PLCL2基因多態(tài)性觀察及其與大動脈粥樣硬化型腦梗死發(fā)病關(guān)系分析

王曉蓓，謝孟岐，劉梽潁，吳勤奮，張明洋，楊新玲

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新疆神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830063；2 新疆醫(yī)科大學(xué)

缺血性腦卒中是由于腦血管動脈粥樣硬化和腦血栓、腦栓塞等導(dǎo)致腦動脈狹窄或堵塞，引起腦血流減少，最終引發(fā)供血部位腦組織缺血、缺氧的急性腦功能障礙的疾病［1］。大動脈粥樣硬化（LAA）型腦梗死是缺血性腦卒中常見的發(fā)病類型，病情嚴(yán)重，預(yù)后較差，約有3/4 患者不同程度喪失勞動力或生活不能自理，給社會及家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。LAA 型腦梗死是多種因素共同作用的結(jié)果，動脈粥樣硬化是其主要病理過程，目前發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［3］。磷脂酰肌醇特異的磷酸酯酶2（PLCL2）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，可以增強(qiáng)γ-氨基丁酸的受體結(jié)合活性，參與B 細(xì)胞激活、γ-氨基丁酸信號通路和B 細(xì)胞受體信號通路的負(fù)調(diào)控［4-5］。PLCL2可間接引起CRP、IL-6 分泌水平升高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)并加速血管動脈粥樣硬化，在 LAA 型腦梗死的發(fā)生發(fā)展中可能起作用［6］。既往研究發(fā)現(xiàn)，PLCL2基因多態(tài)性與心肌梗死、缺血性腦卒中、代謝綜合征的發(fā)生有關(guān)系，但其與LAA 型腦梗死的關(guān)系仍未明確。本研究收集新疆地區(qū)LAA 型腦梗死患者及體檢健康人群的血液樣本分析PLCL2基因4個(gè)SNPs 位點(diǎn)（依據(jù)目的基因位點(diǎn)要有潛在功能，并且位于內(nèi)含子、啟動子、5'UTR 區(qū)域的標(biāo)簽位點(diǎn)，最后通過綜合考慮SNP 位點(diǎn)所在的功能區(qū)、功能預(yù)測結(jié)合已有研究文獻(xiàn)），即PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 的基因多態(tài)性，并進(jìn)一步探討PLCL2基因多態(tài)性與LAA型腦梗死的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021 年7 月—2022 年7 月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院診斷為LAA 型腦梗死患者105 例（病例組），均符合腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)臨床、頭部CT及頭部MRI掃描證實(shí)，且經(jīng)頸動脈B超 + 頭顱磁共振血管造影、頭 + 頸部CT血管造影或腦數(shù)字剪影血管造影等證實(shí)腦血管的主干或分支>50%以上的狹窄或閉塞，推測源于動脈硬化，在供血區(qū)內(nèi)發(fā)生急性腦梗死，直徑大于1.5 cm，TOAST 分型為 LAA 型；排除多臟器功能不全、風(fēng)濕免疫性疾病、感染性疾病。病例組中男65 例、女40例，年齡 40~75（63.18 ± 12.97）歲；神經(jīng)功能缺損評分（NIHSS評分） 4～40分，其中合并有吸煙史36例、飲酒史26 例、糖尿病史46例、高血壓史86例。對照組為本院同一時(shí)期年齡、性別、族別與病例組相匹配體檢健康人群103例， 排除腦血管病、風(fēng)濕免疫性疾病以及近2 周內(nèi)發(fā)生過炎性病變的人群，其中男52例、女51 例，年齡45~72（61.24 ± 11.04）歲，其中合并吸煙史23 例、飲酒史20 例、糖尿病史26 例、高血壓史66 例。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均對多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測知情同意。

1.2 PLCL2 基因多態(tài)性分析 采集兩組入院外周靜脈血2.0 mL，以EDTA 抗凝，用磁珠法全血 DNA提取試劑盒 （中科拜爾）抽取DNA放置于–80 °C保存?；陲w行質(zhì)譜的分型技術(shù)（massarray SNP）針對PLCL2 rs2014490、rs9824172 rs4685423、rs4618210 SNP 位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，采用Agena 公司的Assay Designer4.0 軟件進(jìn)行多重SNP 位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)評估，引物序列見表1，由北京博淼生物科技有限公司設(shè)計(jì)。

表1 PLCL2基因多態(tài)性位點(diǎn)引物和PCR序列

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)步驟：取1.5 mL EP 管中配制PCR master mix，并振蕩低速離心；每個(gè)加樣孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL 模板DNA（20 ng/μL）混勻，1 000 r/min 離心1 min。PCR 循環(huán)：94 ℃ 5 min（1 個(gè)循環(huán)），94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（45 個(gè)循環(huán)），72 ℃ 3 min（1 個(gè)循環(huán)），4 ℃∝，在PCR 反應(yīng)結(jié)束后，將PCR 產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶 （SAP）處理，以去除體系中游離的dNTPs。在新1.5 mL EP 管中配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液，將SAP mix 加入384 孔PCR 反應(yīng)板，反應(yīng)總體積為7 μL，其中PCR 產(chǎn)物5 μL，SAP mix 2 μL。瞬時(shí)離心后進(jìn)行如下反應(yīng)程序：37 ℃、20 min， 85 ℃、5 min，4 ℃∝，并將384 孔反應(yīng)板放置于PCR 儀上進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。待檢測SNP基因型互補(bǔ)的單堿基延伸產(chǎn)物進(jìn)行樹脂純化，樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至點(diǎn)樣儀上進(jìn)行質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)輸出。將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP 芯片使用MALDI-TOF 質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性，將結(jié)果保存并分析數(shù)據(jù)。

對病例組、對照組PLCL2 基因分布進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，采用頻數(shù)計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)受檢人 群 PLCL2 rs2014490、rs9824172 rs4685423、rs4618210 位點(diǎn)上的基因型頻率；根據(jù)基因型頻率推算等位基因頻率，并將推算得到的等位基因頻率與對照組基因頻率的分布進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，若超過1/4 單元格的理論頻數(shù)均<5，則采用Fisher's 精確概率法?；谶z傳模型（共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型），使用非條件 Logistics 回歸模型分析PLCL2 基 因 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210位點(diǎn)多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)，其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度以比值比（OR）及95%置信區(qū)間（CI） 表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，PLCL2 rs2014490 位點(diǎn)GG、AG、AA 基因型在受檢人群中的實(shí)際頻數(shù)為52、97、56 例，計(jì)算得到3 種基因型 理 論 頻 數(shù) 為53.32、102.24、49.22 例，PLCL2 rs2014490 位點(diǎn)上各基因型的實(shí)際頻數(shù)和理論頻數(shù)的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.599，P=0.741>0.05）。PLCL2 rs9824172 位點(diǎn)GG、GT、TT基因型在受檢人群中的實(shí)際頻數(shù)為53、94、61 例，計(jì)算得到3種基因型理論頻數(shù)為52、93.6、60.32 例，PLCL2 rs9824172 位點(diǎn)上各基因型的實(shí)際頻數(shù)和理論頻數(shù)的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.008，P=0.996>0.05）。PLCL2 rs4685423位點(diǎn)AA、CA、CC基因型在研究對象中的實(shí)際頻數(shù)為54、89、62 例，計(jì)算得到3種 基因型 理論頻 數(shù)為47.97、102.34、55.43 例，PLCL2 rs4685423 位點(diǎn)上各基因型的實(shí)際頻數(shù)和理論頻數(shù)的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.657，P=0.437>0.05）。PLCL2 rs4618210 位點(diǎn)AA、GA、GG基因型在研究對象中實(shí)際頻數(shù)為39、94、66例，計(jì)算得到3 種基因型理論頻數(shù)為36.80、97.55、64.66 例，PLCL2 rs4618210 位點(diǎn)上各基因型的實(shí)際頻數(shù)和理論頻數(shù)的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.141，P=0.932>0.05） 。 說 明 PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210位點(diǎn)達(dá)到遺傳平衡，本研究中選取的樣本群體對LAA型腦梗死患者具有群體代表性。

2.1 兩組PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 基因型頻率、等位基因頻率比較 PLCL2 rs2014490位點(diǎn)基因型為GG、AG、AA，在病例組中占比分別為29.1%、42.7%、28.2%，對照組中分別為21.5%、52%、26.5%；病例組等位基因G、A 基因頻率占比分別為50.5%、49.5%，對照組分別為47.5%、52.5%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2分 別 為2.13、0.35，P均>0.05。 PLCL2 rs9824172位點(diǎn)基因型為GG、GT、TT，在病例組中占比分別為26.7%、40%、33.3%，對照組中分別為24.3%、50.5%、25.2%；病例組中等位基因G、T頻率占比分別為46.7%、53.3%，對照組分別為49.5%、50.5%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2值分別為2.54、0.34，P均>0.05。PLCL2 rs4685423 位點(diǎn)基因型為AA、CA、CC，在病例組中占比分別為28.8%、35.6%、35.6%，對照組中分別為23.8%、51.5%、24.7%；病例組等位基因A、C 頻率占比分別為46.6%、53.4%，對照組分別為49.5%、50.5%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2分別為5.48、0.34，P均>0.05。PLCL2 rs4618210位點(diǎn)基因型為AA、GA、GG，在病例組中占比分別為16.7%、49%、34.3%，對照組分別為22.68%、45.36%、31.96%；病例組等位基因A、G 頻率占比分別為41.2%、58.8%，對照組分別為45.4%、54.6%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2值分別為1.14、0.70，P均>0.05。

2.2 PLCL2 基因的 4 個(gè) SNPs 與LAA 型腦梗死的關(guān)系 PLCL2 基因rs2014490 位點(diǎn)，A 是野生型基因、G 是突變型基因，共顯性模型： GG vs.AA 和GT vs.AA；顯性模型：AG + GG vs.AA，隱性模型：AA +AG vs.GG；超顯性模型：AA + GG vs.AG?；诠诧@性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結(jié)果顯示，PLCL2 基因rs2014490 位點(diǎn)與LAA 型腦梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs9824172位點(diǎn)，T是野生型基因、G是突變型基因，共顯性模型：GG vs.TT 和GT vs.TT；顯性模型：GT + GG vs.TT；隱性模型：TT + TG vs.GG；超顯性模型：TT + GG vs.TG。基于共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結(jié)果顯示，PLCL2 基因rs9824172 位點(diǎn)與LAA 型腦梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs4685423位點(diǎn)，C是野生型基因、A是突變型基因，共顯性模型：AA vs.CC 和CA vs.CC；顯性模型：CA + AA vs.CC；隱性模型：CC + CA vs.AA；超顯性模型：CC + AA vs.AC。基于超顯性模型的分析結(jié)果顯示，PLCL2 基因rs4685423 位點(diǎn)與LAA 型腦梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性（OR=0.52，95%CI0.30～0.91，P<0.05）；基于其他遺傳模型的分析結(jié)果顯示，rs4685423位點(diǎn)與LAA型腦梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs4618210位點(diǎn)，G是野生型基因、A是突變型基因，共顯性模型：AA vs.GG 和GA vs.GG；顯性模型：GA + AA vs.GG；隱性模型：GA +GG vs.AA；超顯性模型：GG + AA vs.GA?；诠诧@性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結(jié)果顯示，PLCL2 基因rs4618210 位點(diǎn)與LAA 型腦梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P均>0.05）。

3 討論

LAA 型腦梗死是多個(gè)基因與環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，越來越多的研究表明，危險(xiǎn)因素與基因多態(tài)性的交互作用對疾病的發(fā)生具有協(xié)同效應(yīng)［7-10］。SNP分析已經(jīng)被廣泛用于篩查腦梗死疾病易感基因位點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)許多腦梗死的易感基因，如ZNF260 基因 rs34550124 多態(tài)性可能影響缺血性腦卒發(fā)生過程，并可能通過影響缺血性腦卒中患者的血壓、血糖及凝血功能而導(dǎo)致臨床癥狀不同［11］。LPL rs264 位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與老年高血壓患者LAA型腦梗死的發(fā)病相關(guān)［12］。PLCL2基因是一種新的磷脂酶C樣蛋白，位于染色體3p24.3上，缺乏磷脂酶催化活性，是B細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控因子［6，13］，可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，參與的疾病有急性心肌梗死、急性腦梗死、代謝綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、新型冠狀病毒肺炎，并與中國人群COVID-19嚴(yán)重程度密切相關(guān)［14-15］。PLCL2缺陷小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PLCL2是B細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)和免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)劑，被證明間接調(diào)節(jié)成熟B細(xì)胞，從而通過FAS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響免疫炎癥應(yīng)答。PLCL2基因可使免疫系統(tǒng)失調(diào)，促進(jìn)血管動脈粥樣硬化，參與心肌梗死的慢性炎癥過程。

一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究［5］發(fā)現(xiàn)，PLCL2 是日本人心肌梗死的新易感基因。后來有伊朗的一項(xiàng)病例對照研究［4］發(fā)現(xiàn)，PLCL2，從而基因中的rs4618210 A>G 多態(tài)性有助于心肌梗死的病因?qū)W診斷。本研究發(fā)現(xiàn)，PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210基因型頻率、等位基因頻率在兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PLCL2 基因多態(tài)性位點(diǎn)與疾病發(fā)生的結(jié)論不一致，考慮與LAA 型腦梗死的發(fā)生是個(gè)復(fù)雜的過程，是環(huán)境和基因相互作用的結(jié)果有關(guān)。HUANG 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，PLCL2 基因rs4685423和rs4618210 SNP 可能與中國漢族人LAA 型腦梗死的危險(xiǎn)性有關(guān)。SNP-SNP 相互作用分析顯示，rs4685423 是LAA 卒 中 風(fēng)險(xiǎn)影 響因素［8］。與 攜帶PLCL2 rs4685423 位點(diǎn)CC 基因型人群相比，攜帶AA基因型、CA 基因型的人群LAA 卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLCL2 rs4685423 位點(diǎn)攜帶純合子（CC + AA 型）人群與攜帶雜合子（CA）人群相比患LAA 型腦梗死的可能性大。本研究與前人的研究中均發(fā)現(xiàn)PLCL2 rs4685423 位點(diǎn)CA 雜合子型患LAA 型腦梗死風(fēng)險(xiǎn)較其余基因型小，但是AA 純合子型研究結(jié)果不一致，考慮可能與不同人群遺傳因素和生活環(huán)境不同導(dǎo)致的遺傳表型發(fā)生變化有關(guān)。 HUANG 等［6，8］研 究 發(fā) 現(xiàn)，與 攜 帶PLCL2 rs 4618210 位點(diǎn)GG 基因型人群相比，攜帶AA 基因型、GA 基因型人群LAA 卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低。本研究發(fā)現(xiàn)，基于共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結(jié)果顯示，PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4618210 位點(diǎn)與LAA 型腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的關(guān)聯(lián)，與文獻(xiàn)研究結(jié)果不一致，未來需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再次驗(yàn)證。

總之， LAA 型腦梗死及正常健康人群PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 位點(diǎn)均以突變雜合子所占比例為最多。攜帶PLCL2 rs4685423 位點(diǎn)純合子（CC + AA 型）人群與攜帶雜合子（CA）人群相比患LAA 型腦梗死的可能性大。本研究也有一定的局限性，如研究對象均為新疆地區(qū)人群，由于遺傳影響與種族背景密切相關(guān)，可能不符合其他種族；研究樣本量小，對混雜因素調(diào)整不充分；采用了病例—對照研究設(shè)計(jì)，只能揭示相關(guān)因素與LAA 型缺血性腦卒中之間的潛在關(guān)聯(lián)，而無法確定因果關(guān)系。