氫氣對MIRI 患者心肌細胞線粒體ROS 生成抑制和質量控制系統(tǒng)調控的作用及其機制研究進展

王家威，左越，宮哲軒，劉福林，劉彤彤

河北大學附屬醫(yī)院心臟外科，河北保定 071000

氫氣在很長的一段時間內(nèi)被認為是一種無功能的生物惰性氣體，對人體內(nèi)的生物活動不產(chǎn)生任何效應［1］。但是日本學者OHSAWA 等［2］在2007年的一項研究中發(fā)現(xiàn)氫氣在體外環(huán)境中可以選擇性地清除具有細胞毒性的活性氧（ROS）分子的現(xiàn)象，并且提出了氫氣選擇性抗氧化和細胞保護作用的新假說，使得氫氣的生物學意義被重新重視起來。心肌缺血再灌注損傷（MIRI）一直是急性心肌梗死（AMI）患者在冠脈復流后繼續(xù)造成心肌損傷的重要原因之一，近年來有研究表明線粒體活性氧（mROS）的產(chǎn)生［3］和線粒體功能障礙［4］是普遍存在于各類組織缺血再灌注損傷病理過程中的重要驅動因素。氫氣作為分子量最小的氣體，具有穩(wěn)定共價鍵的非極性分子，呈電中性，這些特性使得氫氣可以通過自由擴散的方式進入線粒體等亞細胞間隔參與分子活動［5］，從而抑制線粒體內(nèi)ROS 的生成，調控線粒體質量控制系統(tǒng)的穩(wěn)定，通過上述調控機制改善MIRI。現(xiàn)就氫氣對MIRI 患者心肌細胞線粒體ROS 生成抑制和線粒體質量控制系統(tǒng)調控的作用及其機制研究進展情況綜述如下。

1 氫氣對MIRI 患者心肌細胞線粒體ROS 生成抑制作用及其機制

氫氣對諸如羥自由基（·OH）在內(nèi)的ROS清除作用一直被認為是氫氣抑制細胞氧化應激的重要因素之一，但是氫氣直接清除ROS 的理論仍有局限。一方面外體外實驗中氫氣與ROS 中諸如·OH 的反應速度比谷胱甘肽、葡萄糖或其他生物分子的反應速度慢很多［6］；另一方面氫氣在對帕金森、內(nèi)風濕關節(jié)炎、肥胖和糖尿病等先天或慢性疾病某些方面的改善無法完全用清除ROS來解釋［7］。在哺乳動物的線粒體中，目前已發(fā)現(xiàn)了11個與底物氧化等有關的產(chǎn)生ROS 的位點［8］，其中大部分的ROS 來源于呼吸鏈（ETC）上的電子泄漏，而半醌（QH-）則被認為是其中的一個重要的紐帶，因為過量或者不適當?shù)禺a(chǎn)生QH-可能是超氧化物的主要來源之一［9-10］。對此，ISHIBASHI 等［7］提出了氫氣干預ROS 生成上游事件中的線粒體復合體催化中心的反應從而干預ROS生成行為的猜想。

1.1 抑制線粒體復合體Ⅰ中ROS 的生成 線粒體復合體Ⅰ又被稱為NADH-泛醌還原酶，是線粒體鏈上最大的膜蛋白復合體，是呼吸鏈的入口，主要由突入線粒體基質中的長臂和嵌入線粒體內(nèi)膜上的橫臂兩部分組成，其主要作用是將電子從NADH 傳遞到偶聯(lián)的輔酶Q（即泛醌），同時將H+從線粒體的基質側泵入膜間隙側［11］。線粒體復合體Ⅰ在生物學上與［NiFe］-氫酶有著密切的關系，［NiFe］-氫酶的功能是催化質子的可逆轉化，使微生物能夠將氫氣作為能源進行生命活動［12］，也因此線粒體復合體Ⅰ被認為擁有一些氫酶的性質。復合體Ⅰ按照功能分類為：長臂遠端的N 模塊、長臂近端對接到橫臂上的Q模塊以及橫臂上的近端泵模塊（PP）和遠端泵模塊（PD）；其中，Q 模塊將N 模塊氧化NAPDH 產(chǎn)生的電子經(jīng)泛醌結合位點（IQ）傳遞給線粒體膜間隙中的泛醌，生成二氫泛醌（QH2）或QH-（介于泛醌和二氫泛醌之間的中間體）［13］。在哺乳動物的線粒體復合體Ⅰ中，Q 模塊中的IQ被認為是氫氣抑制復合體Ⅰ中ROS的生成的關鍵位點，氫氣在IQ通過QH-的影響活化，與附近的堿和酸性氨基酸發(fā)生協(xié)同反應，裂解成質子和電子（類似于［NiFe］-氫酶中氫氣裂解反應過程中的情況7］），其中電子逆向通過Q 模塊轉移至N模塊，以自由基的形式還原氧化的FMN（和/或將NAD + 還原為NADH），質子則通過正向轉移將QH-還原為QH2，避免了產(chǎn)生ROS的有害電子泄露［7］。

1.2 抑制線粒體復合體Ⅲ中ROS 的生成 與復合體Ⅰ的結構不同，哺乳動物的復合體Ⅲ的結構是一個對稱的二聚體，每個單體有11 個亞基，其中具有催化活性的亞基是細胞色素b（包括高電勢bH和低電勢bL）、細胞色素c1和被鐵硫蛋白包裹的高電勢FeS 輔基［14］，復合體Ⅲ主要作用是通過Q 循環(huán)將來自線粒體復合物Ⅰ和Ⅱ的電子轉移至復合體Ⅳ［15］。對比較為復雜機制不明確復合物Ⅰ，復合物Ⅲ產(chǎn)生ROS 的機制早已經(jīng)有了被大眾所信服的解釋：復合體Ⅲ在通過Q 循環(huán)傳遞電子的過程中，QH2氧化位點（Qo）上產(chǎn)生的攜帶單電子的不穩(wěn)定QH-可以在復合物Ⅲ中自由移動，直接將單電子傳遞給O2，并通過非酶反應形成ROS（一方面，缺血期低氧誘導半醌將電子傳遞給O2，另一方面，再灌注期大量進入線粒體中，這兩方面的因素共同促進了有害ROS 的產(chǎn)生［7］。比如QUINLAN 等［16］發(fā)現(xiàn)，抗霉素A 可以特異性地阻斷復合體Ⅲ的泛醌還原位點（QI），導致Qo位QH-上的電子停滯，從而與O2反應生成ROS；而豆蔻素和霉唑作為Qo位點的特異性抑制劑，可以阻斷QH2與Qo位點的結合，阻止電子向復合體Ⅲ的轉移，從而阻止復合體Ⅲ中ROS 的產(chǎn)生。這一其具體的機制可能是由于阻斷了從Q 循環(huán)中生成QH-的電子轉移［17］，更加佐證了上述的解釋。因此，雖然復合體Ⅲ與［NiFe］-氫酶并沒有太大的聯(lián)系，但是目前的研究證據(jù)可以說明氫氣干預復合體Ⅲ中ROS 產(chǎn)生的可能機制：即氫氣可能直接與Qo位上的不穩(wěn)定QH-發(fā)生非酶促反應，從而抑制超氧化物的產(chǎn)生。

總之，在Toru Ishibashi提出的假設描述中，氫氣可能同時作為氧化劑和還原劑，在產(chǎn)生ROS 的關鍵位點活化，通過將質子傳遞給包括QH-在內(nèi)的泛醌物種或是將電子沿電子轉移途徑逆向傳遞給ETC上游的電子供體，阻止ROS 產(chǎn)生位點兩個方向上的電子流動，從而防止在缺血再灌注損傷的情況下ETC 過早泄漏產(chǎn)生ROS 的有害電子，進入大量有害ROS產(chǎn)生的惡性循環(huán)中［7］。

2 氫氣對MIRI 患者心肌細胞線粒體質量控制系統(tǒng)調控的作用及其機制

在機體內(nèi)，每個細胞中的全部線粒體構成了一個動態(tài)的網(wǎng)絡，并由“線粒體質量控制系統(tǒng)”去調控，該系統(tǒng)是通過線粒體的融合、分裂、自噬、線粒體生物發(fā)生和線粒體未折疊蛋白反應等方式維持細胞內(nèi)線粒體數(shù)量和質量相對穩(wěn)定的復雜動態(tài)生理過程［18］。有關氫氣干預線粒體質量控制系統(tǒng)的研究目前主要集中在以下幾個方面：調控PINK1/Parkin 信號 通 路［19］、Drp1 和Mfn2 信號 通 路［20］、FUNDC-1 通路［21］、未折疊蛋白反應［22］、激活PGC-α 促進線粒體生物發(fā)生［23］。

2.1 調控PINK1/Parkin 和FUNDC-1 介導的線粒體自噬途徑 PINK1/Parkin 途徑和FUNDC-1 途徑都屬于線粒體自噬途徑。線粒體自噬是一種選擇性的自噬，是細胞內(nèi)的自噬小體精準的識別衰老或受損的線粒體，并向其運送至溶酶體內(nèi)清除的過程，從而防止諸如缺血再灌注損傷的病理過程中的線粒體誘導的細胞凋亡的進展，維持心肌細胞的能量平衡及存活。

有關線粒體自噬的機制，目前研究最多的就是PINK1/Parkin 途徑。在正常細胞內(nèi)，PINK1 定位于線粒體外膜（OMM），然后經(jīng)線粒體轉位膜復合物轉移至線粒體內(nèi)膜（IMM），被內(nèi)膜上的基質加工肽酶（Mpp）和早老素相關的菱形蛋白（Parl）迅速降解；然而，當線粒體在應激狀態(tài)下時，線粒體膜電位的降低通過影響Mpp 和Parl 以及轉位蛋白的活性來干擾PINK1 的轉運和降解，導致PINK1 前體在OMM 上積累［24］。積累的PINK1通過招募并磷酸化Parkin 進而使包括線粒體rho GTPase 1（Miro1）、線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2）和電壓依賴性陰離子通道（VDAC1）在內(nèi)的線粒體自噬蛋白經(jīng)過泛素化而激活［25］；另外，PINK1 也可以直接磷酸化TANK 結合蛋白1（TBK1），進而進一步激活其他線粒體自噬受體，比如核點蛋白（NDP52）、p62和視神經(jīng)磷酸酶（OPTN）。所有這些受體含有微管蛋白1 輕鏈3（LC3）相互作用區(qū)（LIR 模體）和泛素相互作用區(qū)，可以促進泛素化的線粒體和自噬小體之間的融合，從而清除功能障礙的線粒體18］。目前，普遍認為在缺血期時增強量均有所提升，而在沉默PINK1基因后，氫氣對缺血再灌注損傷的保護作用受到了逆轉［26］。在另一項研究［19］中發(fā)現(xiàn)了氫可以通過促進線粒體自噬活性，增強PINK1、Parkin 和VDAC 的表達，促進Lc3-I向Lc3-II 的轉化，降低p62 的表達，從而改善內(nèi)毒素刺激后線粒體功能障礙。

FUNDC-1 途徑也是線粒體自噬途徑中的一員，F(xiàn)un14 結構域蛋白1（Fundc1）是一種具有3 個跨膜結構域的OMM蛋白。在低氧等應激條件的誘導下，F(xiàn)undc1 介導的線粒體自噬主要通過磷酸化（或去磷酸化）修飾來激活。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個磷酸化位點：Tyr18、Ser13 和Ser17；Ser13 和Tyr18 的磷酸化抑制Fundc1-LC3 的相互作用和隨后的線粒體自噬，而Ser17的磷酸化會增強線粒體自噬18］。正常的細胞環(huán)境中，F(xiàn)UNDC-1 介導的自噬會被Tyr18 的磷酸化所抑制［27］；而在缺血再灌注損傷中，這種抑制的作用會減弱，從而使FUNDC-1 發(fā)揮其誘導自噬的作用。在氫氣干預下，敗血癥模型中小鼠肝臟細胞內(nèi)的p-18-Fundc1 蛋白的含量相較于沒有氫氣干預的模型組會更明顯的減少，同時氫氣也會促進FUNDC-1 與LC3 的相互作用，增強原本受到抑制的FUNDC-1介導的自噬［21］。

另外，同屬于線粒體自噬途徑的BNIP3/NIX 途徑及其所屬的BCL-2家族在細胞凋亡的機制中已經(jīng)有了較為全面的研究，氫氣的干預機制也有了比較多的探討，但是目前仍沒有關于氫氣干預BNIP3/NIX途徑的相關報道。

2.2 調控Drp1 介導的線粒體分裂 線粒體膜電位對線粒體功能的維持有著非常重要的意義，在細胞缺氧或應激的過程中，線粒體膜電位的下降會導致線粒體功能障礙，而氫氣處理可以通過增加線粒體膜電位來改善線粒體功能［19］，其機制可能使通過線粒體分裂來控制的。線粒體分裂則可以產(chǎn)生新的線粒體，允許線粒體的重新分布，并促進受損線粒體的分離。線粒體的分裂是一個不對稱的過程，它使分裂后的其中一個子體線粒體具有高膜電位，并很快重新融合到細胞內(nèi)線粒體網(wǎng)絡中，而另一個子體線粒體具有低膜電位，通常經(jīng)過PINK1/Parkin 線粒體自噬途徑清除［28］。適當?shù)木€粒體分裂產(chǎn)生許多子線粒體，正如前文所說，部分子線粒體繼續(xù)參與進細胞內(nèi)的線粒體網(wǎng)絡為心肌細胞提供ATP，其他的子線粒體以線粒體自噬的方式清除。在缺乏Drp1 基因的個體中，發(fā)現(xiàn)了線粒體呼吸功能受損，線粒體吞噬功能受到抑制，線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放的易感性增加，以及細胞凋亡率或壞死率增加的現(xiàn)象，但是在基線水平上，Drp1 的過表達又會誘導線粒體功能障礙和心肌細胞的凋亡［29］。因此Drp1 在MIRI的過程中扮演的角色仍然不明確，是否加重或改善心臟再灌注損傷及其可能的機制仍需進一步研究。有意思的是在肺膿毒癥的模型中，氫氣干預后Drp1的表達量水平較模型組明顯的下降，但是與對照組的差距卻并不明顯［20］，這表明氫氣可能是在一定程度上逆轉缺氧應激帶來的過度的有害線粒體分裂，以維持在正常生理環(huán)境的水平來減輕細胞的損傷。

2.3 調控Mfn2途徑介導的線粒體融合 線粒體融合使線粒體內(nèi)物質能夠在線粒體之間交換，與線粒體分裂和自噬一起清理受到損害、老化的線粒體，保證細胞內(nèi)線粒體本身的穩(wěn)定以保證細胞功能的正常運轉。線粒體融合是由神經(jīng)營養(yǎng)因子1（OPA1）、線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2）3 種蛋白同時作用的過程，其中Mfn1 和Mfn2 分別誘導IMM 和OMM 的融合［30］。目前有關氫氣干預線粒體融合途徑的報道較少，但是DONG 等［20］發(fā)現(xiàn)，在肺膿毒癥的模型中，氫氣干預后Mfn2 的表達水平與正常的組織沒有明顯的差別，但相較于模型組卻有著明顯的提升。這表明，在膿毒癥存在的情況下，氫處理可以使Mfn2 的水平維持在正常的范圍以促進線粒體的融合，從而減輕應激損傷導致的細胞凋亡。但是除了其介導線粒體融合的作用外，Mfn2 還有著其他的作用，比如作為Parkin的線粒體受體介導心肌細胞的線粒體自噬［31］。目前Mfn1/2 在心臟缺血再灌注損傷中的作用引起了激烈的爭論，因為無論其表達量的增多還是減少都能在一定程度上提供心臟的保護，氫氣在這一機制中的作用也不明確，可能是通過線粒體融合或是線粒體自噬這兩種方式減輕心肌細胞的損傷，目前只能說為氫氣干預MIRI的研究提供了一條新的方向［18］。

2.4 調控線粒體未折疊蛋白反應 線粒體未折疊蛋白反應（UPRmt）是在諸如氧化應激、缺血再灌注損傷、線粒體DNA 或代謝功能受損、以及線粒體蛋白平衡紊亂這些應激環(huán)境下，促進線粒體伴侶蛋白和蛋白水解酶的表達，從而恢復線粒體蛋白穩(wěn)定的過程，是屬于線粒體質量控制的一員［32］。目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中一共有3個轉錄因子參與了線粒體未折疊蛋白反應的過程，它們包括ATF5、ATF4 和CHOP，但是沒有直接的證據(jù)證明氫氣可以通過上述幾種轉錄因子激活線粒體未折疊蛋白反應。SOBUE 等［22］發(fā)現(xiàn)，氫氣可以使組蛋白H3K27去甲基酶或染色質重組，隨后通過H3K27 或H3K9 甲基化狀態(tài)的改變而激活線粒體未折疊蛋白反應，這提示了氫氣可能通過其他的途徑來激活線粒體未折疊蛋白反應的通路；同時他們也給出了一個后續(xù)的方向，即氫氣可能通過使JMJD3（一種H3K27去甲基酶）表達的上調來激活線粒體未折疊蛋白反應。

2.5 調控線粒體生物發(fā)生 線粒體生物發(fā)生是一種建立在線粒體分裂、生長和增值基礎上的線粒體數(shù)量增多的過程，是線粒體周轉的一種再生機制，其主要目的是為了及時補充細胞內(nèi)線粒體的數(shù)量以提供充足的能量滿足細胞活動。線粒體生物發(fā)生是一個復雜的過程，需要核基因組與線粒體基因組的緊密配合，它們分別轉錄各自對應的線粒體蛋白質以促進線粒體生物發(fā)生的進展，以提高線粒體的質量水平。核基因組中編碼的線粒體蛋白的表達受轉錄因子和轉錄共激活因子的調控，其中研究最廣泛的與線粒體生物發(fā)生相關的轉錄輔助激活因子是PGC-1α，它可以激活如核呼吸因子NRFs（包括Nrf1和Nrf2），以及雌激素相關受體（Err）家族蛋白在內(nèi)的各種轉錄因子［33］。NRFs 主要參與線粒體呼吸亞基和線粒體轉錄因子的表達，其中轉錄因子包括線粒體轉錄因子A（TFAM）和轉錄因子B（TFBM）［34］。在缺氧等應激條件下，PGC-1α、Nrf2和TFAM的表達水平升高，而氫氣處理進一步增加了這些蛋白的表達水平［35］，這說明氫氣可以在一定程度上增強線粒體生物發(fā)生，增加細胞中正常功能線粒體的數(shù)量，緩解應激造成的線粒體功能障礙，但是其詳細的作用機制仍然不明，可能是在上游階段促進PGC-1α 的磷酸化和去乙?；瘉砑せ钕掠蔚男盘柾贰?/p>

綜上所述，氫氣除了通過清除ROS 來緩解氧化應激的作用之外，也可能直接干預線粒體產(chǎn)生致病性ROS 的上游階段，選擇性的抑制缺血再灌注損傷過程中的額外ROS 產(chǎn)生來減輕氧化應激的影響［7］。除此之外，線粒體質量控制系統(tǒng)是最近提出來的一個新概念，其系統(tǒng)的失衡被認為是導致MIRI的一個重要的影響因素［4］。有不少報道都提出了氫氣參與在應激或是缺氧條件下線粒體質量控制系統(tǒng)自我調控的過程，通過PINK1/Parkin 信號通路、Drp1 和Mfn2信號通路、FUNDC-1通路、未折疊蛋白反應、激活PGC-α 促進線粒體生物發(fā)生等方式改善MIRI，這一過程從結果來看是有益的，但是其具體的分子機制仍然不明確；線粒體質量控制系統(tǒng)的調控是復雜的動態(tài)生理過程，各路徑之間也有著相互的影響，闡明氫氣在參與線粒體質量控制系統(tǒng)調控的具體作用機制是可能一個未來研究的重點方向。