基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)評價栽培與野生五指毛桃質(zhì)量*

楊小催，郭凱欣，李燕芳，唐 慧，張慶業(yè)，潘海華，鄭麗思，柯雪紅△

（1. 廣東省清遠市中醫(yī)院，廣東清遠 511500； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405； 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

五指毛桃為?？浦参锪颜崎臚icus simplicissimaLour. 的干燥根，有廣東人參之美稱，分布于廣東、福建、廣西等地。有五爪龍、土北芪、五指香等別名，為嶺南地區(qū)少數(shù)民族特別是瑤族、壯族的常用藥［1］，最早記載于《生草藥性備要》，具有健脾補肺、行氣利濕、舒筋活絡(luò)之功效，主治脾虛浮腫、食少腹脹、肢倦無力、肺虛痰喘、帶下、盜汗、水腫、風(fēng)濕痹痛、產(chǎn)后無乳、跌打損傷等［2-3］。五指毛桃以五爪龍之稱收載于我國1977 年版《中國藥典（一部）》，是現(xiàn)行《中國藥典》品種宮炎平片處方中包含的主要藥材之一［4］，并收錄于2013 年版《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）》［5］。廣東省清遠市地處粵北山區(qū)，是我國瑤族一大聚居區(qū)。五指毛桃作為道地瑤藥材被廣泛研究與應(yīng)用，其資源以野生為主，隨著土地資源的減少和過度開采，導(dǎo)致五指毛桃的野生資源量下降，無法滿足市場需求，故其栽培品逐漸增多［6］。目前，尚未見野生與栽培五指毛桃藥材指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的研究，限制了五指毛桃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及開發(fā)應(yīng)用。本研究中收集廣東省清遠市不同地區(qū)（連山、連南、英德、清城）的21批野生五指毛桃藥材及市售不同品牌的10 批栽培五指毛桃藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法［7-8］構(gòu)建指紋圖譜并測定其中補骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補骨脂素的含量，同時采用層次聚類分析（HCA）［9-10］、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）進行化學(xué)計量學(xué)評價，為五指毛桃藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及開發(fā)應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），包括Empower2 色譜工作站、Waters2996 二極管陣列檢測器；XS105 DualRange 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；SK3310LHC 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率為180～350 W，頻率為35/ 53 kHz）；Thermo Legend Micro 17R型離心機（德國Thermo公司）。

1.2 試藥

補骨脂素對照品（批號為110739-201918，純度為99.6%），芹菜素對照品（批號為111901-202004，純度為99.4%），5-甲氧基補骨脂素對照品（批號為520036-201401，純度為99.2%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水；五指毛桃藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院袁小紅教授鑒定均為正品，其藥材樣品信息見表1。

表1 栽培與野生五指毛桃藥材樣品信息Tab.1 Sample information of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～10 min 時5%A →10%A，10～50 min 時10%A →30%A，50～65 min 時30%A →45%A，65～85 min 時45%A →90%A，85～87 min 時90%A →5%A，87～92 min 時5%A）；流速：1.0 mL/ min；運行時間：92 min；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

取補骨脂素、芹菜素、5 - 甲氧基補骨脂素對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含補骨脂素0.050 4 mg、芹菜素0.016 18 mg、5 - 甲氧基補骨脂素0.050 2 mg的混合對照品溶液。

取五指毛桃藥材樣品粉末0.2 g，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加3 mL 50%甲醇，靜置4～5 h，超聲（功率為350 W，頻率為35 kHz）提取30 min，用50%甲醇定容至5 mL，離心（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min）10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗：取樣品（編號為S1）粉末適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄色譜圖。以13 號峰（補骨脂素）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別低于1%和2.6%（n= 6）；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）計算的相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S1）粉末適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以13 號峰（補骨脂素）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別低于2.4%和3.0%；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）計算的相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S1）粉末適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以13 號峰（補骨脂素）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別低于1%和2.4%（n= 6），采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）計算的相似度均大于0.99，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 五指毛桃指紋圖譜建立

特征峰及主要色譜峰指認：通過對10 批栽培五指毛桃HPLC 色譜圖的考察與比較，最終標(biāo)定19 個共有峰，其峰面積占總峰面積的比例超過90%。與對照品比對，可指認3 個色譜峰，其中13 號峰、15 號峰、16 號峰分別為補骨脂素、芹菜素和5-甲氧基補骨脂素，對應(yīng)保留時間分別為43.16，48.25，52.84 min。詳見圖1。其中，13 號峰（補骨脂素）未與其他峰重疊，即分離度較好，峰強度較其他峰高，故以此峰作為參照峰。

圖1 五指毛桃供試品溶液與混合對照品溶液高效液相色譜圖13.Psoralen 15.Apigenin 16.5-MethoxypsoralenA.Test solution of Cultivate Fici Simplicissimae Radix B.Test solution of Wild Fici Simplicissimae Radix C.Mixed reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the test solution and mixed reference solution of Fici Simplicissimae Radix

HPLC 指紋圖譜對比：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）計算的相似度均大于0.99，對10 批栽培五指毛桃藥材樣品的數(shù)據(jù)進行分析。采用多點校正后進行自動匹配，以10 批栽培五指毛桃藥材樣品均數(shù)為共有模式，建立10 批栽培五指毛桃與21 批五指毛桃對照圖譜。對照圖譜中有3 個特征峰群，1～12 號為特征峰群A，保留時間在0～37 min，其中，1～4 號峰峰面積逐漸增大，5～12 號峰峰面積較小且大小接近，12 個峰占總色譜峰峰面積的12%；13～16 號為特征峰群B，保留時間在43～54 min，13號峰較大，14～16號峰逐漸增大，4 個峰占色譜峰峰面積的75%；17～19 號為特征峰群C，保留時間在69～78 min，且3 個峰的峰面積接近。將獲得的10 批栽培五指毛桃與21 批野生五指毛桃共有模式進行比較，結(jié)果顯示，野生五指毛桃無特征峰群A 的2，10，11，12 號峰，特征峰群B 和C 是兩者共有的，但峰面積比例差異較大。詳見圖2至圖3。

圖2 栽培與野生五指毛桃高效液相色譜疊加指紋圖譜A.Cultivated Fici Simplicissimae Radix（sample numbers S22-S31）B.Wild Fici Simplicissimae Radix（sample numbers S1-S21）Fig.2 HPLC overlay fingerprints of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

圖3 野生（M1）與栽培（M2）五指毛桃對照圖譜Fig.3 Reference chromatogram of wild Fici Simplicissimae Radix（sample number M1）and cultivated Fici Simplicissimae Radix（sample number M2）

共有峰面積比較：比較栽培五指毛桃與野生五指毛桃的共有峰面積，結(jié)果顯示兩者峰面積差異較明顯，主要表現(xiàn)在野生五指毛桃特征峰群A的2，8，10，11，12號峰；特征峰群B 和C 為兩者共有，特征峰群B 峰面積所占比例差異較大，在特征峰群B 中13，14，15，16號峰野生五指毛桃與栽培五指毛桃的比例分別為47∶1∶3∶13和33∶1∶1∶33。

相似度評價：根據(jù)10批栽培五指毛桃指紋圖譜測定結(jié)果，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）計算不同批次栽培五指毛桃的相似度，結(jié)果為0.847～0.947。對21 批野生五指毛桃進行內(nèi)部相似度分析，結(jié)果指紋圖譜相似度為0.982～0.998，表明內(nèi)部相似度結(jié)果良好。以栽培五指毛桃的共有模式作為21 批野生五指毛桃的對照圖譜，計算得野生五指毛桃的相似度為0.503～0.594，相似度結(jié)果較低。詳見表2。

表2 野生與栽培五指毛桃指紋圖譜相似度Tab.2 Similarity of HPLC fingerprints of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

HCA：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）將10批栽培五指毛桃與21批野生五指毛桃的指紋圖譜進行處理，獲得HPLC 色譜峰峰面積數(shù)據(jù)（量化指紋特征）。采用IBM SPSS Statistics 26 統(tǒng)計學(xué)軟件，將變量設(shè)為峰面積進行HCA，在得到的31批五指毛桃樣品指紋圖譜中采用13號峰（補骨脂素）為對照的19個色譜峰相對峰面積，以歐氏距離平方為聚類統(tǒng)計量、橫坐標(biāo)為樣品編號、縱坐標(biāo)為臨界值（不同類別之間的距離），獲得31 批五指毛桃樣品HCA 圖（圖4）。臨界值越小，譜圖相似度越高。結(jié)果顯示，當(dāng)臨界值為25時，31批樣品可聚為兩大類，編號為S1 - S21（均為野生五指毛桃）的樣品聚為一類，編號為S22 - S31（均為栽培五指毛桃）的樣品聚為一類；當(dāng)臨界值為1時，編號為S1-S3（產(chǎn)地為清遠連山）的樣品聚為一類；編號為S22、S30、S31（金綠生品牌）的樣品聚為一類；當(dāng)臨界值為2時，編號為S23、S26、S28（仙逸堂品牌）的樣品聚為一類。聚類結(jié)果較理想，可有效地將栽培五指毛桃與野生五指毛桃2 個品種區(qū)分，還能將不同野生產(chǎn)地及不同飲片加工品牌進行區(qū)分。

圖4 栽培與野生五指毛桃藥材樣品的層次聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

PCA：采用SIMCA-P14.0 軟件［11］，以10 批栽培五指毛桃與21 批野生五指毛桃樣品的19 個共有峰的峰面積為X變量、樣品批次為Y變量進行無監(jiān)督的PCA。結(jié)果顯示，PCA 圖中大部分野生五指毛桃樣本群與栽培五指毛桃樣本群被分成不同的空間聚落，區(qū)分效果明顯。栽培五指毛桃聚落分布較緊湊；野生五指毛桃聚落分布較分散，離散度大于栽培五指毛桃樣本。詳見圖5。

圖5 栽培與野生五指毛桃藥材樣品主成分分析得分圖Fig.5 Scattered plots of PCA of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

PLS-DA：在PCA結(jié)果的基礎(chǔ)上，進一步做有監(jiān)督的PLS-DA，結(jié)果識別模型的解釋度（R2X）為0.66，模型的預(yù)測度（Q2）為0.794。對栽培五指毛桃與野生五指毛桃進行分組比較（圖6），區(qū)分效果明顯，此結(jié)果與PCA 的結(jié)果相吻合。根據(jù)分組的貢獻率（VIP）進行排序（圖7）。其中，峰15（芹菜素）、峰13（補骨脂素）、峰16（5-甲氧基補骨脂素）、峰3、峰12、峰8 的VIP 值均大于1.0，表明這6 個組分可能為栽培五指毛桃與野生五指毛桃的質(zhì)量差異標(biāo)志物，即以上6個化學(xué)組分在栽培五指毛桃與野生五指毛桃中顯示一定差異性。

圖6 栽培與野生五指毛桃藥材樣品PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score plot of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

圖7 19個共有峰對分組的貢獻值（VIP值）Fig.7 Variable importance of projection（VIP）of the 19 common peaks for grouping

2.6 含量測定

2.6.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項下混合對照品溶液2，4，8，12，16，20μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，以含量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 補骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補骨脂素線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test of psoralen，apigenin and 5-methoxypsoralen

精密度試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果補骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補骨脂素峰面積的RSD分別為0.56%，0.58%，0.56%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S1）粉末0.2 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果補骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補骨脂素峰面積的RSD分別為0.87%，1.12%，0.96%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S1）粉末0.2 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣檢測定，記錄峰面積。結(jié)果補骨脂素、芹菜素、5 - 甲氧基補骨脂素的平均含量分別為每100 g藥材含0.065 7，0.007 5，0.022 5 g，RSD分別為1.24%，1.32%，1.27%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取樣品（編號為S1）粉末0.1 g，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，分別加入一定量的補骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補骨脂素，平行6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.6.2 樣品含量測定

取栽培五指毛桃與野生五指毛桃藥材樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各成分的含量，比較野生五指毛桃與栽培五指毛桃兩者的差異［12-13］。結(jié)果見表5。

表5 栽培與野生五指毛桃中3種成分含量測定結(jié)果（g/100 g，n=3）Tab.5 Results of the content determination of the three components in cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix（g/100 g，n=3）

3 討論

3.1 指紋圖譜共有模式選擇

相似度評價采用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版），共有模式按平均值法生成。本研究中將10批栽培五指毛桃和21批野生五指毛桃數(shù)據(jù)同時導(dǎo)入軟件建立共有模式，因兩者雖有部分共有峰，但峰面積及峰面積比例差異明顯，生成的共有模式融合了兩者的特征。以10 批栽培五指毛桃的色譜圖生成的對照圖譜作為共有模式，結(jié)果顯示，10 批栽培五指毛桃相似度均高于0.84，表明各批栽培五指毛桃的化學(xué)成分種類及性質(zhì)相似。21 批野生五指毛桃相似度均低于0.6，表明以栽培五指毛桃指紋圖譜為共有模式能有效區(qū)分栽培五指毛桃與野生五指毛桃。

3.2 色譜條件選擇

預(yù)試驗中，分別考察甲醇-水、乙腈-水溶液流動相體系進行等度洗脫的效果，結(jié)果在以乙腈- 水得到的指紋圖譜中能較完整地將主要色譜峰分離，并得到較平穩(wěn)的基線，有利于采集指紋圖譜的數(shù)據(jù)，進一步保障了數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；選擇230，250，270，320 nm 作為檢測波長，結(jié)果于不同波長處各色譜峰有較大差異，綜合考慮，選定于320 nm 波長處測定，色譜峰數(shù)量較多，各峰之間分離度較好，基線較平穩(wěn)。

3.3 含量測定指標(biāo)成分選擇

由圖7 可知，VIP 值排序居前3 的成分分別為芹菜素（峰15）、補骨脂素（峰13）、5-甲氧基補骨脂素（峰16），五指毛桃主要有效成分為補骨脂素、芹菜素等香豆素及黃酮類成分［14-16］。本研究結(jié)果顯示，10 批栽培五指毛桃3 種化學(xué)成分的平均含量分別為每100 g 藥材含0.090 3，0.007 7，0.022 9 g，而21 批野生五指毛桃的平均含量分別為每100 g 藥材含0.092 1，0.000 8，0.022 0 g。栽培五指毛桃的芹菜素含量明顯高于野生五指毛桃，與藥材品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)等有關(guān)。故選用上述最具代表性的3個成分進行含量測定。

3.4 方法評價

本研究中采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法構(gòu)建質(zhì)控模式［17-20］，可將栽培五指毛桃與野生五指毛桃有效區(qū)分，體現(xiàn)出品種之間的量化差異。HCA 和PCA 結(jié)果基本一致，且與實際相符，說表明本研究中建立的識別模式直觀、合理、可行，可作為五指毛桃質(zhì)量評價主要依據(jù)。但因藥材取樣的局限性，本研究結(jié)果不能完全代表各產(chǎn)地栽培五指毛桃與野生五指毛桃的質(zhì)量差異，應(yīng)進一步擴大藥材樣品收集范圍或進行其他方面的深入分析，以提高其研究的科學(xué)性。