不同濃度補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖損傷的大鼠CTX-TNA2細(xì)胞系修復(fù)作用觀察

葉佳蓓，程建業(yè)，高雪亮，王凱，李普陽(yáng)，王召，趙亞鵬*

1 河北省中醫(yī)院針灸科，石家莊 050011；2 河北中醫(yī)學(xué)院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 河北省中醫(yī)院外四科

缺血性卒中在我國(guó)的發(fā)病率和患病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］，其中腦缺血再灌注（CI/R）損傷是影響缺血性卒中預(yù)后的重要病理生理過(guò)程，其導(dǎo)致的神經(jīng)損傷甚至有可能重于腦缺血造成的損傷［2］。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）處理是體外模擬CI/R 損傷較為合理的方式［3-5］，以此來(lái)進(jìn)行缺血性卒中離體層面的藥物及機(jī)制研究。出自《醫(yī)林改錯(cuò)》的補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療缺血性中風(fēng)病的經(jīng)典復(fù)方，主要包括黃芪、赤芍、當(dāng)歸、紅花、桃仁、川芎、地龍，其可通過(guò)保護(hù)線粒體、調(diào)控神經(jīng)元自噬與凋亡、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)及血管再生等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6-8］，我們也通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一點(diǎn)［9］。本研究中，我們將通過(guò)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系CTX-TNA2 建立OGD/R 模型模擬CI/R 損傷，探究離體情況下補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)CI/R損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：CTX-TNA2 細(xì)胞即大鼠腦Ⅰ型星形膠質(zhì)細(xì)胞，購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司（iCell Bioscience Inc， Shanghai）。試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素—鏈霉素（10，000 U/mL）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、胎牛血清、無(wú)糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液均購(gòu)自GIBICO 公司，MTS 試劑盒購(gòu)自Promega公司，LDH 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。儀器： 3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱、3131 型三氣培養(yǎng)箱和Varioskan LUX 型多功能微孔板讀數(shù)儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司，SW-CJ-ID 型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化公司，Primovert 型倒置相差顯微鏡購(gòu)自Carl Zeiss 公司，5702 型低溫離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，0.22 μm濾膜購(gòu)自Milipore公司。

1.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清和空白血清的制備 取30 只體質(zhì)量為230～240 g 的SD 雄性大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2016–0011，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（DWLL2020075），其中20只大鼠予補(bǔ)陽(yáng)還五湯凍干粉水溶液灌胃，補(bǔ)陽(yáng)還五湯凍干粉3.02 g /（kg· d）溶于2 mL/只的0.9%氯化鈉溶液中形成水溶液，另外10 只大鼠予2 mL/只的0.9%氯化鈉溶液灌胃，大鼠均連續(xù)灌胃7 d，最后1次灌胃后禁食水2 h，在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血并收集到促凝管中，全血常溫靜置15 min、4 ℃，2 500 r/min離心30 min，吸取上清，收集到一起離心混勻，56 ℃水浴30 min 滅活補(bǔ)體，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾除菌后存于-80 ℃冰箱。

1.3 CTX-TNA2 細(xì)胞分組、OGD/R 處理、補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清加入 CTX-TNA2 細(xì)胞以完全培養(yǎng)基（含有10% 胎牛血清和1% 青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基）、置于37 ℃ 74% N2+ 5% CO2+21% O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24～32小時(shí)當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行1∶2或1∶3傳代。將復(fù)蘇后傳代3～4 次且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CTXTNA2 細(xì)胞分為觀察組、血清組、模型組、正常組。其中正常組不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)；模型組棄去原培養(yǎng)基，用室溫預(yù)熱的PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞，吸盡PBS，加入不含糖、含鈣鎂的無(wú)糖培養(yǎng)基，并迅速置于37 ℃，含94% N2+ 5% CO2+ 1% O2的三氣培養(yǎng)箱中6 h 進(jìn)行缺氧缺糖，然后把無(wú)糖培養(yǎng)基全部更換為完全培養(yǎng)基，重新置于37 ℃ 74% N2+ 5% CO2+ 21% O2環(huán)境中進(jìn)行24 h 復(fù)氧復(fù)糖；觀察組和血清組細(xì)胞用上述方法進(jìn)行6 h缺氧缺糖處理，然后分別用含0.5%、1%、3%、5%和10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清（觀察1、2、3、4、5組）或0.5%、1%、3%、5%和10%空白血清（血清1、2、3、4、5 組）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行24 h 復(fù)氧復(fù)糖處理。

1.4 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 采用MTS 法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述各組細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入20 μL CellTiter 96水溶液試劑，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育50 min。在多功能微孔板讀數(shù)儀測(cè)定各孔490 nm 處的吸光度值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）。

1.5 細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率的檢測(cè) 采用LDH法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述各組細(xì)胞接種于96 孔板中，吸取各細(xì)胞孔的上清液加入到另一新的96孔板中加入LDH 試劑，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測(cè)450 nm 吸光度， 此為細(xì)胞上清中 LDH 釋放量；然后向原培養(yǎng)板中細(xì)胞加入1%Triton X-100，室溫反應(yīng)20 min 后取細(xì)胞反應(yīng)液及 LDH 工作液混勻，繼續(xù)在多功能微孔板讀數(shù)儀中測(cè)450 nm 吸光度，此為細(xì)胞破膜液 LDH 釋放量。LDH 漏出率（%）=上清 LDH 釋放量/（上清 LDH釋放量 + 細(xì)胞破膜液 LDH釋放量）×100%。

1.6 細(xì)胞形態(tài)和狀態(tài)的觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述各組細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下觀察其胞體狀態(tài)、突起形態(tài)及胞間連接情況，每組細(xì)胞采集3個(gè)視野的圖像留存。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以xˉ ± s 表示，滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)者，多樣本比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較采用Tukey 法；不滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)者，采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（Kruskal-WallisHTest）。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 觀察1、2、3、4、5 組細(xì)胞 存 活 率 分 別 為92.90% ± 5.77%、94.00% ±12.43%、98.80% ± 6.55%、101.50% ± 0.61%、94.40% ± 19.75%，血清1、2、3、4、5組細(xì)胞存活率分別為88.85% ± 0.06%、92.64% ± 4.43%、90.15% ±2.44%、82.98% ± 16.48%、86.75% ± 12.41%，模型組細(xì)胞存活率為79.25% ± 2.15%，

正常組細(xì)胞存活率為141.20% ± 4.78%。與正常組相比，模型組細(xì)胞存活率減低（P<0.01）。觀察3、4 組細(xì)胞存活率升高（P均<0.01）。與血清4組相比，觀察4組細(xì)胞存活率更高（P<0.01）。

2.2 各組乳酸脫氫酶漏出率比較 觀察1、2、3、4、5 組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率分別為26.06% ±3.31%、26.58% ± 2.94%、26.74% ± 2.67%、20.99% ± 2.48%、31.56% ± 2.42%，血清1、2、3、4、5 組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率分別為25.31% ±3.48%、26.31% ± 2.26%、27.06% ± 1.26%、27.56% ± 1.62%、29.31% ± 2.97%，模型組乳酸脫氫酶漏出率為29.62% ± 0.91%，正常組乳酸脫氫酶漏出率為0。與正常組相比，模型組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率增高（P<0.01）；與模型組相比，觀察組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率降低（P<0.01）；與血清4 組比較，觀察4組乳酸脫氫酶漏出率低（P<0.05）。

2.3 各組細(xì)胞形態(tài)比較 由上述結(jié)果可知5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清處理可對(duì)OGD/R 損傷后的細(xì)胞產(chǎn)生一定的修復(fù)作用，因此倒置相差顯微鏡重點(diǎn)觀察5%的補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清及5%的空白血清對(duì)OGD/RCTX-TNA2細(xì)胞的影響。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組細(xì)胞貼壁情況良好，細(xì)胞呈多角形、形態(tài)良好、胞膜光滑、胞體清晰，細(xì)胞排列較密集，細(xì)胞之間連接緊密；模型組細(xì)胞較正常組損傷嚴(yán)重，細(xì)胞胞體腫脹且狀態(tài)不佳、突起嚴(yán)重萎縮變形、胞質(zhì)分泌的顆粒樣物質(zhì)增多，細(xì)胞間連接斷裂嚴(yán)重甚至消失。經(jīng)過(guò)5%的補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清和空白血清干預(yù)后，細(xì)胞胞體形態(tài)較模型組有所恢復(fù)，胞質(zhì)分泌顆粒減少，胞間突起均較模型組有所增加。其中，與5%空白血清相比，5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清干預(yù)后細(xì)胞狀態(tài)的好轉(zhuǎn)情況更為明顯，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)更為清晰、顆粒明顯減少、突起萎縮及胞間連接顯著好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 CTX-TNA2細(xì)胞形態(tài)（×200）

3 討論

目前，已有大量研究從在體實(shí)驗(yàn)角度發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠減輕CI/R 損傷［8，10-11］，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)降低其興奮性氨基酸毒性、減輕炎癥反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)等機(jī)制參與此過(guò)程。因此，本研究選擇從離體層面重點(diǎn)探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，研究對(duì)象選取大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系即CTX-TNA2細(xì)胞。

中藥及復(fù)方的離體實(shí)驗(yàn)研究主要有以下三種藥物干預(yù)方式：中藥提取物直接添加、含藥血清添加和含藥血漿添加。單味中藥的有效單體成分多直接添加到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，而中藥復(fù)方若采取直接接觸細(xì)胞的方式，則會(huì)因?yàn)楸旧砗械碾s質(zhì)及滲透壓、酸堿度、鞣質(zhì)成分、無(wú)機(jī)鹽離子等非特異性理化因素影響到最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究中使用的補(bǔ)陽(yáng)還五湯通常是需要口服并經(jīng)吸收、代謝而起效，且鑒于含藥血清技術(shù)較為成熟、應(yīng)用廣泛，故采用補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清作為離體實(shí)驗(yàn)的干預(yù)方式。

血清藥理學(xué)是日本學(xué)者田代真一在20 世紀(jì)80年代提出的一研究中藥復(fù)方的體外實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，現(xiàn)已成為較為科學(xué)的、研究中藥藥效及作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)的方法。血清藥理學(xué)是指將單味中藥或中藥復(fù)方通過(guò)給動(dòng)物灌胃一定時(shí)間后收集動(dòng)物體內(nèi)血清即含藥血清，直接加入到離體反應(yīng)體系中進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)及機(jī)制研究。影響含藥血清藥效以及最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有很多，包括供體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、含藥血清的給藥劑量和方案、采血時(shí)間、血清滅活與保存以及對(duì)照設(shè)計(jì)等方面。本研究采用與CTX-TNA2 細(xì)胞同種屬的SD 大鼠作為供體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)制備含藥血清，以此來(lái)縮小動(dòng)物血清和動(dòng)物細(xì)胞之間的差異。在給藥劑量方面，為保證動(dòng)物連續(xù)灌胃給藥的一致性，課題組前期將補(bǔ)陽(yáng)還五湯水煎液統(tǒng)一制成凍干粉，經(jīng)臨床用藥量、動(dòng)物等效劑量系數(shù)（按體表面積）和凍干粉得粉率換算后確定3.02 g/（kg·d）為SD 大鼠給藥劑量、2 mL 為大鼠灌胃體積。同時(shí)有研究［12］表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯的含藥血清無(wú)明顯的量效依存關(guān)系，應(yīng)以臨床等效劑量為基準(zhǔn)。在給藥方案和采血方案上，根據(jù)大量文獻(xiàn)和本課題組前期研究，我們對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)7 d灌胃和最后一次灌胃后空腹2 h采血，以此達(dá)到含藥血清中血藥濃度的穩(wěn)定。在血清滅活方面，為減少血清中多種酶、抗體、補(bǔ)體等生物活性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究選擇同時(shí)滅活處理含藥血清和空白血清，滅活并不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，這樣更加突出含藥血清中補(bǔ)陽(yáng)還五湯的作用。在對(duì)照設(shè)計(jì)方面，本研究全程選擇經(jīng)相同灌胃和采血處理后得到的空白血清作為對(duì)照，使含藥血清組的結(jié)果更具可比性。另外，對(duì)于離體反應(yīng)體系中含藥血清的添加方式，我們將含藥血清視為一種外來(lái)添加物，選擇含藥血清和常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)血清并存的方法，即在復(fù)氧復(fù)糖10%胎牛血清基礎(chǔ)上額外添加不同體積分?jǐn)?shù)的含藥血清，雖然增加了細(xì)胞復(fù)氧復(fù)糖時(shí)的總血清含量，但是這種方式穩(wěn)定了細(xì)胞狀態(tài)，保證了所有細(xì)胞反應(yīng)體系的一致性，還能更好地模擬在體實(shí)驗(yàn)中的干預(yù)方式。

細(xì)胞存活率反映外源添加物質(zhì)對(duì)細(xì)胞活力和健康程度的影響，乳酸脫氫酶漏出率反映外源添加物質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，以此來(lái)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清抗CTX-TNA2 細(xì)胞OGD/R 損傷的最佳參考濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在完全培養(yǎng)基中加入5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清可顯著提高OGD/R 損傷的CTXTNA2 細(xì)胞存活率并降低其乳酸脫氫酶漏出率，而且優(yōu)于同濃度的空白血清。然后通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察正常組、模型組、觀察組和血清組的細(xì)胞胞體及突起情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清處理的細(xì)胞在OGD/R 損傷后恢復(fù)較好。因此，5%可作補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清減輕CTX-TNA2 細(xì)胞OGD/R損傷的參考濃度。

綜上所述，本研究通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)探究了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠CTX-TNA2細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清可修復(fù)CTX-TNA2 細(xì)胞OGD/R損傷。在此基礎(chǔ)上我們將對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯離體層面的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行深入研究，并在中藥復(fù)方血清藥理學(xué)應(yīng)用上進(jìn)行探索。