嵌合型PCV1-3感染性克隆的構建及病毒拯救

李佳昕,田 瑤,韓先杰,楊 瑩,王 碩,時建立,李 琛,劉 暢,彭 喆,吳曉燕,韓 紅,李 俊,3*

(1.青島農業(yè)大學 動物醫(yī)學院,山東 青島 266109;2.山東省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,山東 濟南 250100;3.山東師范大學 生命科學院,山東 濟南 250014)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種很小的無囊膜單股環(huán)狀動物病毒,歸屬于圓環(huán)病毒科[1-2]。在2016年之前豬圓環(huán)病毒只有2種血清型,即PCV1與PCV2。PCV1無致病性,但能夠感染PK15細胞。PCV2是致病性的病毒,是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原[3-4]。2016年,美國學者發(fā)現(xiàn)了一種新型豬圓環(huán)病毒,命名為PCV3[5]。PCV3的感染可引起豬的多種疾病,如母豬的繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥、免疫力下降甚至引起免疫抑制等[6]。目前,PCV3的感染在世界范圍內均有流行,對養(yǎng)豬業(yè)產生了巨大影響,雖然市場上PCV2商品化疫苗有10余種[7],但國內外還沒有商品化的PCV3疫苗。而PCV2與PCV3編碼誘導中和抗體的衣殼蛋白Cap基因組的同源性僅有30%左右,傳統(tǒng)的PCV2疫苗幾乎不能提供交叉保護[8]。因此,研發(fā)成本低、保護效力高的PCV3疫苗很有必要。

PCV3與PCV1的同源性僅有40%左右,但其基因組大小和組成非常相似,都具有2個主要的開放閱讀框(open reading frame,ORF),其中ORF2均編碼病毒衣殼蛋白,但2種病毒的衣殼蛋白之間沒有抗原交叉性。由于PCV3分離培養(yǎng)較為困難,體外表達抗原成為疫苗制備的首選[9]。

目前,已有文獻報道重組嵌合型PCV1-2是預防PCV2引起疾病的良好疫苗,其制備過程為本研究提供良好的思路[10-11]。鑒于此,本研究以PCV1的全基因組作為骨架,將其ORF2基因替換成PCV3的ORF2基因,利用PCV1的復制能力和PCV3 Cap蛋白的免疫原性,為研究低成本、高效保護力的PCV3疫苗奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒與載體

無PCV污染的PK-15細胞系、PCI表達載體由青島農業(yè)大學動物醫(yī)學院實驗室保存,pEASY-Blunt zero-PCV3質粒、PMD18-T-PCV1質粒也由本實驗室構建。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、Prime STAR Max購自寶生物工程(大連)有限公司。DNA純化回收試劑盒購自北京OMEGA有限公司。質粒小提試劑盒購自康寧生命科學有限公司。轉染試劑Lipofectamine 3000 Transfection Kit購自Invitrogen公司。PCV3 ORF2單克隆抗體由鄭州大學實驗室饋贈。ACE底物顯色液購自北京Solarbio公司。HRP-SPA購自abcam公司。

1.3 引物設計與合成

根據PCV1(AY193712.1)、PCV3(MG947596.1)全基因組序列設計4對引物(見表1),其中F1、R1與F3、R3用于PCV1缺失ORF2基因組擴增,F2、R2用于PCV3ORF2基因組擴增,在設計引物時添加了重疊部分序列。F4、R4用于檢測嵌合病毒PCV1-3基因組部分片段。

表1 引物名稱及序列

1.4 PCV1-3DNA克隆的構建

以重組質粒PMD18-T-PCV1和pEASY-Blunt zero-PCV3為模板,分別建立50 μL普通PCR反應體系:Prime STAR Max:25 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,模板2 μL,加ddH2O補齊50 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃ 終延伸7 min。反應結束經1.0%瓊脂糖凝膠電泳并回收。對回收產物PCV1 ORF2與PCV3 ORF2片段進行重疊PCR,反應結束經1.0%瓊脂糖凝膠電泳并回收。采用雙酶切NheⅠ和NotⅠ將PCI載體線性化,采用無縫連接的方法將上述DNA線性序列與線性載體序列冰上配制反應體系(表2)。37 ℃反應30 min后轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,進行PCR與測序鑒定。

表2 配制體系

1.5 嵌合病毒PCV1-3的拯救

1.5.1 DNA的轉染 使用6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)無PCV污染的PK-15細胞,待其生長至75%左右時,按照轉染試劑說明書將PCV1-3轉染至PK-15細胞中。72 h后收集轉染后的細胞,反復凍融3次后,用濾器將細胞碎片濾除,所得濾液接種于新的PK-15細胞中,依次盲傳5代。

1.5.2 PCR檢測 轉染細胞經5次傳代后將細胞懸液提取總DNA,用引物F4、R4進行PCR擴增鑒定,步驟參照1.4,同時設正常PK-15細胞作為陰性對照。

1.5.3 免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)檢測 應用PCV3 ORF2單克隆抗體通過免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)檢測PCV3衣殼蛋白的表達,確認PCV1-3 DNA克隆在轉染細胞中的感染性。將轉染72 h后的細胞使用PBS洗滌3次,放入37 ℃溫箱中干燥50 min后放入-20 ℃冰箱中冷凍50 min,拿出后使用4%預冷的多聚甲醛固定液在4 ℃固定45 min,用PCV3 ORF2單克隆抗體(1∶150)在37 ℃恒溫箱中孵育1 h;使用PBS洗滌3次后用HRP-SPA(1∶100)在37 ℃恒溫箱中孵育1 h,再使用PBS洗滌3次后加入ACE顯色液避光顯色15 min后在熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5.4 Western blot檢測嵌合病毒Cap蛋白的表達 將所獲嵌合病毒接種于PK-15細胞中,72 h后棄上清,加入適量裂解液,置于冰上裂解30 min,用細胞刮鏟將細胞刮下,離心后收集上清。之后按照常規(guī)方法進行蛋白電泳檢測,并設正常PK-15細胞作為陰性對照。

1.5.5 重組病毒滴度測定 將第4代病毒液使用無血清的DMEM培養(yǎng)基進行稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9),將稀釋好的病毒液接種至96孔板中,每個稀釋度加8個孔,并設立空細胞作為陰性對照。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,使用IPMA試驗檢測結果。

按照Reed-Muench法計算其TCID50,距離比例=(高于50%病變率的百分數-50%)/(高于50%病變率的百分數-低于50%病變率的百分數),LgTCID50=距離比例×稀釋度對數之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物的鑒定

經瓊脂糖凝膠電泳分析,成功擴增出PCV1缺失ORF2基因和PCV3ORF2基因的PCR產物的目的條帶,其大小分別為536 bp、521 bp和645 bp(圖1)。經重疊PCR擴增出預期目的條帶,其大小為1 702 bp(圖2)。

圖1 PCV1的2個片段和 PCV3 ORF2片段的擴增結果

圖2 PCV1-3全長片段的序列擴增

2.2 PCV1-3全基因組的PCR產物克隆入pCI-tb206-2

PCV1-3全基因組的PCR產物克隆入pCI-tb206-2載體,獲得重組質粒pCI-PCV1-3,經檢測引物F4/R4進行PCR檢測,擴增出目的條帶,大小約為1 785 bp(圖3),說明PCV1-3已成功克隆入pCI-tb206-2載體。將陽性質粒送生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果顯示重組質粒插入序列與原基因序列一致,無堿基突變(測序結果略)。

圖3 重組質粒檢測結果

2.3 免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)結果

將第4代重組病毒培養(yǎng)72 h進行IPMA檢測,并設立未接毒無污染的PK-15細胞為陰性對照。如圖4所示,拯救病毒能檢測到細胞被染色,呈紅棕色,而未接毒無污染的PK-15細胞沒有被染色。結果表明,PCV1-3 DNA感染性克隆轉染PK-15細胞時都具有感染性。

圖4 質粒PCV1-3轉染PK-15細胞的IPMA檢測(20×)

2.4 Western blot結果

蛋白免疫印跡試驗表明PCV3 Cap蛋白在28 kDa處存在特異性條帶,而陰性對照未接毒的PK-15細胞中則無蛋白的表達(圖5)。

圖5 轉染PK-15細胞后的Western blotting檢測

2.5 重組病毒滴度測定結果

重組病毒滴度測定結果見表3。按照Reed-Muench法計算其TCID50,得出病毒的滴度為105.13TCID50/mL。

表3 TCID50測定結果

3 討 論

目前在圓環(huán)病毒的4個血清型中,PCV3的研究成為關注的熱點。PCV3已在多個國家的農場或養(yǎng)殖場中被檢測到,但對于病毒的分離仍然很困難。有報道使用傳染性克隆[12]拯救了整個病毒,如何有效預防PCV3的感染成為了世界養(yǎng)殖業(yè)共同關注的問題。有資料顯示,PCV3會造成豬皮炎、腎病綜合征和生殖衰竭,而且還會導致豬的免疫能力下降甚至出現(xiàn)免疫抑制,因此其疫苗的研制具有十分重要的經濟意義。目前市場上PCV2的商品化疫苗有10余種,但還沒有一種有效的疫苗來防控PCV3的感染。結合世界范圍內PCV3的高感染率,很有必要研發(fā)出一種保護效力高、成本低的PCV3疫苗。

目前,國內外已有許多關于嵌合型PCV1-2的弱毒疫苗的相關報道[13-16],其構建方法是通過用PCV2的ORF2基因替換非致病性PCV1的相應片段,構建出一種嵌合病毒(PCV1-2),進而開發(fā)成為PCV2弱毒疫苗。已有報道表明,嵌合病毒PCV1-2免疫SPF仔豬后能夠激發(fā)機體產生PCV2 ORF2抗體[17]。汪正亮等通過PCV-2滅活疫苗免疫商品豬,商品豬皆產生了較高的體液免疫反應[18]。宋益等[19]運用嵌合豬圓環(huán)病毒PCV1-2接種BALB/c小鼠,結果顯示,接種42 d后,全部的接種的小鼠血清皆成陽性,說明該嵌合病毒PCV1-2能夠激發(fā)機體產生體液免疫應答。鑒于此,本試驗根據圓環(huán)病毒之間的相似性,使用相同方法將PCV3ORF2基因替換至PCV1基因中,構建出PCV1-3 DNA感染性克隆,該克隆轉染進細胞后,能夠在細胞表達并穩(wěn)定傳代。

感染性克隆拯救病毒的體外增殖能力能夠受到多重因素的影響,因此必須保證構建的感染性DNA克隆序列不會發(fā)生變異,與其親本病毒序列保持完全一致。在基因組構建過程中,最重要的就是防止堿基錯配以及產物突變,本試驗在重疊PCR過程中采用了高保真酶,確保了產物序列的穩(wěn)定性,測序結果顯示全基因組序列完全一致。重疊PCR技術被廣泛應用于基因重組、基因定點突變、基因組連接等試驗中[20-22]。本試驗采用重疊PCR的方法將PCV3ORF2基因替換至PCV1的基因組框架中,此方法可簡單迅速的將2個片段連接在一起,不需要內切酶進行酶切,再經連接酶進行連接,更加省時省力,而且操作簡單,為此后的序列構建提供一種新的思路。在與載體連接時,本試驗運用了無縫連接的試驗方法,該方法無需連接酶依賴體系,能夠有效防止載體自連,所得到的陽性克隆即為目的結果,連接成功率高達95%以上,能夠快速且高效的將片段連接至載體的任意位點,無需多重復雜的操作,同時也節(jié)約了時間。

目前,對PCV3的研究還處于起步階段,但疫苗的研制已經迫在眉睫,本研究對PCV3的弱毒疫苗研制提出了一種新思路。研究結果表明成功構建了一種新型豬圓環(huán)嵌合病毒PCV1-3,為進一步研制成本低、見效快的PCV3疫苗奠定了基礎。

4 結 論

本研究成功構建了PCV1和PCV3的嵌合病毒PCV1-3。對第4代病毒進行滴度測定,效價為105.13TCID50/mL。