地黃不同炮制品指紋圖譜模式識別及多成分含量測定

張麗先，魏 悅，李飛飛，李智寧，張?zhí)姨?/p>

（1.河南省納普生物技術有限公司，鄭州 450000；2.河南省科學院天然產(chǎn)物重點實驗室，鄭州 450000）

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosaLibosch.）的新鮮或干燥塊根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是著名的“四大懷藥”之一［1］。鮮地黃清熱生津、涼血止血，用于熱病傷陰、舌絳煩渴等病癥；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，用于熱入營血、陰虛發(fā)熱等病癥；熟地黃補血滋陰、益精填髓，用于血虛萎黃、肝腎陰虛等病癥［2］。鮮地黃、生地黃、熟地黃的化學成分不同，藥性迥異，主要化學成分包括以梓醇為代表的環(huán)烯醚萜苷類、以毛蕊花糖苷為代表的苯乙醇苷類、以水蘇糖為代表的低聚糖類等［3，4］。

2020 年版《中華人民共和國藥典》中生地黃以梓醇和地黃苷D，熟地黃以地黃苷D 為質(zhì)量控制指標，指標成分少，不能完整體現(xiàn)從鮮地黃到熟地黃炮制過程中化學成分的變化［2］。目前，對鮮地黃到熟地黃炮制過程中的研究集中在單一炮制過程或單指標成分，缺乏多指標成分全過程的研究［5-7］。本研究建立地黃不同炮制品的HPLC 指紋圖譜分析方法，結合PCA和HCA模式識別方法分析鮮地黃、地黃片、生地黃、熟地黃之間的整體差異，同時對其中的環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇類、核苷類11 種化合物含量進行測定，進而探究11 種化合物在炮制過程中的動態(tài)變化規(guī)律，以期為地黃不同炮制品質(zhì)量評價提供新思路，為地黃藥理藥效及作用機制研究提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

腺苷（批號為110879-200202，純度100%）、梓醇（批號為110808-201711，純度99.6%）、毛蕊花糖苷（批號為111530-201914，純度95.2%）購自中國食品藥品檢定研究院；尿苷（批號為19072210，純度98.5%）、鳥苷（批號為19081902，純度大于98.0%）購自成都普菲德生物技術有限公司；地黃苷D（批號為81720-08-3，純度98.0%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；益母草苷（批號為BP0130，純度98.0%）、密力特苷（批號為BP3251，純度98.0%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；焦地黃苯乙醇苷A（批號為PS012297，純度98.0%）、焦地黃苯乙醇苷B（批號為PS000499，純度97.0%）、異毛蕊花糖苷（批號為PS001059，純度98.0%）購自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純，購自天津市四友精細化學品有限公司；乙酸為分析純；水為娃哈哈純凈水。鮮地黃采自河南省溫縣、博愛縣地黃種植區(qū)，生地黃、熟地黃由本實驗室自行炮制，生地黃采用熱風爐炮制，熟地黃采用酒蒸法炮制，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根，樣品信息見表1。

表1 32 批地黃炮制品來源

1.2 儀器與設備

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），ME 204 型電子天平（梅特勒·托利多儀器上海有限公司，精密度0.1 mg）；AUW 220D 天平（日本島津公司，精密度0.01 mg）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Nucleodur C18 色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相由乙腈（A）和0.2%乙酸水溶液（B）組成，梯度洗脫見表2；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量10 μL。

表2 HPLC 梯度洗脫程序

1.3.2 供試品溶液制備 鮮地黃粉碎，地黃片粉碎過2 號篩；生地黃、熟地黃切成約5 mm×5 mm 的小塊，經(jīng)80 ℃減壓干燥24 h 后，磨成粗粉。精密稱量鮮地黃（2.0 g）、生地黃（0.5 g）、熟地黃（0.5 g）、地黃片（0.5 g），用70%甲醇定容至50 mL，超聲波提取30 min，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，得到鮮地黃、生地黃、熟地黃、地黃片的供試品溶液。70%甲醇溶液為陰性供試品溶液。

1.3.3 混合對照品溶液制備 分別稱取對照品適量，精密稱定，置于100 mL 棕色容量瓶中，以甲醇為溶劑，制得腺苷、尿苷、梓醇、鳥苷、地黃苷D、密力特苷、益母草苷、焦地黃苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B、異毛蕊花糖苷11 種混合對照品溶液，質(zhì) 量 濃 度 依 次 為109.05、78.23、2 231.00、15.11、207.42、65.36、164.45、23.27、12.33、21.26、15.74 mg/L。

1.3.4 線性關系考察 取混合對照品溶液，依次稀釋1、2、5、10、25、50 倍，上機分析，對各成分質(zhì)量濃度（μg/mL）和峰面積進行線性回歸，回歸曲線及線性范圍見表3。

表3 11 種指標成分標準曲線

1.3.5 方法學考察 取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，計算腺苷、尿苷、梓醇、鳥苷、地黃苷D、密力特苷、益母草苷、焦地黃苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B、異毛蕊花糖苷11 種指標成分峰面積的相對標準偏差（RSD），以考察精密度。平行制備S1 號供試品溶液6 份，計算11 種指標成分百分含量的相對標準偏差，以考察重復性。取S1 號供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 測定，計算11 種指標成分峰面積的相對標準偏差，以考察供試品溶液穩(wěn)定性。取S1 樣品6 份，分別精密稱取0.25 g，置50 mL 容量瓶中，加入等量的11 種對照品，70%甲醇定容，超聲波30 min，過膜，上機分析，計算11 種指標成分的平均回收率，以考察方法的準確性。

1.3.6 含量測定及指紋圖譜數(shù)據(jù)采集 分析32 批地黃片、鮮地黃、生地黃、熟地黃樣品溶液、混合對照品溶液及陰性供試品溶液（70%甲醇），采用外標法計算11 種指標成分含量。11 個指標成分中，梓醇、益母草苷、地黃苷D、密力特苷為環(huán)烯醚萜類化合物，毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷A、焦地黃苯乙醇苷B 為苯乙醇類化合物，腺苷、尿苷、鳥苷為核苷類化合物，這些成分的色譜峰響應較大，是地黃中主要的化學成分。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

由表4 可知，精密度考察結果中腺苷、尿苷、梓醇、鳥苷、地黃苷D、密力特苷、益母草苷、焦地黃苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B、異毛蕊花糖苷11 種指標成分峰面積的相對標準偏差為0.72%~1.89%，表明儀器精密度良好。重復性考察中11 種指標成分百分含量的相對標準偏差為0.98%~2.94%，表明方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗中11 種指標成分峰面積的相對標準偏差為0.79%~2.58%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。由表5 可知，加標回收率試驗中11 種指標成分加標回收率為95.05%~102.56%，相對標準偏差為1.78%~3.45%，表明該方法準確可靠。

表5 加標回收率、相對標準偏差結果（單位：%）

2.2 指紋圖譜相似度評價

鮮地黃（S9—S14）、地黃片（S1—S8）、生地黃（S15—S24）、熟地黃（S25—S32）HPLC 色譜圖見圖1、圖2、圖3、圖4。依次將鮮地黃、地黃片、生地黃、熟地黃AIA 格式的色譜圖數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012A 版），利用中位數(shù)法，時間窗寬度設置0.1 min，通過多點校正，色譜峰匹配，生成鮮地黃、地黃片、生地黃、熟地黃的對照圖譜，經(jīng)計算，S1—S8 號地黃片圖譜與對照圖譜的相似度分別為0.987、0.995、0.976、0.978、0.954、0.989、0.985、0.985；S9—S14 號鮮地黃與對照圖譜的相似度 分別 為0.995、0.995、0.969、0.976、0.996、0.998、S15—S24 號生地黃與對照圖譜的相似度分別為0.953、0.980、0.975、0.973、0.938、0.894、0.988、0.991、0.983、0.961。S27—S32 號（不含S25、S26）熟地黃與對照圖譜的相似度分別為0.986、0.987、0.902、0.978、0.923、0.986。

圖1 地黃片HPLC 色譜

圖3 生地黃HPLC 色譜

圖4 熟地黃HPLC 色譜

2.3 色譜峰指認

經(jīng)色譜峰匹配，北京三號地黃樣品有28 個共有峰，指認了其中11 個共有峰（圖5），1 為腺苷（5.62min）、2 為尿苷（6.24 min）、3 為梓醇（6.68 min）、4 為鳥苷（7.26 min）、5 為地黃苷D（9.47 min）、6 為密力特苷（9.69 min）、7 為益母草苷（11.56 min）、8 為焦地黃苯乙醇苷A（21.36 min）、9 為毛蕊花糖苷（23.05 min）、10 為焦地黃苯乙醇苷B（23.34min）、11 為異毛蕊花糖苷（24.27 min）。以3 號色譜峰為參照，1~11號色譜峰相對保留時間分別為0.841、0.934、1.000、1.087、1.410、1.451、1.731、3.198、3.451、3.488、3.633。

圖5 北京三號鮮地黃、地黃片、生地黃、熟地黃、混合對照品及陰性供試品溶液色譜

2.4 主成分分析

PCA 是一種多變量統(tǒng)計方法，它是常用的降維方法，通過正交變換將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為一組線性不相關的變量，提取數(shù)據(jù)的主要特征分量，轉(zhuǎn)換后的變量被稱為主成分，常用于高維數(shù)據(jù)的降維［8］。對32批樣品數(shù)據(jù)進行主成分分析，PC1 和PC2 2 個主成分貢獻率分別為36.29%、33.48%，累積貢獻率為69.77%，能夠概括樣品數(shù)據(jù)的大部分信息。地黃片、鮮地黃、生地黃、熟地黃分別聚為4 類，如圖6 所示，其中，生地黃樣品類間差異較大，熟地黃明顯區(qū)別于地黃片、鮮地黃、生地黃。

2.5 聚類分析

聚類分析是一種根據(jù)變量域之間的相似性而逐步歸群成類的方法，它能客觀地反映這些變量或區(qū)域之間的內(nèi)在組合關系［9］。對32 批樣品進行聚類分析，采用組間聯(lián)接法聚類，以平方Euclidean 距離為指標，結果見圖7。32 批樣品聚為3 類，S1—S14號地黃片、鮮地黃樣品聚為一類，生地黃（S15—S24）、熟地黃（S25—S32）各聚為一類，聚類結果與PCA 結果基本一致。

圖7 32 批地黃樣品聚類分析結果

2.6 多指標成分含量測定

陰性供試品溶液、北京三號鮮地黃、北京三號地黃片、北京三號生地黃、北京三號熟地黃及混合對照品色譜見圖5，11 種指標成分外標法含量（n=3）計算結果見表6。分析同一產(chǎn)地同一品種地黃樣品在炮制過程指標成分含量的變化，發(fā)現(xiàn)11 個指標成分變化規(guī)律各不相同，腺苷、尿苷在鮮地黃到熟地黃炮制過程中，含量整體呈增加趨勢；梓醇在鮮地黃到熟地黃炮制過程中含量整體呈降低趨勢，且變化明顯；鳥苷在鮮地黃到生地黃炮制過程中整體呈增加趨勢，在生地黃到熟地黃炮制過程中含量整體呈降低趨勢；地黃苷D 變化不明顯；密力特苷在生地黃中含量較高，熟地黃中含量較低；益母草苷在鮮地黃到生地黃炮制過程中含量變化不明顯，在生地黃到熟地黃炮制過程中含量降低；焦地黃苯乙醇苷A 和焦地黃苯乙醇苷B 在炮制過程中含量處于動態(tài)變化中；毛蕊花糖苷在生地黃到熟地黃炮制過程中含量降低明顯。

表6 32 批地黃不同炮制品中11 種指標成分的含量 （單位：%）

3 小結與討論

3.1 提取條件優(yōu)化

考察了30%、70%、100%甲醇為提取溶劑時的提取效率，選擇70%甲醇為提取溶劑；考察了超聲波、回流提取2 種提取方法，發(fā)現(xiàn)無顯著差異，為操作便利，選擇超聲波提取；考察了10、30、60 min 提取時間，發(fā)現(xiàn)30 min 與60 min 色譜圖無顯著差異，為節(jié)約分析時間，提取時間選擇30 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

有機相為乙腈時，色譜峰分離效果優(yōu)于甲醇；另外對比了0.1%乙酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%磷酸水溶液為水相時色譜峰分離效果，最終選擇乙腈-0.2%乙酸水溶液為流動相；檢測波長為203 nm時，11 個色譜峰響應值大于其他波長條件下的響應值，且基線平穩(wěn)，分離度良好；再通過進一步優(yōu)化洗脫程序，最終確定色譜條件。

3.3 指紋圖譜分析

本試驗建立的HPLC 指紋圖譜結合了PCA、HCA 模式識別方法能較好地評估地黃從采收到炮制成品過程中的變化，不同地黃產(chǎn)品差異可通過PCA、HCA 結果直觀地顯現(xiàn)出來。PCA 結果中來自鮮地黃、地黃片、生地黃、熟地黃的32 批樣品分為4類，熟地黃明顯區(qū)別于地黃片、鮮地黃、生地黃，表明熟地黃與其他樣品差異顯著；HCA 結果中，當歐氏距離為5 時，32 批樣品聚為3 類，鮮地黃和地黃片聚為一類，不同的模式識別方法之間有一定的差異，可根據(jù)具體情況選擇合適的數(shù)據(jù)處理模式。

3.4 含量測定分析

在鮮地黃到熟地黃炮制過程中，環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇含量較高，且在地黃不同炮制品中含量變化較大，初步推斷梓醇可能是導致地黃不同入藥形式差異的重要原因，其他環(huán)烯醚萜苷成分變化較??；核苷類成分整體呈增加趨勢；苯乙醇苷類化合物含量較低，整體上含量呈降低趨勢。