交泰丸水煎液腹腔注射對失眠小鼠晝夜節(jié)律紊亂的改善作用及其機制

區(qū)浩松，楊陽，金如意，郭健，趙俊云

北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102488

失眠通常指患者對睡眠時間和 （或） 質(zhì)量不滿足，并影響白天社會功能的一種主觀體驗［1］。作為最常見的睡眠障礙，長期失眠可能影響人的認知能力［2］，導致焦慮、抑郁等精神障礙［3］，增加癡呆風險［4］，嚴重影響人的健康及生活質(zhì)量。受到失眠影響的機體發(fā)生晝夜節(jié)律紊亂，可發(fā)生DNA 甲基化、組蛋白乙?；缺碛^遺傳改變［5］。時鐘基因?qū)円构?jié)律具有重要的調(diào)節(jié)作用，如哺乳動物依賴核心生物鐘基因晝夜運動輸出周期蛋白——大腦/肌肉芳香經(jīng)受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白1（CLOCK-BMAL1）節(jié)奏性地與DNA 結(jié)合，從而激活周期蛋白（PER）、隱花色素（CRY）等時鐘基因的轉(zhuǎn)錄［6］。而失眠與時鐘基因表達的表觀遺傳標志改變相關(guān)，如急性睡眠剝奪可增加啟動子甲基化，從而降低晝夜節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄［7］。食欲素前體（HCRT）對睡眠覺醒具有重要的作用，可與時鐘基因共同調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律［8］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）參與了時鐘基因的表達調(diào)控，且與表觀遺傳修飾有關(guān)［9-12］。前期研究［13-15］顯示，對氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠心臟、腎臟組織中的大腦/肌肉芳香經(jīng)受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白1（BMAL1）、晝夜運動輸出周期蛋白（CLOCK）、隱花色素1（CRY1）等時鐘基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，而PER1、PER2、CRY2 等基因的表達上升。交泰丸最早記載于明代韓懋的《韓氏醫(yī)通》，是交通心腎的經(jīng)典名方，由黃連、肉桂組成（黃連∶肉桂=10∶1），治療心腎不交型失眠療效顯著［12］，但具體機制仍未明確。2021 年11 月—2022 年2 月，本研究觀察了交泰丸對PCPA 致失眠大鼠睡眠節(jié)律紊亂的改善作用，并探討了其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 實驗動物： 30 只SPF 級、體質(zhì)量（20 ± 2）g 的2 月齡雄性ICR 小鼠（動物許可證號：SCXK（京）2015-0015）、實驗動物玉米芯墊料及小鼠維持飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。藥物與試劑：中藥飲片黃連和肉桂均購自北京同仁堂藥店。PCPA（批號：AK-80383，純度>98%）購自上海思域化工科技有限公司。總RNA 小提試劑盒（批號：R4111-03）購自廣州美基生物科技有限公司。mouse DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1） ELISA kit、mouse 組蛋白去乙?；福℉DAC）ELISA kit均購自北京奇松生物科技有限公司。2×Power-SYBR?Green PCR Master Mix（批號：4367659）、RevertAid First Strand cDNA Synthetic Kit（批 號：K1621）、PageRuler（批號：26616）均購自美國Thermo Fisher Scientific。BCA 蛋白定量試劑盒（批號：PC0020）、超敏發(fā)光液（PE0010）、RIPA（批號：R0010）、SIRT1 多克隆抗體（批號：13161-1-AP）、FOXO1 多克隆抗體（批號：18592-1-AP）、綿羊抗兔IgG-HRP（批號：SE134）、辣根過氧化物酶標記的綿羊抗小鼠IgG（批號：SE131）、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑混合物（批號：P1260）均購自北京索萊寶科技有限公司。實驗儀器：Pultton 超微量分光光度計購自美國溪拓科技有限公司，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System 購自美國Life Technologies，BioTek酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific，UGO Baisle 60*60*50cm曠場購自上海語純生物科技有限公司，F(xiàn)T-200 動物跑步機購自成都泰盟軟件有限公司，IKA T10 basic 勻漿機購自艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司，3K15高速冷凍離心機購自北京宏達恒業(yè)科技有限公司，ChemiDocTMMP 成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.2 動物分組、失眠模型建立及交泰丸水煎液灌胃 小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學良鄉(xiāng)校區(qū)動物房，在正常溫濕度、光照、飲食下適應(yīng)喂養(yǎng)1周后開始實驗。交泰丸水煎液（黃連8.6 g、肉桂0.86 g）常規(guī)煎煮過濾保存?zhèn)溆?。將小鼠隨機分為交泰丸組、模型組、對照組，每組10只。交泰丸組按450 mg/kg腹腔注射PCPA，每天1 次、連續(xù)2 d 后，灌胃交泰丸水煎液0.4 mL/次，連續(xù)7 d；模型組按450 mg/kg 腹腔注射PCPA，每天1次、連續(xù)2 d后，灌胃等量蒸餾水，連續(xù)7 d；對照組腹腔注射等量生理鹽水，每天1 次、連續(xù)2 d后，灌胃等量蒸餾水，連續(xù)7 d。

1.3 各組行為學觀察 曠場實驗：曠場實驗在晚上進行，待小鼠在環(huán)境中適應(yīng)30 min后，把小鼠放置于曠場中心分別測量每只小鼠5 min內(nèi)的運動總距離，即水平距離 + 垂直距離。在每只小鼠實驗結(jié)束后，用75%酒精擦拭曠場，待氣味消散后再進行下一只小鼠測量，整個實驗過程需保持安靜且沒有光線影響。跑臺實驗：將小鼠放入跑道，速度數(shù)值設(shè)置為12，記錄每只小鼠3 min 內(nèi)受到電擊次數(shù)。在測試結(jié)束后，用75%酒精擦拭跑道，待氣味消散后再進行下一次小鼠跑臺實驗，整個實驗過程保持安靜。

1.4 腦 組 織 時 鐘 基 因CLOCK、HCRT、PER1、BMAL1檢測 灌胃第7天，小鼠禁食12 h，在最后一次灌胃4 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 收集腦組織，迅速投入液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)移到-80 ℃保存?zhèn)溆?。RT-qPCR 法檢測腦組織時鐘基因。按照試劑盒說明，提取腦組織總RNA，合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃下進行反應(yīng)60 min，70 ℃下進行反應(yīng)5 min。qPCR 引物通過使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，CLOCK、HCRT、PER1、BMAL1、GAPDH 的引物序列如 下：CLOCK 上 游 引 物：5'GGTCCAGTGAACCGTAGCA3'，下游引物：5'AATCTCCTGACTCCACCACAT3'；HCRT 上 游 引 物：5'TGAACCCATCTTCTATCCTTGT3'，下 游 引 物：5'TCGTCTTTATTGCCATTTACC3'；PER1 上 游 引 物：5'GCCCTTTGACCATTCCCCTAT3'，下 游 引 物：5'TGGCGACCCAACACGAAA3'；BMAL1 上游引物：5'CTACAAGCCAACATTTCTATC3'，下游引物：5'TCTTCCCTCGGTCACAT3'；GAPDH 上游引物：5'GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3'，下游引物：5'TGGTGAAGACGCCAGTGGA3'。qPCR 擴增條件為：95 ℃反應(yīng)30 s，95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)30 s，共40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個重復孔。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.5 血清DNMT1 和HDAC 水平檢測 灌胃第7天，小鼠禁食12 h，在最后一次灌胃4 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，常規(guī)方法分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA 法檢測，按照試劑盒說明步驟進行操作。

1.6 腦組織SIRT1 和FOXO1 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取1.4中保存的腦組織，按常規(guī)方法提取腦組織總蛋白質(zhì)，定量后進行SDS-PAGE電泳，然后進行PVDF 膜轉(zhuǎn)移電泳。脫脂奶粉封閉，室溫下?lián)u床平搖1 h。PBST緩沖液洗膜，加入SIRT1和FOXO1 的稀釋抗體在4 ℃下孵育過夜。洗膜，除去過量一抗，加入相應(yīng)二抗，孵育1 h。洗膜，除去過量二抗，凝膠成像系統(tǒng)顯影，Image J 分析條帶吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以-x± s 表示，比較采用One-Way ANOVA，進一步組間比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料比較采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組失眠小鼠的活躍度及運動能力 交泰丸組跑臺電擊次數(shù)為（15.1 ± 12.0）次，模型組為（35.8 ± 11.0）次，對照組為（11.7 ± 11.6）次；與對照組比較，模型組小鼠被電擊次數(shù)增加（P<0.01）；與模型組比較，交泰丸組小鼠被電擊次數(shù)減少（P<0.01）。三組小鼠夜間曠場活動距離詳見表1。與對照組比較，模型組小鼠夜間總活動距離縮短（P<0.01）；與模型組比較，交泰丸組小鼠夜間總活動距離增加（P<0.05）。

表1 三組小鼠夜間曠場活動距離（mm，-x ± s）

2.2 三 組 小 鼠 腦 組 織CLOCK、HCRT、PER1、BMAL1 mRNA 相對表達量比較 三組小鼠腦組織CLOCK、HCRT、PER1、BMAL1 mRNA 相對表達量見表2。與對照組比較，模型組CLOCK、BMAL1、HCRT mRNA 相對表達量下降（P均<0.01）；與模型組比較，交泰丸組CLOCK、HCRT mRNA 相對表達量上升（P均<0.01）。三組PER1 mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 三組小鼠腦組織CLOCK、HCRT、PER1、BMAL1 mRNA相對表達量（-x ± s）

2.3 三組小鼠血清DNMT1、HDAC 水平比較 三組小鼠血清DNMT1和HDAC水平見表3。與對照組比較，模型組小鼠血清DNMT1 水平上升（P<0.01）；與模型組比較，交泰丸組小鼠血清DNMT1水平下降（P<0.05）。與對照組比較，模型組小鼠血清HDAC水平下降（P<0.01）；與模型組比較，交泰丸組小鼠血清HDAC 水平相對上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 三組小鼠血清DNMT1和HDAC水平（U/L，-x ± s）

2.4 三組腦組織SIRT1、FOXO1蛋白水平比較 三組腦組織SIRT1、FOXO1 蛋白 Western blotting 電泳圖見圖1，三組腦組織SIRT1、FOXO1 蛋白水平見表4。與對照組相比較，模型組小鼠腦組織SIRT1蛋白水平下降（P<0.01），而FOXO1 蛋白水平上升（P<0.05）；與模型組比較，交泰丸組SIRT1 蛋白水平上升（P<0.05），而FOXO1蛋白水平下降（P<0.05）。

圖1 三組腦組織SIRT1、FOXO1蛋白 Western blotting電泳圖

表4 三組腦組織SIRT1、FOXO1蛋白水平（-x ± s）

3 討論

失眠與眾多因素相關(guān)，其中生物鐘系統(tǒng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［16］，其核心元件如CLOCK、BMAL1等控制晝夜節(jié)律，維持生物活動［17］。CLOCK 基因作為哺乳動物晝夜節(jié)律的核心控制器，它的轉(zhuǎn)錄異常會造成晝夜節(jié)律紊亂及其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄異常，進一步導致哺乳物內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)甚至導致疾病。BMAL1 能與CLOCK 蛋白形成二聚體，促進PER1 的轉(zhuǎn)錄［17］。另外，HCRT 又被稱為食欲素前體，對哺乳動物的攝食行為、新陳代謝和內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持發(fā)揮重要作用，它能編碼出HCRT1、HCRT2 兩種神經(jīng)肽前體蛋白，具有維持睡眠覺醒的作用，可與時鐘基因共同調(diào)節(jié)睡眠及晝夜節(jié)律［8］。本研究中模型組小鼠腦組織CLOCK、BMAL1、HCRT 的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比顯著降低，PER1 的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，說明失眠小鼠時鐘基因核心元件的表達出現(xiàn)了異常；交泰丸干預后CLOCK、HCRT 的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而BMAL1 的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，這提示交泰丸可能主要通過調(diào)節(jié)CLOCK、HCRT 的表達實現(xiàn)對失眠小鼠晝夜節(jié)律紊亂的改善。

晝夜節(jié)律與與運動之間具有復雜的相互影響。晝夜節(jié)律改變對運動功能有著顯著的影響，相反，運動也可以造成晝夜節(jié)律的相移，從而影響睡眠/覺醒。本研究曠場實驗、跑臺實驗提示交泰丸改善了失眠小鼠的活躍度和運動能力，進一步提示交泰丸改善晝夜節(jié)律紊亂。

血清生化分析結(jié)果顯示，PCPA 致失眠小鼠外周血清中的DNMT1 水平顯著升高、HDAC 水平顯著降低，提示失眠小鼠的表觀遺傳修飾水平較對照組出現(xiàn)了明顯的改變，很可能是產(chǎn)生內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)的重要原因。交泰丸干預后DNMT1 水平顯著降低，而HDAC 水平變化無顯著性差異，提示交泰丸可能通過調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾酶活性調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸SIRT1/FOXO1 與時鐘基因表達關(guān)系密切，在哺乳動物體內(nèi)發(fā)揮多種生物學效應(yīng)，其下游靶基因參與細胞增殖、凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、DNA 修復、糖代謝、免疫調(diào)節(jié)等過程。有研究［18］表明，SIRT1、FOXO1 參與生物鐘的調(diào)節(jié)，其中SIRT1作為一種表觀遺傳修飾酶，同時也是一種NAD+依賴性的組蛋白去乙?；?，它能結(jié)合BMAL1-CLOCK 二聚體并拮抗CLOCK 的乙?；饔?，而BMAL1-CLOCK 二聚體也能調(diào)控SIRT1 的表達［10］。FOXO1 轉(zhuǎn)錄因子是Forkhead 家族中的一個亞型，對于生物鐘的調(diào)節(jié)也具有重要作用，它能結(jié)合多個核心時鐘基因如PER1、BMAL1［11］。組蛋白乙?；僧a(chǎn)生轉(zhuǎn)錄復合物募集所需的黏附表面，而轉(zhuǎn)錄因子FOXO1 的乙?；稍鰪娹D(zhuǎn)錄活性，SIRT1 介導的去乙?；瘎t抑制其活性［19］，因此SIRT1 及FOXO1 可共同參與多個基因的表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)。本研究中模型組小鼠大腦組織SIRT1蛋白水平與對照組相比降低，F(xiàn)OXO1 蛋白水平上升，說明失眠小鼠SIRT1/FOXO1 軸的功能出現(xiàn)了明顯的變化，勢必引起一系列下游靶基因表達的改變，造成多種細胞表型與功能的異常。交泰丸干預后SIRT1 蛋白水平提高，F(xiàn)OXO1 下降，提示交泰丸有可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/FOXO1 軸的功能影響時鐘基因的表達，同時也提示交泰丸還可能通過SIRT1/FOXO1 軸產(chǎn)生多種生物學效應(yīng)。

總之，交泰丸能使PCPA 致失眠小鼠晝夜節(jié)奏紊亂改善，其作用可能是通過SIRT1/FOXO1軸上調(diào)CLOCK、BMAL1 等時鐘基因以及HCRT 的轉(zhuǎn)錄水平，并抑制DNMT1活性而實現(xiàn)的。本研究從中醫(yī)陰陽相濟理論出發(fā)，探討交泰丸改善失眠的可能分子機制，對運用現(xiàn)代生物學理論及技術(shù)進行中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進行了嘗試，提出了中醫(yī)證候本質(zhì)及方藥作用機制研究的新思路，后續(xù)將進一步結(jié)合中醫(yī)睡眠學說的相關(guān)理論完善動物模型，為交泰丸在失眠、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。