.1 軟 件（StatSoft Inc.1984-2003，Tulsa，OK，美國）對豬體重和通過ELISA和HPLC-FD 法測定的OTA 濃度進(jìn)行統(tǒng)計分析，并通過線性回歸確定相關(guān)系數(shù)（R2）。研究結(jié)果為兩種分析方法的平均OTA 濃度，統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性為95%（P= 0.05）。

4 結(jié)果與討論

本研究中使用分析方法驗證結(jié)果如表1 所示。ELISA 法測定OTA的LOD 值為0.15 ～1.54 μg/kg，LOQ 值 為0.20 ～2.11 μg/kg。HPLC-FD 測 定OTA 的LOD 和LOQ 范圍分別為0.10 ～0.36 μg/kg和0.15 ～0.42 μg/kg。分析兩種方法的LOD 和LOQ 值，在尿液中最低，肝臟中最高。ELISA 法回收率為82.3% ～92.4%，HPLC-FD 法回收率為86.3%～ 97.8%，有研究表明生物體液中回收率最高，內(nèi)臟樣品回收率最低。驗證結(jié)果表明，兩種方法均可靠、高效地測定不同生物材料中的OTA 含量。此外，ELISA 法測定的OTA 濃度與HPLCFD 法測定的OTA 濃度在在統(tǒng)計中均具有顯著相關(guān)性（P＜ 0.05），相關(guān)系數(shù)較高（R2=0.938 6）。

表1 ELISA 和HPLC-FD 法測定各樣品OTA 含量結(jié)果

本研究使用飼料中OTA 含量（250 μg OTA/kg）比歐盟委員會建議2006/576/EC（歐盟委員會2006）規(guī)定豬飼料最高值（50 μg OTA/kg）高5 倍。因此，本試驗動物所飼喂的飼料不符合推薦飼料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；但在克羅地亞地區(qū)，250 μg/kg 污染水平已經(jīng)確定為天然污染結(jié)果（Pepeljnjak 等，2008）。

動物體重相關(guān)數(shù)據(jù)分析顯示，對照組（92.0±1.55 kg）與試驗組（87.6±1.85 kg）的體重有顯著差異（P＜0.05）。Krogh 等人（1979）和Malaguti 等人（2005） 研究發(fā)現(xiàn)，飼喂OTA 飼料豬只體重會降低。Harvey 等（1994）研究表明，飼料中添加2 500 μg/kg OTA 會抑制動物生長。但Glavitis 和Vanyi（1995）研究提出，在飼料中添加濃度為200 μg/kg OTA 幾周后，由于水分滯留動物組織中，導(dǎo)致動物體重增加。

ELISA 和HPLC-FD 方法測定采食OTA 污染的飼糧后豬可食用組織和生物液中的平均OTA 濃度見表2。ELISA 和HPLC-FD 法測定的OTA 水平以及兩種方法測定的OTA濃度之間的相關(guān)性見圖1。

圖1 采食OTA 污染飼料后可食用豬組織和生物體液中OTA 含量比較

表2 采食OTA 污染飼糧后豬可食用組織和生物體液中OTA 平均濃度

豬只組織中腎臟中OTA 平均濃度最高，為13.87±1.41 μg/kg。在其他組織中OTA 濃度依次 為： 肺（10.47±1.97 μg/kg）、肝臟（7.28±1.75 μg/kg）、脾臟（4.81±0.99 μg/kg）、 肌肉組織（4.72±0.86 μg/kg）、 脂 肪 組 織（4.11±0.88 μg/kg）、 心 臟（3.71±1.09 μg/kg）和大腦（3.01±0.25 μg/kg）。對照組中OTA 濃度均低于所采用方法的LOD。

與反芻動物相比，豬只對OTA特別敏感，毒素在其腎臟中累積最多，其次是肝臟和肌肉，而豬只脂肪組織中OTA 積累最少（Gareis and Wolff 2000；Lusky 等，1993；Pietri 等，2006）。Rosi 等人（2006）研究采食200 μg/kg OTA 污染飼料后，豬只組織中OTA 含量分布與本研究相同，結(jié)果顯示豬只腎臟中OTA 濃度最高，為9.6±2.7 μg/kg，其次是肝臟，為6.3±1.7 μg/kg，肌肉組織為1.9±06 μg/kg， 脂肪組織最低為1.1±0.6 μg/kg。Dall'Astra 等人（2010 年）在對豬只進(jìn)行為期40 d 的OTA 處理（日劑量為0.68 mg，飼喂3.4 kg 添加OTA的商業(yè)飼料，以達(dá)到200 μg/kg）后，在肌肉組織（股二頭肌）中發(fā)現(xiàn)了類似OTA 濃度（2.21±0.78 μg/kg）。Lusky 等（1993） 以100 μg/kgOTA 處理飼料飼喂豬只90 d 后，豬只肝臟和肌肉組織中OTA 濃度分別為7.9 μg/kg 和2.7 μg/kg，但其研究結(jié)果顯示肺部OTA 濃度最高（16.2 μg/kg）。

本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果相 似（Lusky 等，1993；Rosi 等，2006；Dall'Asta 等，2010）。OTA殘留分布腎臟和肺部中最多，其次是肝臟、脾臟、肌肉組織、脂肪組織、心臟和大腦。PfohlLeszkowicz 和Manderville（2007 年）聲稱OTA 在不同組織中的濃度取決于采食OTA時間長短、OTA 劑量和攝入方式。

Lusky 等人（1995）研究顯示，在食用天然污染飼料的豬只血清、肝臟、腎臟和肌肉組織中，OTA 的濃度可能比飼喂純結(jié)晶物質(zhì)OTA的飼料的豬只高3 ～5 倍。在本研究中，采食第28 天（豬屠宰前），血清（4.77±1.57 μg/L） 和尿液（16.06±3.09 μg/L） 中OTA 濃度與對照組相比顯著增加。Per?i 等人（2012）研究表明，豬只采食28 d OTA 污染飼料后，在第15 天血清中OTA 濃度達(dá)到峰值（14.84 μg/L），而在采食第22 天后，OTA 濃度開始下降。可能是因為血液中OTA 含量與最容易累積OTA 組織（腎臟和肝臟）中OTA 含量水平達(dá)到平衡（Madsen 等，1982；Gareis and Scheuer，2000）。研究表明，OTA攝入量與其在生物體液中的濃度之間存在相關(guān)性。因此，生物體液中的OTA 測定可以作為OTA 監(jiān)測的快速工具（Pascale and Visconti 2008；Malaguti 等，2005；Per?i 等，2012）。

在克羅地亞殘留物監(jiān)測計劃和克羅地亞官方控制和監(jiān)測飼料國家計劃的組織下，以及在克羅地亞農(nóng)業(yè)部的主持下，對豬肝中OTA 含量進(jìn)行監(jiān)測。然而，法規(guī)并未規(guī)定最大允許水平，在克羅地亞，也沒有規(guī)定肉和肉制品中OTA 最高限量。在意大利，肉類和肉制品中OTA 的最大允許限量為1 μg/kg（意大利衛(wèi)生部，1999 年）。在丹麥，如果動物腎臟和肝臟中檢測到OTA 水平在10 ～20 μg/kg 之間，這些組織將被排除不被消費，而如果檢測到OTA 水平為25 μg/kg，則整頭豬不能生產(chǎn)或銷售（CFP/EFSA/FEEDAP/2009/01）。

5 結(jié)論

豬只采食被污染飼料后，其所含OTA 含量很可能顯著高于允許水平，會導(dǎo)致毒素在檢測組織中累積，并存在于生物體液中。檢測生物組織中OTA濃度遵循以下順序：尿液＞腎臟＞肺臟＞肝臟＞脾臟＞血清＞肌肉組織＞脂肪組織＞心臟＞大腦。飼喂受OTA 污染的飼料會導(dǎo)致OTA 在豬只可食用組織中蓄積。因此，本研究為當(dāng)局在屠宰端對動物胴體中有效的OTA 控制提供指南。這些會被肉類加工廠用作生產(chǎn)肉制品的原材料，因此應(yīng)特別注意OTA檢測。未來研究應(yīng)該集中在預(yù)防措施上，以避免飼料受到OTA 污染，以保護(hù)動物和人類健康并防止接觸到這種高毒性的霉菌毒素。

（ 原文題目：Comparison of ochratoxin A levels in edible pig tissues and in biological fluids after exposure to a contaminated diet

原 文 作 者：Jelka Pleadin,Nina Kudumija, Dragan Kova?evi?,Giampiero Scortichini, Salvatore Milone, Ivana Kmeti

原文出處：Mycotoxin Res （2016）32:145-151, DOI 10.1007/s12550-016-0249-7）