劉公言 閆先峰 吳志強(qiáng) 張 印 張?jiān)坪?張雅佳 周貝貝 任啟峰 孫海濤*
(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250100;2.山東省畜牧總站,濟(jì)南 250100;3.平邑縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心,平邑 273300)
消化道疾病是家兔最為多發(fā)的疾病之一,仔兔腹瀉是困擾家兔生產(chǎn)的一個(gè)重大問(wèn)題,尤其是在斷奶階段[1-2]??股卦粡V泛用于預(yù)防和治療動(dòng)物消化道疾病,這不僅導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加,而且會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)及食品安全的關(guān)注,抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在畜禽養(yǎng)殖中所造成的副作用日益增加。我國(guó)也于2020年全面禁止在飼料中添加抗生素,因此,抗生素替代物的開(kāi)發(fā)利用成為當(dāng)務(wù)之急[3]。益生菌、酶制劑和植物提取物具有綠色、安全、生態(tài)等突出優(yōu)點(diǎn),成為新型飼料添加劑的首選。益生菌能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡,發(fā)揮預(yù)防及治療疾病的功效。飼糧中添加丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等益生菌能夠改善豬、家兔、鱸魚(yú)等動(dòng)物腸道菌群組成,提高機(jī)體抗氧化能力和免疫功能,對(duì)維持腸道健康具有重要意義[4-6]。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)是一種有氧脫氫酶,能夠催化β-D-葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。Wang等[7]研究表明,飼糧中單獨(dú)添加葡萄糖氧化酶及分解淀粉芽孢桿菌SC06與葡萄糖氧化酶配合使用可提高肉雞抗氧化能力和免疫功能,改善腸道菌群組成,且分解淀粉芽孢桿菌SC06與葡萄糖氧化酶配合使用的效果優(yōu)于單獨(dú)添加葡萄糖氧化酶。迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)提取物作為一種重要的植物提取物,具有多種藥理和生物活性。飼糧中添加迷迭香提取物可以改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、抗氧化能力、腸道形態(tài)和微生物區(qū)系,適宜添加劑量為200 mg/kg[8]。此外,迷迭香提取物作為肉兔飼料添加劑能夠降低兔肉中膽固醇含量,增加肌肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,提高肌肉抗氧化能力[9]。Yadollahi等[10]研究了飼料中添加維生素E、益生菌、蝦青素或迷迭香提取物對(duì)虹鱒魚(yú)生長(zhǎng)性能、血液學(xué)指標(biāo)、抗氧化和肝臟酶活性的影響,結(jié)果表明飼料中添加維生素E(50 μg/kg)復(fù)配迷迭香提取物(50 mg/kg)或桿菌益生菌(500 mg/kg)可以有效地維持虹鱒魚(yú)的健康狀況。本試驗(yàn)在前期開(kāi)展的丁酸梭菌、迷迭香提取物等單品的試驗(yàn)結(jié)果[5,9]基礎(chǔ)上,探討飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能、屠宰性能、免疫功能和盲腸微生物區(qū)系的影響,為家兔新型、綠色、安全的替抗產(chǎn)品研發(fā)提供理論參考。
試驗(yàn)選用28日齡斷奶的體重相近、健康狀況良好的商品伊拉肉兔500只(公母各占1/2),隨機(jī)分為5組,每組10個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10只。對(duì)照組(Ⅰ組)飼喂基礎(chǔ)飼糧,根據(jù)前期丁酸梭菌、迷迭香提取物等單品的試驗(yàn)結(jié)果[5,9],試驗(yàn)組分別飼喂添加100 g/t丁酸梭菌+1 kg/t迷迭香提取物(Ⅱ組)、100 g/t丁酸梭菌+100 g/t葡萄糖氧化酶(Ⅲ組)、1 kg/t迷迭香提取物+100 g/t葡萄糖氧化酶(Ⅳ組)及100 g/t丁酸梭菌+1 kg/t迷迭香提取物+100 g/t葡萄糖氧化酶(Ⅴ組)的試驗(yàn)飼糧。飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參考《肉兔營(yíng)養(yǎng)需要量》(NY/T 4049—2021)[11],基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。經(jīng)7 d預(yù)試期后進(jìn)入30 d正試期。
試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,每個(gè)重復(fù)選取1只與該重復(fù)平均體重相近的家兔屠宰,用于統(tǒng)計(jì)屠宰性能;同時(shí)采集十二指腸、空腸、回腸黏膜和盲腸內(nèi)容物樣品,用于十二指腸抗氧化指標(biāo)、空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、回腸黏膜免疫指標(biāo)和盲腸微生物區(qū)系測(cè)定。
1.3.1 生長(zhǎng)性能
在試驗(yàn)正式開(kāi)始(35日齡)和結(jié)束當(dāng)日(65日齡),稱(chēng)量每個(gè)重復(fù)家兔重量,統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間每個(gè)重復(fù)采食量,計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)比。以重復(fù)為單位,計(jì)算試驗(yàn)期間家兔腹瀉率和成活率[6]。
1.3.2 屠宰性能
試驗(yàn)兔屠宰前稱(chēng)重,記錄宰前活體重,屠宰后依次對(duì)歐洲胴體重、半凈膛胴體重和全凈膛胴體重以及心臟、肝臟和腎臟進(jìn)行稱(chēng)重,計(jì)算歐洲屠宰率、半凈膛屠宰率、全凈膛屠宰率以及心臟、肝臟和腎臟相對(duì)重量[12]。
1.3.3 十二指腸抗氧化指標(biāo)
十二指腸谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定(貨號(hào)分別為:A005、A001-1、A003-1和A015)。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.3.4 空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)
采集3 cm空腸樣品置于4%多聚甲醛固定液固定,固定良好后進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片。使用正置白光拍照顯微鏡(Nikon,Eclipse Ci-L)拍照,選取小腸組織的目的區(qū)域進(jìn)行40倍成像,成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件,分別測(cè)量每張切片中5處完整腸絨毛高度、絨毛寬度、隱窩寬度、黏膜層厚度和肌層厚度,取平均值,同時(shí)計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。
1.3.5 回腸黏膜免疫指標(biāo)
回腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量使用江蘇晶美生物科技有限公司酶聯(lián)聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定(貨號(hào)分別為:JM-00776R1、JM-00660R1、JM-00710R1、JM-00621R1和JM-00722R1)。
1.3.6 盲腸微生物區(qū)系
采集盲腸內(nèi)容物樣品,置于液氮保存,委托北京諾禾致源科技股份有限公司提取DNA,基于Illumina Nova測(cè)序平臺(tái)測(cè)序,構(gòu)建PCR-free文庫(kù),然后進(jìn)行雙末端(paired-end)測(cè)序,檢測(cè)微生物區(qū)系多樣性。
采用SAS 9.4.0統(tǒng)計(jì)軟件中的GLM程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析,采用Duncan氏法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較,結(jié)果以平均值和均方根誤差(root mean square error,RMSE)表示,P<0.05為差異顯著。
由表2可知,在初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)的情況下,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔終末體重、平均日增重、料重比、成活率和腹瀉率有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅴ組的終末體重、平均日增重和成活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),腹瀉率顯著低于對(duì)照組(P<0.05);Ⅳ組的料重比顯著高于Ⅴ組(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔平均日采食量無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表2 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響
由表3可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔宰前活體重有顯著影響差異(P<0.05)。其中,Ⅴ組的宰前活體重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔歐洲屠宰率、半凈膛屠宰率和全凈膛屠宰率以及心臟、肝臟和腎臟相對(duì)重量無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表3 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔屠宰性能的影響
由表4可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔十二指腸GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅱ組、Ⅳ組和Ⅴ組的十二指腸GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05),Ⅳ組和Ⅴ組的十二指腸MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的十二指腸T-AOC顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔十二指腸SOD活性無(wú)顯著影響(P<0.05)。
表4 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔十二指腸抗氧化指標(biāo)的影響
由表5可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔空腸絨毛高度有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅴ組的空腸絨毛高度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔空腸絨毛寬度、隱窩深度、黏膜層厚度、肌層厚度和絨毛高度/隱窩深度無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表5 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
由表6可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔回腸黏膜sIgA、TNF-α和IFN-γ含量有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的回腸黏膜sIgA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),回腸黏膜IFN-γ含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05);Ⅴ組的回腸黏膜TNF-α含量顯著高于其他各組(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔回腸黏膜IL-2和IL-6含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表6 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔回腸黏膜免疫指標(biāo)的影響
2.6.1 擴(kuò)增子序列變體(amplicon sequence variants,ASVs)分析
為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠,首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾,得到有效數(shù)據(jù);然后基于有效數(shù)據(jù)通過(guò)DADA2進(jìn)行降噪,并過(guò)濾掉相對(duì)豐度小于5的序列,從而獲得最終的ASVs,各組ASVs分布韋恩圖見(jiàn)圖1。
圖1 ASVs分布韋恩圖
2.6.2 α多樣性指數(shù)分析
由表7可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸微生物菌群ASVs數(shù)量和Chao1指數(shù)有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅴ組的盲腸微生物菌群ASVs數(shù)量和Chao1指數(shù)顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅳ組(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸微生物菌群Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和測(cè)序深度指數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。
2.6.3 盲腸微生物物種豐富度分析
2.6.3.1 門(mén)水平分析
由表8可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸疣微菌門(mén)(Verrucomicrobiota)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)相對(duì)豐度有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅲ組和Ⅴ組的盲腸疣微菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的盲腸酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
2.6.3.2 屬水平分析
由表9可知,飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸克曼菌屬(Akkermansia)、果膠單核菌屬(Monoglobus)、馬賽菌屬(Massilia)和疣微菌屬UCG-010(Verrucomicrobium_UCG-010)相對(duì)豐度有顯著影響(P<0.05)。其中,Ⅲ組和Ⅴ組的盲腸克曼菌屬相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Ⅳ組和Ⅴ組的盲腸果膠單核菌屬相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的盲腸疣微菌屬UCG-010相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的盲腸馬賽菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
益生菌、酶制劑和植物提取物具有綠色、安全、生態(tài)等突出優(yōu)點(diǎn),成為新型綠色飼料添加劑的首先。丁酸梭菌能夠代性產(chǎn)生丁酸,具有廣泛的生物學(xué)功能,飼糧中添加丁酸梭菌可改善生豬、家禽和反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[13-15]。葡萄糖氧化酶作為一種需氧脫氫酶,能夠氧化分解葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸,促進(jìn)動(dòng)物腸道健康,提高生長(zhǎng)性能。飼糧中添加葡萄糖氧化酶能夠提高肉仔雞生長(zhǎng)性能、回腸表觀氨基酸消化率和回腸微生物區(qū)系,且分解淀粉芽孢桿菌SC06與葡萄糖氧化酶配合使用效果優(yōu)于單獨(dú)添加葡萄糖氧化酶[7,16]。迷迭香提取物具有多種藥理和生物活性,飼糧中添加迷迭香提取物可以改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、抗氧化能力和免疫功能[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方能夠提高肉兔生長(zhǎng)性能,降低腹瀉率,這與前人研究報(bào)道基本一致。
表7 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸微生物α多樣性指數(shù)的影響
表8 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸菌群門(mén)水平的影響(前10位)
表9 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)肉兔盲腸菌群屬水平的影響(前20位)
續(xù)表9項(xiàng)目Items組別 GroupsⅠ(對(duì)照 Control)ⅡⅢⅣⅤ均方根誤差 RMSEP值P-value梭菌屬vadinBB60群 Clostridium_vadinBB60_group1 921.12 254.42 477.32 505.5820.91 377.491 00.110 9馬賽菌屬M(fèi)assilia1 269.5a111.1b66.1b71.9b0.0b794.456 30.012 7V9D2013群 V9D2013_group968.31 370.31 265.61 774.11 445.1962.882 30.573 8瘤胃球菌屬 Ruminococcus1 944.11 964.11 773.12 533.81 971.0809.376 90.409 6NK4A214群 NK4A214_group853.01 106.91 202.01 296.11 615.5689.683 70.287 9瘤胃球菌科Ruminococcaceae964.4838.9906.8651.6923.6767.129 70.932 7優(yōu)桿菌屬西雷姆群 Eubacterium_siraeum_group1 142.91 815.51 597.61 649.41 436.8571.375 00.199 7青枯菌屬 Ralstonia10.53.6166.9326.14.4425.219 00.478 4克里斯滕森菌科R-7群 Christensenellaceae_R-7_group649.4692.6691.8760.4632.0475.502 20.985 8疣微菌屬UCG-010 Verrucomicrobium_UCG-010544.9b767.0ab1 024.0a1 030.0a1 011.9a373.533 20.048 8WPS-2454.8141.079.380.80.0320.059 00.064 6甲烷芽孢桿菌屬 Methanobrevibacter23.8168.8607.8398.578.8434.465 30.059 3芽孢桿菌屬 Bacillus443.4107.9192.8262.40.0413.886 30.287 7考拉桿菌屬 Phascolarctobacterium106.8354.141.0121.131.9288.964 70.186 6理研菌科RC9腸道群Rikenellaceae_RC9_gut_group390.8216.6260.8513.537.1459.145 80.314 3鞘氨醇單胞菌屬 Sphingomonas359.9191.568.446.50.0262.990 20.065 4
丁酸梭菌具有抑制腸道致病菌侵入的功能,在維持動(dòng)物腸道健康方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[17-20]。此外,Huang等[21]研究報(bào)道,在家兔飼糧中添加丁酸梭菌能夠提高小腸腸絨毛高度和促進(jìn)回腸sIgA的分泌。飼糧中添加葡萄糖氧化酶可以促進(jìn)腸道屏障的完整性,對(duì)改善霉菌毒素造成肉雞肝臟氧化應(yīng)激具有一定緩解功能[22-23]。迷迭香提取物中含有較高的多酚及黃酮含量,具有較大的自由基清除活性,迷迭香提取物可能通過(guò)增加抗氧化能力減少應(yīng)激對(duì)虹鱒魚(yú)的影響[24-26]。Hadree等[27]研究報(bào)道迷迭香提取物和維生素E具有降低氧化應(yīng)激和激活新西蘭白兔的抗氧化保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方對(duì)能夠提高肉兔小腸絨毛高度、抗氧化能力和sIgA含量,對(duì)維持腸道健康具有重要作用。
家兔盲腸內(nèi)富含大量微生物,在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、代謝和腸黏膜免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和種類(lèi)是影響籠養(yǎng)家兔盲腸微生物區(qū)系組成的重要因素[28-30]。在門(mén)水平上,家兔盲腸內(nèi)容物相對(duì)豐度最大是厚壁菌門(mén),其次是擬桿菌門(mén),厚壁菌門(mén)與碳水化合物和蛋白質(zhì)的吸收有關(guān),擬桿菌門(mén)主要是促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵、吸收和降解多糖,這兩大菌門(mén)的穩(wěn)定對(duì)促進(jìn)肉兔腸道健康十分重要[31-32]。大量研究表明,丁酸梭菌可通過(guò)增加牛、豬、鴨等動(dòng)物腸道微生物菌群多樣性,增強(qiáng)腸道屏障功能和免疫系統(tǒng)[33-35]。此外,飼糧中添加250 U/kg葡萄糖氧化酶也可以提高肉仔雞第22~42天的生長(zhǎng)性能,這與腸道形態(tài)、短鏈脂肪酸組成和回腸微生物組成的改變有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方能夠影響肉兔盲腸微生物菌群中疣微菌門(mén)和酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度,影響肉兔盲腸微生物菌群中克曼菌屬、果膠單核菌屬、馬賽菌屬和疣微菌屬UCG-010相對(duì)豐度。然而,目前家兔盲腸微生物菌屬的變化與生長(zhǎng)性能的關(guān)系尚不清楚。因此,需要更多的研究來(lái)理解家兔生長(zhǎng)性能和盲腸內(nèi)各種微生物群之間的相互關(guān)系。
飼糧中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物組方能夠改善肉兔小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和盲腸微生物區(qū)系,提高腸道黏膜免疫功能和機(jī)體抗氧化能力,有益于維持腸道健康,降低腹瀉率,提高生長(zhǎng)性能。
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2023年9期