銅綠假單胞菌鞭毛基因fliI的敲除對(duì)其鞭毛形成及生物膜生成的影響

李 琴,周靜茹,張旭華,倪 萍,任海燕,陳鄔錦

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又稱綠膿桿菌,是一種條件致病菌,常定居于正常人體的皮膚、呼吸道、消化道和黏膜等部位。因其具有遷移、定植、免疫逃逸、釋放毒素及對(duì)抗生素抵抗等能力,因此該菌常引起肺、皮膚及軟組織等部位的感染[1-2]。特別是病情重、病程長(zhǎng)、免疫力低下的患者,例如燒傷、外傷、新生兒及老年患者易受其感染[3]。銅綠假單胞菌感染相關(guān)的疾病中,肺部感染引起的疾病死亡率在25%～39%,菌血癥引起的死亡率在18%～61%,而多重耐藥銅綠假單胞菌感染引起死亡率甚至可高達(dá)40%～70%,由此可見(jiàn),銅綠假單胞菌感染不僅僅是臨床感染問(wèn)題,更是值得全社會(huì)關(guān)注、急需解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

銅綠假單胞菌可分泌多糖類胞外聚合物使菌體相互纏繞、盤(pán)結(jié)生成的生物膜(bacterial biofilm,BF),導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法及時(shí)清除病灶從而增強(qiáng)感染進(jìn)程[4]。銅綠假單胞菌鞭毛的合成較為復(fù)雜,牽涉到40多個(gè)基因表達(dá)。此外,其所需的結(jié)構(gòu)蛋白和其他蛋白通過(guò)鞭毛介導(dǎo)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌,該系統(tǒng)主要由6種跨膜蛋白(FlhA、FlhB、FliO、FliP、FliQ、FliR)以及細(xì)胞質(zhì)溶膠蛋白(FliH、FliI、FliJ)構(gòu)成[5]。其中FliI蛋白是鞭毛特異性輸出的蛋白轉(zhuǎn)位酶的催化亞基,屬于ATP酶的一種,與FliJ和FliH的二聚體相互作用,在向T3SS提供能量方面發(fā)揮著重要作用[6]。但FliI對(duì)銅綠假單胞菌鞭毛功能和生物膜形成的影響未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究構(gòu)建fliI基因缺失株,通過(guò)對(duì)比基因敲除前后菌株運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成能力及鞭毛的形成等方面進(jìn)一步探討,分析fliI對(duì)銅綠假單胞菌鞭毛相關(guān)功能的影響,為銅綠假單胞菌致病機(jī)制的研究及其所致疾病的治療奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 載體和感受態(tài) 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(菌號(hào):ATCC9027)為本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌基因編輯型自殺質(zhì)粒pEX18TC購(gòu)于淼靈生物;大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于武漢技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 LB液體、LB固體培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;DNA Ladder、瓊脂糖均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;I-5TM2×High-Fidelity Master Mix購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司;ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Tet四環(huán)素抗生素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 目的片段的合成及擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) 通過(guò)NCBI查找序列,fliI基因編碼蛋白ID為NP_249795.1,合成包含片段1:606 bp 5′端側(cè)翼序列+fliI(1～399 bp);片段2:fliI(1 081～1 356 bp)+568 bp 5′端側(cè)翼序列,該片段由武漢淼靈生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。根據(jù)合成的片段1和片段2序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物;GM抗性盒擴(kuò)增引物(以現(xiàn)有質(zhì)粒P2322/pUCGM為模板);鑒定引物(F4位于pEX18TC自殺載體上,R4位于目的片段上),見(jiàn)表1。

表1 構(gòu)建fliI基因缺陷特異性質(zhì)粒

1.2 方 法

1.2.1 同源重組構(gòu)建pEX18TC-ΔfliI含同源臂片段1、GM抗性盒、片段2及線性pEX18TC載體的純化產(chǎn)物最終濃度分別為40 ng/μL、45 ng/μL、24 ng/μL及60 ng/μL。按照多片段同源重組酶的計(jì)算公式,重組反應(yīng)所需DNA量=0.02×片段堿基數(shù)/濃度,最終按1∶1∶2∶4的比例分別添加含同源臂片段1、GM抗性盒、片段2及線性載體的DNA產(chǎn)物,50 ℃、15 min進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,質(zhì)粒提取送測(cè)序,命名為pEX18Tc-△fliI。

1.2.2 銅綠假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化 銅綠假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞制備,菌種在LB培養(yǎng)基平板劃線活化,挑單菌落接入10 mL液體LB中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h,按1∶100的接種量接入新鮮的液體LB中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)2～4 h至OD600為0.5左右,將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,冰浴20 min,4 ℃、7 000×g 離心10 min 收集菌體,無(wú)菌蒸餾水洗滌菌體3次,再用75 mmol/L CaCl2溶液洗滌1次,冰浴預(yù)冷的CaCl2溶液處理菌體1 h,加入0.7 mL CaCl2和 0.3 mL 50% 甘油,重懸菌體按每管100 mL分裝。轉(zhuǎn)化條件:75 mmol/L CaCl2,熱激 4.5 min,復(fù)蘇0.5 h。均勻涂布于含Tet四環(huán)素抗生素(10 μg/mL)的LB平板上,經(jīng)鑒定引物(F4位于pEX18TC自殺載體上,R4位于目的片段上)檢測(cè)轉(zhuǎn)化情況,經(jīng)EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切檢測(cè)載體與目標(biāo)條帶大小,構(gòu)建PA YFY22的fliI的基因缺陷株。

1.2.3 菌落形態(tài)的測(cè)定 將PA-ΔfliI與對(duì)照組PA的單菌在LB瓊脂平板上劃線,37 ℃下分別在12 h和24 h觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 掃描電鏡觀察 將PA-ΔfliI與對(duì)照組PA對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液制備成106CFU/mL的菌液100 μL,接種至放有24 mm×24 mm無(wú)菌蓋玻片及10 mL LB肉湯的平皿中培養(yǎng)24～48 h。取出培養(yǎng)皿中的蓋玻片,使用無(wú)菌PBS沖洗2～3遍,將其置于2.5%戊二醛中4 ℃固定12 h。1/15 mol/L PBS(pH為7.2～7.4)漂洗3次,15 min/次;分別在50%、70%、80%、90%及100%叔丁醇梯度脫水;在樣品盒中加入沒(méi)過(guò)樣品的100%叔丁醇,置4 ℃,待叔丁醇結(jié)冰時(shí),置JEOL JFD-320冷凍干燥儀中干燥;將樣品進(jìn)行粘臺(tái):將樣品置JFC-1600離子濺射鍍膜儀中鍍膜,上機(jī)觀察。

1.2.5 運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定 分別將PA-ΔfliI與對(duì)照組PA對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌穿刺接種于LB半固體培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h觀察觀察菌株的運(yùn)動(dòng)性。

1.2.6 生物膜形成能力測(cè)定 取PA-ΔfliI與對(duì)照組PA對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600≈0.5)的菌液100 μL加入96孔板,分別于2、6、10、12 h時(shí)棄去培養(yǎng)板,培養(yǎng)液結(jié)晶紫染色15 min后再用無(wú)菌PBS洗滌3次,自然風(fēng)干,隨后于33%冰乙酸中作用30 min,590 nm條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)孔中溶液的吸光度值(A值),平行3個(gè)重復(fù),計(jì)算其平均值。以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照,A值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度。

2 結(jié) 果

2.1 pEX18TC-ΔfliI載體構(gòu)建fliI基因融合片段連接pEX18Tc載體,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,fliI片段1、GM抗性盒、fliI片段2條帶與預(yù)期位置相符,基因產(chǎn)物大小分別為1 045 bp、791 bp、884 bp,如圖1所示。

A:M.DL5000 DNA marker;1.FliI-target product1;2.FliI-target product2。B:M.DL5000 DNA marker;1.GM抗性盒target product。

2.2 同源重組構(gòu)建PA-ΔfliI將pEX18Tc-ΔfliI熱轉(zhuǎn)入PA YFY22感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)鑒定引物F4、R4(重組后產(chǎn)物445 bp)檢測(cè)和測(cè)序后得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖2A);經(jīng)載體酶切結(jié)果,根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,酶切條帶與預(yù)期位置相符,載體雙酶切后大小為6 321 bp(圖2B)。成功構(gòu)建fliI突變株并命名為PA-ΔfliI。

2.3 PA-ΔfliI菌落形態(tài)的檢測(cè) 對(duì)照組PA菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h、48 h后,呈現(xiàn)直徑1.5～2 mm、圓形、粗糙、半透明、邊緣不整齊、具有遷徙性的菌落(圖3A、3C);PA-ΔfliI菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h、48 h后,呈現(xiàn)直徑約1 mm、圓形、光滑、半透明、邊緣整齊的菌落(圖3B、3D)。

A、C:PA at 24 h,48 h; B、D:PA-ΔfliI at 24 h,48 h

2.4 PA-ΔfliI運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定 在半固體培養(yǎng)基30 ℃靜置培養(yǎng)后,對(duì)照組PA延穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)(圖4A);PA-ΔfliI延穿刺線生長(zhǎng)(圖4B)。PA-ΔfliI的運(yùn)動(dòng)能力下降明顯,敲除fliI基因后銅綠假單胞菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱。

A:PA;B:PA-ΔfliI

2.5 PA-ΔfliI掃描電鏡觀察 經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組PA相比,PA-ΔfliI菌體表面鞭無(wú)明顯減少(圖5),敲除fliI基因?qū)︺~綠假單胞菌鞭毛的形成沒(méi)有影響。

A:PA;B:PA-ΔfliI

2.6 PA-ΔfliI生物膜形成能力的形態(tài)觀察 通過(guò)96孔板培養(yǎng)并用結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn),PA鞭毛相關(guān)基因fliI敲除前生物膜形成較為致密,著色較深(圖6A);敲除后生物膜形成不穩(wěn)定,易脫落且著色較淺(圖6B)。檢測(cè)吸光度值(A值)發(fā)現(xiàn)fliI基因敲除后生物膜形成能力在4 h、6 h、24 h時(shí)明顯降低(t4 h=8.253,P=0.014;t6 h=4.554,P=0.009;t24 h=7.602,P=0.017),說(shuō)明fliI基因敲除后銅綠假單胞菌生物膜形成受到影響(圖7)。

A:PA;B:PA-ΔfliI

*:P<0.05;**:P<0.01

3 討 論

研究表明,細(xì)菌可以分泌多糖類物質(zhì)在體內(nèi)生成生物膜等方式致病[7-9]。越來(lái)越多的研究表明鞭毛除了運(yùn)動(dòng)性以外,致病型菌株可以通過(guò)鞭毛的運(yùn)動(dòng)性增加細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間的接觸而黏附于宿主細(xì)胞,同時(shí)通過(guò)鞭毛蛋白特異性與被感染細(xì)胞的鞭毛受體結(jié)合完成細(xì)菌的黏附和侵襲[10-11]。綿羊腦炎單核細(xì)胞增生李斯特菌flaA基因的缺失,運(yùn)動(dòng)性降低了63.77%,對(duì)宿主的致病性顯著降低[12]。缺失鞭毛的大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力下降,說(shuō)明鞭毛對(duì)宿主細(xì)胞的黏附起重要的作用[13],銅綠假單胞菌的鞭毛相關(guān)基因f1hF缺失后,導(dǎo)致泳動(dòng)和爬行能力缺陷。銅綠假單胞菌的鞭毛合成和調(diào)控牽涉到40多個(gè)基因參與,fliI是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)鞭毛相關(guān)基因[14-15],為鞭毛蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量,促進(jìn)細(xì)菌鞭毛蛋白的輸出[16],是輸出系統(tǒng)中唯一的ATP酶,但其作用機(jī)制尚不清楚[6]。本研究通過(guò)Red同源重組技術(shù)構(gòu)建銅綠假單胞菌鞭毛相關(guān)基因fliI的缺失株。通過(guò)菌落形態(tài)觀察、動(dòng)力試驗(yàn)以及掃描電鏡觀察等,顯示銅綠假單胞菌fliI基因缺失未影響鞭毛的形成,但相較原始株,其菌落遷徙能力減弱,運(yùn)動(dòng)能力顯著下降,由此可判斷該菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和生存能力都受到影響,提示當(dāng)PA-ΔfliI進(jìn)入機(jī)體后運(yùn)動(dòng)能力降低,則有可能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除。

此外,鞭毛除了與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性相關(guān),還可通過(guò)纏繞及釋放粘性物質(zhì)與靜態(tài)及者動(dòng)態(tài)的菌體發(fā)生聚集,這種運(yùn)動(dòng)性能在生物膜的形成中起到非常重要的作用[17]。研究表明,fliC、flaA鞭毛基因缺失分別使大腸桿菌及綿羊腦炎單核細(xì)胞增生李斯特菌體外形成生物膜的能力下降[18-19]。既往研究表明,銅綠假單胞菌能形成完整且致密的生物膜[20],該種生物膜形成后有以下作用:1) 阻滯抗生素的滲透; 2) 吸附抗生素滅活酶; 3) 使膜內(nèi)包裹的細(xì)菌處于休眠狀態(tài),使其對(duì)抗生素敏感性降低; 4) 阻止機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)該菌的清除,使其免疫逃逸和感染持續(xù)等[21-22],因此鞭毛的運(yùn)動(dòng)和黏附作用能夠促進(jìn)生物膜的形成,促進(jìn)細(xì)菌致病[23]。本研究構(gòu)建fliI基因缺陷株,雖然缺陷株并未完全失去生物膜形成能力,但生物膜形成不穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)松散、致密性降低、易脫落,表明fliI基因缺陷菌株形成生物膜能力明顯下降,生物膜明顯減少可能是由于fliI缺失造成鞭毛輸出能量不足,鞭毛運(yùn)動(dòng)能力下降,減少了細(xì)菌初始表面附著,生物膜生成受抑。

本研究結(jié)果表明,fliI基因在銅綠假單胞菌鞭毛形成、運(yùn)動(dòng)和生物膜形成中起著重要作用,直接或者間接影響了PA鞭毛的功能和生物膜的形成。在fliI敲除情況下,細(xì)菌運(yùn)動(dòng)功能基本喪失,導(dǎo)致銅綠假單胞菌生物膜生成顯著減少。鑒于鞭毛和生物被膜在銅綠假單胞菌致病性中的重要作用,我們將通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步闡明fliI的致病作用。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：李琴,周靜茹,張旭華,等.銅綠假單胞菌鞭毛基因fliI的敲除對(duì)其鞭毛形成及生物膜生成的影響[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(9):837-842.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.099