斷奶馬駒小腸菌群多樣性分析

李佳豪 李 倩 陳 暉 陳開旭 李曉斌*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆馬繁育與運(yùn)動生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052)

動物腸道中棲居著大量的微生物,這些微生物直接參與宿主的諸多生理活動,包括促進(jìn)消化道發(fā)育、提高宿主對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、減緩腸道應(yīng)激和提高腸道免疫等[1-3]。馬屬動物小腸主要以化學(xué)消化為主,是蛋白質(zhì)、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物和脂肪消化的主要場所。小腸中也有豐富的微生物,十二指腸和空腸的細(xì)菌數(shù)量為2.90×106CFU/g,回腸的細(xì)菌數(shù)量為38.4×106CFU/g[4]。研究表明,馬消化道相鄰區(qū)段的菌群多樣性和豐富度存在差異,而這種差異一定程度上可能是導(dǎo)致宿主腸道消化、生理等機(jī)能差異的原因[5]。斷奶應(yīng)激會導(dǎo)致動物胃腸道組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生劇烈變化,進(jìn)而影響動物的生長發(fā)育[6]。因此,了解斷奶后幼齡動物腸道菌群的多樣性和豐富度,對于調(diào)控幼齡動物腸道菌群結(jié)構(gòu)和緩解斷奶應(yīng)激具有重要意義。目前,關(guān)于馬腸道菌群的研究主要集中在糞便[7-8],對馬不同腸段中菌群結(jié)構(gòu)和種類的研究鮮見。糞便只能代表后腸道遠(yuǎn)端區(qū)域的菌群變化[9],而不能反映整個(gè)腸道菌群的變化。因此,本試驗(yàn)以5月齡斷奶哈薩克馬駒為研究對象,通過高通量測序技術(shù)檢測其十二指腸、空腸和回腸菌群的多樣性,探究馬消化道相鄰區(qū)段的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性,以期為全面評價(jià)斷奶后馬屬動物小腸發(fā)育、健康、功能等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

在新疆昭蘇縣喀拉蘇鎮(zhèn)興昭牧業(yè)場,選擇出生日期(2019年3月出生,±5 d)和斷奶日期(5月齡)相近的哈薩克馬公馬駒6匹為研究對象。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

6匹5月齡斷奶哈薩克馬公馬駒在相同的飼養(yǎng)管理和飼糧營養(yǎng)水平條件下,進(jìn)行為期60 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。6匹斷奶馬駒在第60天進(jìn)行屠宰,分別采集十二指腸、空腸和回腸的內(nèi)容物,采用 16S rRNA高通量測序技術(shù)檢測各腸段內(nèi)容物中菌群的多樣性,并比較分析3個(gè)腸段菌群組成的差異性。試驗(yàn)開始時(shí)馬駒平均體重為(112.36±7.50) kg,屠宰時(shí)平均體重為(147.08±4.86) kg。

1.3 飼養(yǎng)管理

所有馬匹在試驗(yàn)前按照0.2 mg/kg BW的劑量口服伊維菌素(ivermectin)驅(qū)蟲劑進(jìn)行驅(qū)蟲。每日09:00—21:00馬駒室外活動飼養(yǎng),將全天的精料補(bǔ)充料平均分成3等份,分別在09:00、15:00和21:00使用料兜進(jìn)行飼喂。馬駒在活動場(80 m×40 m)自由活動,單槽位自由采食粗飼料(苜蓿和干草2∶1均勻混合飼喂)。當(dāng)天21:00至第2天09:00馬駒室內(nèi)單圈舍飼養(yǎng)(4 m×3 m,內(nèi)置墊草),并提供粗飼料和清潔的飲水。精料補(bǔ)充料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 精料補(bǔ)充料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 樣品采集

經(jīng)過新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會同意后,將禁食12 h的馬駒屠宰后,參照解剖學(xué)方法,分離十二指腸、空腸和回腸,立刻將內(nèi)容物放置在高壓滅菌的玻璃燒杯中,用玻璃棒混合均勻,隨機(jī)取5 g裝于無菌無RNA的凍存管中,液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱中冷凍保存待測。

1.5 菌群多樣性高通量測序分析

DNA提取、PCR擴(kuò)增、Illumina HiSeq測序及結(jié)果分析均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。

1.5.1 樣品基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

取大約0.25 g腸道內(nèi)容物樣品,采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取樣本的基因組DNA,用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度,稀釋至1 ng/μL備用。以稀釋后的基因組DNA為模板,根據(jù)測序區(qū)域選擇V3～V4區(qū)特異引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5.2 文庫構(gòu)建和測序

使用NEBNext?UltraTMIIDNA Library Prep Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,將構(gòu)建好的文庫進(jìn)行Qubit和PCR定量;待文庫合格后,使用NovaSeq 6000測序儀進(jìn)行測序。

1.5.3 測序數(shù)據(jù)處理

從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù),然后截去Barcode和引物序列用于拼接,得到的拼接序列即為原始數(shù)據(jù)。參照Qiime的質(zhì)量控制流程,將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行截取,并過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于序列長度75%的數(shù)據(jù)。將經(jīng)過以上處理后得到的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,檢測并去除其中的嵌合體序列,得到最終的有效數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 alpha多樣性數(shù)據(jù)處理

使用Qiime軟件計(jì)算Observed_species指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、覆蓋度(Goods-coverage)和PD_whole_tree指數(shù)。使用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線、物種累積曲線。使用R軟件進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)組間差異分析,并選用Tukey檢驗(yàn)對alpha多樣性指數(shù)組間差異分別進(jìn)行有參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。

1.6.2 beta多樣性數(shù)據(jù)處理

使用Qiime軟件計(jì)算Unifrac距離,構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹。使用R軟件繪制主成分分析(PCA)和主坐標(biāo)分析(PCoA)圖。PCA使用R軟件的ade4和ggplot2軟件包,PCoA使用R軟件的WGCNA、stats和ggplot2軟件包。使用R軟件進(jìn)行beta多樣性指數(shù)組間差異分析,并選用Tukey檢驗(yàn)對beta多樣性指數(shù)組間差異分別進(jìn)行有參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。

LEfSe分析使用LEfSe軟件,默認(rèn)設(shè)置線性判別分析得分(LDA score)的篩選值為4。Metastats分析使用R軟件在各分類水平下做組間的排列檢驗(yàn)(permutation test),得到P值,然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法對P值進(jìn)行修正。組間差異顯著的物種分析利用R軟件做組間Tukey檢驗(yàn)。

1.6.3 功能注釋

Tax4Fun功能預(yù)測是通過基于最小16S rRNA序列相似度的最近鄰居法實(shí)現(xiàn),其具體做法為提取KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列并利用BLASTN算法將其比對到SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫(BLAST bitscore>1 500)建立相關(guān)矩陣,將通過UProC和PAUDA方法注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組功能信息對應(yīng)到SILVA數(shù)據(jù)庫中,實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫功能注釋。測序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫序列為參考序列聚類出操作分類單元(OTUs),進(jìn)而獲取功能注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 十二指腸、空腸和回腸菌群alpha多樣性分析

由表2可知,斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群的Observed_species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)均無顯著差異(P>0.05),但十二指腸菌群的ACE指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)均顯著高于空腸(P<0.05)。各腸段覆蓋度均超過0.99,說明數(shù)據(jù)均能準(zhǔn)確反映斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群的組成。

表2 斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群alpha多樣性分析

2.2 基于OTUs的韋恩圖

韋恩圖(圖1)顯示了3個(gè)腸段之間的共有OTUs數(shù)量以及各腸段獨(dú)有的OTUs數(shù)量。3個(gè)腸段共有的OTUs數(shù)量為1 153個(gè),十二指腸特有的OTUs數(shù)量為550個(gè),空腸特有的OTUs數(shù)量為679個(gè),回腸特有的OTUs數(shù)量為281個(gè)?？漳c特有的OTUs數(shù)量高于十二指腸和回腸,這表明在空腸中檢測到更多的細(xì)菌種類。

Du、Je和Il分別表示十二指腸、空腸和回腸。下圖同。

2.3 十二指腸、空腸和回腸菌群beta多樣性分析

十二指腸、空腸和回腸菌群beta多樣性分析見圖2。由PCoA圖可知,第1主成分對樣本變異的貢獻(xiàn)為24.61%,第2主成分對樣本變異的貢獻(xiàn)為12.10%,十二指腸和回腸菌群的相似性較高;PCA圖顯示,第1主成分對樣本方差的貢獻(xiàn)為17.55%,第2主成分對樣本方差的貢獻(xiàn)為9.98%,十二指腸、空腸和回腸菌群的相似性較高。

2.4 十二指腸、空腸和回腸菌群門水平物種豐度分析

由表3可知,斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群在門水平上相對豐度排在前10的物種為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門、酸桿菌門、螺旋體門、梭桿菌門、芽單胞菌門和疣微菌門,其中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門的相對豐度之和在98%以上?？漳c菌群中厚壁菌門的相對豐度比回腸提高了26.98%,差異顯著(P<0.05);回腸菌群中變形菌門和梭桿菌門的相對豐度顯著或極顯著高于十二指腸和空腸(P<0.05或P<0.01)。

圖2 十二指腸、空腸和回腸菌群beta多樣性分析

表3 斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物菌群門水平物種豐度分析

2.5 十二指腸、空腸和回腸菌群科水平物種豐度分析

由表4可知,斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群在科水平上相對豐度排在前10的物種為鏈球菌科、乳桿菌科、腸桿菌科、巴斯德氏菌科、梭菌目未鑒定科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、瘤胃球菌科、普氏菌科、韋榮菌科和黃色桿菌科?；啬c菌群中腸桿菌科和巴斯德氏菌科的相對豐度均顯著高于空腸(P<0.05),且巴斯德氏菌科的相對豐度還顯著高于十二指腸(P<0.05);十二指腸菌群中瘤胃球菌科的相對豐度較空腸提高了156.04%,差異顯著(P<0.05)。

表4 斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群科水平物種豐度分析

2.6 十二指腸、空腸和回腸菌群屬水平物種豐度分析

由表5可知,斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群在屬水平上相對豐度排在前10的物種為乳酸菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌科未鑒定屬、放線桿菌屬、梭菌目未鑒定屬、乳球菌屬、韋榮氏球菌屬、八疊球菌屬、檸檬酸桿菌屬和紅假單胞菌屬?；啬c菌群中腸桿菌科未鑒定屬和放線桿菌屬的相對豐度均顯著高于空腸(P<0.05),且放線桿菌屬的相對豐度還顯著高于十二指腸(P<0.05)。

表5 斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群屬水平物種豐度分析

2.7 十二指腸、空腸和回腸菌群LEfSe分析

LEfSe分析能夠在組與組之間尋找有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。由圖3可知,空腸與回腸菌群中有顯著性差異的物種有10個(gè),其中空腸菌群中有顯著差異的物種有4中,分別為芽孢桿菌綱、乳桿菌目、厚壁菌門和細(xì)菌界;回腸內(nèi)有差異的物種有6中,分別為大腸埃希氏菌、腸桿菌科未鑒定屬、腸桿菌科、腸桿菌目、變形菌門和γ-變形菌綱。

k_:界 kingdom;p_:門 phylum;c_:綱 class;o_:目 order;f_:科 family;g_:屬genus;s_:種 species;Bacilli:芽孢桿菌綱;Lactobacillaes:乳酸桿菌目;Firmicutes:厚壁菌門;Bacteria:細(xì)菌界;Escherichia coli:大腸埃希氏菌;unidentified_Enterobacteriaceae:腸桿菌科未鑒定屬;Enterobacteriaceae:腸桿菌科;Enterobacteriale:腸桿菌目;Proteobacteria:變形菌門;Gammaproteobacteria:γ-變形菌綱。

2.8 十二指腸、空腸和回腸菌群Tax4Fun功能預(yù)測

由圖4可知,斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群的功能差異明顯,其中空腸菌群主要為酶家族(enzyme families)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)、外源性生物降解和代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)、細(xì)胞群落原核生物(cellular community prokaryotes)、其他氨基酸的代謝(metabolism of other amino acids)、萜類及酮類化合物代謝(metabolism of terpenoids and polyketides)以及折疊、分類和降解(folding, sorting and degradation)等功能;回腸菌群主要為輔因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、膜運(yùn)輸(membrane transport)、能量代謝(energy metabolism)和翻譯(translation)等功能;十二指腸菌群主要為轉(zhuǎn)錄(transcription)和碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)等功能。

3 討 論

馬屬動物胃腸道擁有豐富多樣的微生物群落,這些微生物群落通過降解和發(fā)酵飼糧中碳水化合物為宿主提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)[2,10];同時(shí),微生物群落在調(diào)控機(jī)體免疫和維持宿主健康等方面也具有重要作用[11]。相對于反芻動物而言,單胃草食動物主要在盲腸和結(jié)腸利用微生物進(jìn)行纖維的發(fā)酵和降解[12],小腸則更多的是將易消化的碳水化合物如淀粉、糖等分解為更小的分子后吸收進(jìn)入血液循環(huán)[13]。因此,目前關(guān)于馬屬動物腸道微生物的研究更多的集中在盲腸和糞便中,對于其小腸微生物的研究鮮見。Dicks等[14]研究表明,馬小腸內(nèi)的微生物數(shù)量眾多,活菌數(shù)在106～107CFU/mL。徐娥等[15]通過探究大約克豬腸段不同部位微生物相對豐度和多樣性發(fā)現(xiàn),十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物中細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)回腸>空腸>十二指腸,且各腸段菌群的豐富度和多樣性隨著消化道的深入呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。朱春紅等[16]為了揭示鴨腸道菌群特征,以健康的高郵鴨為研究模型,通過高通量測序發(fā)現(xiàn),健康鴨十二指腸、空腸以及回腸菌群中OTUs數(shù)量均有所差異,且OTUs的數(shù)量呈現(xiàn)出空腸>十二指腸>回腸。本研究結(jié)果顯示,斷奶馬駒十二指腸、空腸及回腸菌群共有的OTUs數(shù)量為1 153個(gè),隨著腸道結(jié)構(gòu)的不斷深入,各腸段菌群中OTUs數(shù)量呈現(xiàn)出空腸>十二指腸>回腸。十二指腸、空腸及回腸菌群的多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示,十二指腸和回腸菌群多樣性均高于空腸,且十二指腸與空腸呈現(xiàn)顯著關(guān)系。PCA結(jié)果顯示,十二指腸、空腸和回腸物種組成相似。造成這種差異的原因可能與各腸段的生理狀態(tài)和功能有關(guān)。十二指腸與胃相連,其酸性內(nèi)容物以及腺體分泌的胰液、膽汁等創(chuàng)造的消化性環(huán)境不利于微生物的生存[17],而空腸是馬屬動物小腸中最長的部分,內(nèi)容物周轉(zhuǎn)相對緩慢,可能更適于微生物的生存。

Metabolism:代謝;Enzyme families:酶家族;Lipid metabolism:脂質(zhì)代謝;Xenobiotics biodegradation and metabolism:外源性生物降解和代謝;Cellular community prokaryotes:細(xì)胞群落原核生物;Metabolism of other amino acids:其他氨基酸的代謝;Metabolism of terpenoids and polyketides:萜類及酮類化合物代謝;Folding, sorting and degradation:折疊、分類和降解;Poorly characterized;缺失的功能描述;Amino acid metabolism:氨基酸代謝;Drug resistance:藥物抵抗;Cellular processes and signaling:細(xì)胞過程和信號;Cell motility;細(xì)胞運(yùn)動;Transport and catabolism:運(yùn)動和分解;Genetic information processing:遺傳信息處理;Transcription:轉(zhuǎn)錄;Signal transduction:信號轉(zhuǎn)導(dǎo);Carbohydrate metabolism:碳水化合物代謝;Glycan biosynthesis and metabolism:糖的生物合成與代謝;Metabolism of cofactors and vitamins:輔因子和維生素的代謝;Membrane transport:膜運(yùn)輸;Energy metabolism:能量代謝;Translation:翻譯;Nucleotide metabolism:核苷酸代謝;Replication and repair:復(fù)制與修復(fù)。

由于腸道組織結(jié)構(gòu)、生理功能及飼糧結(jié)構(gòu)的不同,不同腸段的菌群結(jié)構(gòu)和功能存在明顯差異[18-19]。Dougal等[20]通過16S rDNA測序技術(shù)對10匹純種馬和英國本土馬的回腸和大腸內(nèi)容物進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),所有馬匹的回腸樣品中隸屬于厚壁菌門的乳桿菌科和隸屬于變形菌門的巴氏桿菌科的相對豐度最高。吾爾恩·阿合別爾迪等[21]指出,馬回腸優(yōu)勢菌為放線菌屬和狹義梭菌屬。研究顯示,厚壁菌門內(nèi)的細(xì)菌多數(shù)與碳水化合物代謝有關(guān),大多數(shù)的厚壁菌門細(xì)菌能夠分泌胞外多糖降解酶[22-23],而變形菌門內(nèi)的細(xì)菌多數(shù)與蛋白質(zhì)發(fā)酵有關(guān)[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn),斷奶馬駒十二指腸菌群中瘤胃球菌科的相對豐度顯著增加,空腸菌群中厚壁菌門的相對豐度顯著增加,回腸菌群中變形菌門、梭桿菌門、腸桿菌科、巴斯德氏菌科、腸桿菌科未鑒定屬和放線桿菌屬的相對豐度顯著增加,這與Li等[25]和李倩等[26]分析斷奶馬駒胃和盲腸中菌群結(jié)構(gòu)所得結(jié)果相符合。飼糧中的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在馬屬動物胃和小腸(十二指腸、空腸及回腸)中被消化吸收,進(jìn)而導(dǎo)致小腸中厚壁菌門和變形菌門的相對豐度較高。隨著飼糧的非淀粉多糖在十二指腸、空腸和回腸中逐漸降解為可溶性寡糖,為盲腸中降解纖維類物質(zhì)的細(xì)菌提供了適宜的可利用底物。因此,斷奶馬駒盲腸中擬桿菌門的相對豐度上升,而厚壁菌門和變形菌門的相對豐度下降。

為了進(jìn)一步研究斷奶馬駒不同腸段菌群組成和物種豐度的差異,本試驗(yàn)對不同腸段菌群進(jìn)行了LEfSe分析,發(fā)現(xiàn)空腸與回腸菌群中存在顯著差異的物種有10個(gè),其中空腸菌群中有顯著差異的物種有4個(gè),分別為細(xì)菌界、厚壁菌門、芽孢桿菌綱和乳酸桿菌目;回腸內(nèi)有顯著差異的物種有6個(gè),分別為大腸埃希氏菌、腸桿菌科未鑒定屬、腸桿菌科、腸桿菌目、變形菌門和γ-變形菌綱,這與Tax4Fun功能預(yù)測結(jié)果相一致。斷奶馬駒十二指腸菌群主要為生物體系統(tǒng)(organismal systems)和未分類(unclassified)等功能,空腸菌群主要為代謝(metabolism)等功能,回腸菌群主要為環(huán)境信息處理(environmental information processing)等功能。結(jié)合本試驗(yàn)測定的空腸和回腸菌群組成,這些碳?xì)浠衔锏慕到庖约皾撛谥虏∧芰Φ纳仙c厚壁菌門和變形菌門的相對豐度是高度相關(guān)的,說明空腸是厚壁菌門以及隸屬于厚壁菌門等有益菌的定植場所,且飼糧中碳水化合物主要在空腸中進(jìn)行消化分解,回腸則是大部分隸屬于變形菌門的致病菌攻擊的主要部位。造成這種差異的原因可能與斷奶應(yīng)激有關(guān),斷奶應(yīng)激能夠改變動物腸道菌群組成和數(shù)量[27],且導(dǎo)致幼齡動物腸道菌群紊亂,進(jìn)而使變形菌門、梭桿菌門的多數(shù)病原菌屬的相對豐度增加[28]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下,斷奶馬駒十二指腸、空腸和回腸菌群組成存在明顯差異,十二指腸和空腸菌群中主要以厚壁菌門及隸屬于厚壁菌門的細(xì)菌為主,回腸菌群中則主要以厚壁菌門和變形菌門的細(xì)菌為主。