乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

楊穎穎，邱煒

作者單位：1貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴州 貴陽550000；2遵義市第一人民醫(yī)院腫瘤科，貴州 遵義563000

惡性黑色素瘤是最具侵襲性和抗治療性的皮膚癌形式，其侵襲性主要是基于黑色素瘤細(xì)胞的高度轉(zhuǎn)移潛力［1］。盡管靶向治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療取得了一定的療效，但轉(zhuǎn)移性黑色素瘤仍然是一種無法治愈的疾?。?-3］。因此，探索黑色素瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于提高其診斷和治療水平極為必要。

腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）高度相關(guān)［4］。缺氧引發(fā)一系列生化反應(yīng)引發(fā)局部酸化進(jìn)而將TME轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)抗腫瘤免疫細(xì)胞不利環(huán)境的驅(qū)動(dòng)力之一［5］。乳酸（lactic acid，LA）是一種信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)TME內(nèi)的代謝途徑、免疫反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)通信等方面具有重要作用［6］。此外，乳酸在厭氧腫瘤環(huán)境中濃度很高，并且已被證明可以改變巨噬細(xì)胞以獲得促進(jìn)腫瘤生長的特性［7］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）參與調(diào)控惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的穩(wěn)態(tài)。此外，已有多項(xiàng)研究表明，在多種類型黑色素瘤中都觀察到少量巨噬細(xì)胞［8］。然而，TAM在黑色素瘤轉(zhuǎn)移中的功能仍然未知。本研究于2021年1月至2022年2月，首次描述了黑色素瘤的惡性生物學(xué)行為與乳酸誘導(dǎo)的TAM 極化之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要材料 乳酸（純度≥98%，L6402）、脂多糖（LPS）（來源于大腸桿菌0111：B4，L5293）、白細(xì)胞介素（IL）-4（純度≥98%，SRP3211）獲取自美國Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7（HTX1760）和小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10（AC-2661H）獲取自上海雅吉生物科技有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（CK04）獲取自上海研卉生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒獲取自臺(tái)灣亞諾法生技股份有限公司；小鼠IL-12 ELISA試劑盒（orb566228）、小鼠IL-10 ELISA試劑盒（orb565120）獲取自英國Biorbyt公司；CD206（ab270647）抗體獲取自英國Abcam公司；High Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（4368813）、Maxima SYBR Green qPCR（K0253）獲取自美國Thermofisher。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物配制 乳酸通過首先溶解在少量的DMSO溶液中，而后慢慢添加PBS緩沖液溶解進(jìn)而配制形成1 mol/L的母液，保存于-4 ℃冰箱備用。待使用時(shí)使用相應(yīng)的培養(yǎng)基配制為合適的濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Raw264.7和B16F10細(xì)胞使用DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%胎牛血清），常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞傳代次數(shù)不超過30次。

1.2.3 乳酸的細(xì)胞毒性檢測(cè) 將培養(yǎng)的Raw264.7和B16F10細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后，添加不同濃度的乳酸（0、5、10、20 mmol/L）［9］繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后，添加10 μL的CCK-8溶液培養(yǎng)4 h后，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)乳酸處理后的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。

1.2.4 細(xì)胞分組 將Raw264.7細(xì)胞以1×106個(gè)/孔鋪至6孔板中，將其依次分為對(duì)照組、LPS組（誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞）、IL-4組（誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞）、乳酸 5 mmol/L組、乳酸 10 mmol/L組和乳酸 20 mmol/L組。對(duì)照組Raw264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，LPS組Raw264.7細(xì)胞使用終濃度為1 mg/L的LPS［10］處理，IL-4組Raw264.7細(xì)胞使用終濃度為20 μg/L的IL-4［10］處理；乳酸 5 mmol/L組、乳酸 10 mmol/L組和乳酸 20 mmol/L組分別使用終濃度為5、10、20 mmol/L的乳酸處理，所有細(xì)胞均培養(yǎng)24 h。

1.2.5 黑色素瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集各組處理的Raw264.7細(xì)胞的上清液用于培養(yǎng)B16F10細(xì)胞培養(yǎng)24 h。隨后，添加10 μL的CCK-8溶液培養(yǎng)4 h后，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)乳酸處理后的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。

1.2.6 黑色素瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 各組處理的Raw264.7細(xì)胞的上清液培養(yǎng)B16F10細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞懸浮于200 μL的緩沖液中，分別添加10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI溶液避光孵育20 min，在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 黑色素瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) B16F10細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔鋪至6孔板中，待其鋪滿后，使用200 μL移液器槍頭進(jìn)行劃痕，使用各組處理的Raw264.7細(xì)胞的上清液培養(yǎng)24 h，分別對(duì)0 h和24 h后的劃痕寬度進(jìn)行拍照記錄。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.8 黑色素瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 50 μL的基質(zhì)膠包被在Transwell小室（8 μm）上室中，將B16F10細(xì)胞使用無血清的DEME培養(yǎng)基稀釋后接種在Transwell小室上室中，下室中添加正常培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用4%多聚甲醛將小室下室中細(xì)胞固定并通過0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下對(duì)侵襲到下室中的細(xì)胞進(jìn)行拍照并統(tǒng)計(jì)。

1.2.9 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀測(cè) 培養(yǎng)Raw264.7細(xì)胞，按照“1.2.4”中方法分組處理后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組Raw264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.10 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑盒說明，收集每組Raw264.7細(xì)胞上清液，每孔中添加50 μL的樣品，使用試劑盒中的膠帶覆蓋并孵育。加入對(duì)應(yīng)的IL-12或IL-10結(jié)合物，再次孵育。加入底物避光孵育30 min后加入終止液終止反應(yīng)。檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各因子濃度。

1.2.11 qRT-PCR檢測(cè)腫瘤蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子1（Tpt1）和肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（Malat1）表達(dá)水平 Trizol試劑從各組處理的Raw264.7細(xì)胞中分離總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。接下來使用SYBR Green（2×）和特異性引物（均由上海生工設(shè)計(jì)并合成）進(jìn)行qRT-PCR分析，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算倍數(shù)變化，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.12 CD206表達(dá)水平檢測(cè) Raw264.7細(xì)胞接種在6孔板中（1×106個(gè)/孔），按照1.2.4中方法分組處理后收集細(xì)胞，加入CD206抗體在室溫下避光孵育20 min，添加PBS清洗后，在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)CD206表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 22.0對(duì)本文中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢測(cè)，符合正態(tài)分布的研究結(jié)果使用來表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，多組間比較具有差異的數(shù)據(jù)進(jìn)一步兩兩比較通過SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞和和黑色素瘤細(xì)胞活性的影響 不同濃度乳酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞和B16F10細(xì)胞均無明顯細(xì)胞毒性（P＞0.05）。見表2。

表2 乳酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞和B16F10細(xì)胞的毒性作用檢測(cè)/

表2 乳酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞和B16F10細(xì)胞的毒性作用檢測(cè)/

乳酸0 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 Raw264.7 100.00±0.00 97.65±2.54 94.26±4.65 89.31±8.09 2.76 0.111 B16F10 100.00±0.00 95.65±2.62 92.10±5.17 86.31±8.46 3.82 0.057

2.2 乳酸調(diào)控巨噬細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響 如表3結(jié)果所示，使用不同濃度乳酸干預(yù)Raw264.7細(xì)胞后的上清液培養(yǎng)B16F10細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，乳酸組和IL-4組細(xì)胞活力、劃痕愈合率以及侵襲細(xì)胞數(shù)量均明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），LPS組細(xì)胞活力、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)量以及凋亡率均無顯著變化（P＞0.05）。而不同濃度乳酸組隨著乳酸濃度升高，細(xì)胞活力、劃痕愈合率以及侵襲細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，細(xì)胞凋亡率逐漸降低（P＜0.05）。由此推測(cè)，乳酸可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化促進(jìn)黑色素瘤惡性生物學(xué)行為。

表3 乳酸對(duì)B16F10細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響/

注：LPS為脂多糖，IL為白細(xì)胞介素。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與LPS組比較，P＜0.05。③與IL-4組比較，P＜0.05。④與乳酸5 mmol/L組比較，P＜0.05。⑤與乳酸10 mmol/L組比較，P＜0.05。

侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)45.36±4.21 50.13±5.23 167.26±12.36①②89.36±8.12①②③113.05±10.03①②③④131.25±11.14①②③④⑤126.32＜0.001組別對(duì)照組LPS IL-4乳酸 5 mmol/L乳酸 10 mmol/L乳酸 20 mmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3細(xì)胞活力/%100.00±0.00 92.23±8.76 188.37±9.25①②125.36±7.88①②③144.36±8.65①②③④167.28±10.12①②③④⑤63.78＜0.001凋亡率/%57.26±4.25 55.14±3.45 8.20±0.87①②41.23±4.02①②③29.26±3.14①②③④18.64±2.09①②③④⑤115.39＜0.001劃痕愈合率/%25.26±2.23 28.23±2.02 78.26±6.25①②39.21±3.15①②③52.65±3.87①②③④64.24±6.12①②③④⑤71.25＜0.001

2.3 乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Raw264.7向M2型極化設(shè)置LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞和IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞為對(duì)照，使用上述驗(yàn)證的無毒性的乳酸處理巨噬細(xì)胞24 h。觀察細(xì)胞形態(tài)得出，乳酸組巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與IL-4組相似，均呈現(xiàn)M2樣變化。進(jìn)一步結(jié)果顯示（表4），與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-12均升高（P＜0.05），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、IL-10、CD163水平無顯著變化（P＞0.05）；IL-4組和乳酸 5 mmol/L組、乳酸10 mmol/L組和乳酸 20 mmol/L組細(xì)胞中TNF-α、IL-12水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，VEGF、IL-10、CD163水平顯著升高（P＜0.05）。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的IL-12與IL-10表達(dá)水平以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的CD206的表達(dá)水平則具有相似的結(jié)果（P＜0.05）。經(jīng)過對(duì)巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和相關(guān)分子水平的檢測(cè)得出，乳酸可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。

表4 qRT-PCR檢測(cè)乳酸對(duì)B16F10細(xì)胞M1和M2極化相關(guān)分子水平比較/

表4 qRT-PCR檢測(cè)乳酸對(duì)B16F10細(xì)胞M1和M2極化相關(guān)分子水平比較/

注：LPS為脂多糖，IL為白細(xì)胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，VEGF為血管內(nèi)皮生長因子。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與LPS組比較，P＜0.05。③與IL-4組比較，P＜0.05。④與乳酸 5 mmol/L組比較，P＜0.05。⑤與乳酸 10 mmol/L組比較，P＜0.05。

CD163/%8.15±0.78 8.87±0.64 58.36±5.12①②18.39±1.54①②③25.69±2.87①②③④37.16±3.15①②③④⑤138.81＜0.001組別對(duì)照組LPS IL-4乳酸 5 mmol/L乳酸 10 mmol/L乳酸 20 mmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 TNF-α/（ng/L）22.39±3.36 45.63±4.58①23.15±1.37 22.36±2.15 24.36±2.02 20.19±2.18 34.45＜0.001 IL-12/（ng/L）45.17±4.16 87.29±7.15①40.13±5.01 41.39±4.27 44.26±4.13 48.26±3.15 41.89＜0.001 VEGF/（ng/L）78.15±7.56 82.56±8.36 245.36±20.15①②124.36±11.03①②③164.39±14.35①②③④198.65±15.39①②③④⑤72.89＜0.001 IL-10/（ng/L）27.25±2.21 32.36±3.14 97.54±7.25①②47.26±4.02①②③65.32±5.48①②③④79.36±7.12①②③④⑤83.13＜0.001

2.4 乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞中Tpt1、Malat1表達(dá)的影響表5結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度乳酸可明顯提高Tpt1 mRNA和Malat1 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），結(jié)果與IL-4組相一致，而LPS組Tpt1 mRNA和Malat1 mRNA表達(dá)水平無明顯變化。

表5 乳酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞中Tpt1、Malat1表達(dá)水平的影響/

表5 乳酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞中Tpt1、Malat1表達(dá)水平的影響/

注：LPS為脂多糖，IL-4為白細(xì)胞介素-4，Tpt1為腫瘤蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子1，Malat1為肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與LPS組比較，P＜0.05。③與IL-4組比較，P＜0.05。④與乳酸 5 mmol/L組比較，P＜0.05。⑤與乳酸 10 mmol/L組比較，P＜0.05。

Malat1 1.08±0.06 1.03±0.03 2.95±0.20①②1.52±0.14①②③1.94±0.13①②③④2.56±0.17①②③④⑤101.43＜0.001組別對(duì)照組LPS IL-4乳酸 5 mmol/L乳酸 10 mmol/L乳酸 20 mmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 Tpt1 1.02±0.05 1.05±0.04 3.15±0.21①②1.57±0.12①②③1.97±0.17①②③④2.60±0.21①②③④⑤97.25＜0.001

3 討論

以往研究大多都集中在基因組本身與腫瘤本身，以說明腫瘤惡性行為的機(jī)制。腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)塑造了TME的狀態(tài)，這可能決定腫瘤的結(jié)果，并且可能是腫瘤發(fā)展的一種新機(jī)制［11］。乳酸已被證明可以改變多個(gè)關(guān)鍵癌基因的轉(zhuǎn)錄活性，并且研究證實(shí)乳酸產(chǎn)生誘發(fā)的致癌信號(hào)可以作為Warburg效應(yīng)的一個(gè)重要目的［12］。乳酸代謝不僅與缺氧（產(chǎn)生乳酸）和常氧（輸入乳酸）癌細(xì)胞之間的代謝平衡相關(guān)，而且還與缺氧癌細(xì)胞將TAM極化為糖酵解不良的M2型巨噬細(xì)胞有關(guān)［13］。據(jù)報(bào)道，癌細(xì)胞中糖酵解增加引起的而TME的酸化，而黑色素瘤則通過感知TME的酸化來促進(jìn)TAM的M2型極化［14］。已證明，乳酸特別地將TAM偏向于“腫瘤友好”的M2樣表型進(jìn)而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7和黑色素瘤細(xì)胞B16F10均無明顯毒性，但乳酸作用Raw264.7細(xì)胞后的上清液可明顯促進(jìn)B16F10細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。提示乳酸可能通過調(diào)控TAM，進(jìn)而對(duì)黑色素瘤具有促癌作用。

TAM是組織和TME內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。原發(fā)性腫瘤中的TAM促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲，被認(rèn)為是癌癥聯(lián)合治療中極具吸引力的一部分［16］。既往研究表明，腫瘤組織中巨噬細(xì)胞常為M2型，往往具有促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用［17］。另外，研究證實(shí)，在小鼠模型體內(nèi)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M1型激活可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸干預(yù)Raw264.7細(xì)胞后，Raw264.7細(xì)胞呈現(xiàn)M2型變化，且可明顯提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子VEGF、CD163和IL-10的表達(dá)，而對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子IL-12和TNF-α的表達(dá)無顯著影響。以上數(shù)據(jù)表明，乳酸可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化。然而，對(duì)于乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化后如何調(diào)控黑色素瘤的發(fā)展尚不清楚。因此，有必要對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)進(jìn)行探究。Tpt1是一種高度保守的蛋白質(zhì)，據(jù)報(bào)道它在多種惡性腫瘤中強(qiáng)烈表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等過程［19］。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)，Tpt1在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，抑制Tpt1可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移。另外，Malat1是長鏈非編碼RNA中的一種，首次在肺癌中發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥中均具有預(yù)后和診斷價(jià)值［21］。已有多項(xiàng)研究表明，Malat1在黑色素瘤中發(fā)揮促癌作用，下調(diào)Malat1可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲進(jìn)而抑制黑色素瘤的發(fā)展［22］。且研究表明，細(xì)胞外囊泡穿梭的Malat1可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化［23］。令人感興趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸作用Raw264.7細(xì)胞可明顯提高Tpt1和Malat1的表達(dá)水平，提示Tpt1和Malat1極有可能是乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化的分子靶點(diǎn)，暗示乳酸可能通過上調(diào)Tpt1和Malat1表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，在黑色素瘤中發(fā)揮促癌作用。然而，其中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上，乳酸誘導(dǎo)的TAM M2型極化可促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)為黑色素瘤的免疫治療提供新的參考依據(jù)。然而，本研究并未對(duì)乳酸是否以及如何通過TAM極化影響黑色素瘤細(xì)胞活性進(jìn)行初步驗(yàn)證，而是直接進(jìn)行了TAM M2型極化分析，缺乏中間的過度實(shí)驗(yàn)。其次，本研究并未在動(dòng)物模型中進(jìn)行同步驗(yàn)證。后續(xù)仍需進(jìn)一步探索以補(bǔ)充完善乳酸在黑色素瘤發(fā)展過程中作用機(jī)制。