第二代人乳頭瘤病毒全基因組分型國(guó)家參考品的研制

田亞賓，沈舒，周海衛(wèi)，許四宏

·技術(shù)與方法·

第二代人乳頭瘤病毒全基因組分型國(guó)家參考品的研制

田亞賓，沈舒，周海衛(wèi)，許四宏

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一個(gè)小的環(huán)狀雙鏈-DNA 病毒，屬于乳頭瘤病毒家族。主要感染皮膚、生殖器和上呼吸道的表皮細(xì)胞。目前，大約 200 多種 HPV 型別被鑒定發(fā)現(xiàn)[1]。HPV 的基因組長(zhǎng)約為 8000 bp，主要分為三個(gè)區(qū)：早期基因、晚期基因和長(zhǎng)調(diào)控區(qū)。早期基因編碼 6 個(gè)早期蛋白，包括 E1、E2、E4、E5、E6 和 E7，主要負(fù)責(zé)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。其中，E6 和 E7基因編碼與細(xì)胞癌變轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白。晚期基因 L1 和 L2 主要負(fù)責(zé)編碼衣殼蛋白[2]。根據(jù)其與癌癥的相關(guān)性，分為高危型 HPV（HR-HPV）和低危型 HPV（LR-HPV）。目前，將 14 種 HPV 型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）定為 HR-HPV，4 種 HPV 型別（26、53、73、82）列為潛在 HR-HPV。HR-HPV的持續(xù)性感染是造成宮頸癌及多種生殖道癌癥的主要病原體。在中國(guó)，69.1% 的宮頸癌病例為 HPV16 和 HPV18 感染，14.7% 為 HPV31、33、52、58 和 59。HPV39、45 和 56 占宮頸癌的 4.5%，剩余的病例是比較少見的其他型別，如 HPV66[3]。

由于 HPV 在體外無法分離培養(yǎng)，血清學(xué)方法檢測(cè) HPV 的靈敏度較低。在臨床上，主要通過檢測(cè)核酸診斷 HPV 感染。國(guó)內(nèi)外已有眾多商品化 HPV 核酸檢測(cè)試劑，這些試劑采用的方法學(xué)繁多，包括 PCR 熒光法、PCR 反向雜交法、基因芯片法、恒溫?cái)U(kuò)增法、雜交捕獲法、測(cè)序法等[4-5]。大多數(shù)試劑基于高度保守的 L1 區(qū)，還有少數(shù)試劑集中于 E1、E2、E6、E7 區(qū)。目前，國(guó)內(nèi)已研制成功人乳頭瘤病毒全基因組分型國(guó)家參考品，由于 HPV DNA 的量值為參考范圍（106～ 107copy/ml）且未覆蓋 HPV51、HPV53 和 HPV56 高危型別樣本，故在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限。本研究旨在更新和完善人乳頭瘤病毒全基因組分型國(guó)家參考品，更好地適用于該類試劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

23 種不同型別的 HPV 全基因組質(zhì)粒由亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司提供；5 株 HPV 陰性的病原體分別為巨細(xì)胞病毒（CMV）、單純皰疹病毒1 型（HSV-1）、沙眼衣原體（CT）、B 族鏈球菌（GBS）和解脲脲原體（UU），來源于本實(shí)驗(yàn)室；人乳頭瘤病毒 16 型 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所（NIBSC，編號(hào)：06/202），為凍干樣品，5′106IU/支或 5′106Geq/支。將樣品平衡至室溫，加入 500 μl 無 DNase/RNase 去離子水溶解，得到終濃度為 107IU/ml 的 HPV16 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒株的鑒定和復(fù)核 所有樣品使用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司、湖南圣湘科技有限公司、江蘇碩世生物科技有限公司、艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司、凱普生物科技有限公司的 HPV 核酸（分型）檢測(cè)試劑進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，驗(yàn)證不同樣品是否存在交叉污染。嚴(yán)格按照各企業(yè)的產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.2.2 樣品的分裝 使用 Qubit ds DNA HS 分析試劑盒對(duì)高濃度的樣品進(jìn)行初步的定量，然后將各 HPV 樣品使用含 2 ng/μl 的人基因組 TE 溶液稀釋分裝，每支 100 μl。5 種 HPV 陰性的不同病原體用 2 ng/μl 的人基因組 TE 溶液稀釋分裝至 500 μl/支。

1.2.3 不同型別 HPV DNA 的溯源賦值 通過設(shè)計(jì)針對(duì)質(zhì)粒通用區(qū)段基因的引物和探針，采用熒光 PCR 法檢測(cè)，并使用雙平行線法分析數(shù)據(jù)，將候選樣品溯源至 HPV16 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品賦值[6]。具體步驟如下：將 WHO HPV16 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至 8′104、4′105、2′106IU/ml，將不同型別 HPV 參考品同步系列稀釋 5、25、125 倍。采用 QuantiTect? Probe PCR 試劑檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)后獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)試曲線，采用 Stats模型進(jìn)行雙平行線分析擬合。在 3 個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行 5 次標(biāo)定。檢驗(yàn)分析兩條直線的斜率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有無差異，是否平行。若平行，計(jì)算出各測(cè)試樣本的檢測(cè)值。通過 5 次獨(dú)立的檢測(cè)，計(jì)算每個(gè)樣品的均值，確定為最終的濃度值。

1.2.4 協(xié)作標(biāo)定研究 經(jīng)驗(yàn)證分裝后，將參考盤分發(fā)不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定研究。各實(shí)驗(yàn)室按照各自企業(yè)生產(chǎn)的 HPV 核酸（分型）檢測(cè)試劑說明書和（或）協(xié)作標(biāo)定方案檢測(cè)復(fù)溶后的樣本。各實(shí)驗(yàn)室將檢測(cè)結(jié)果匯總，依據(jù)各試劑盒的檢測(cè)范圍評(píng)價(jià)符合率和檢測(cè)限。其中檢測(cè)限性能指標(biāo)參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估單個(gè)反應(yīng)中檢出的最小樣品量（即 IU/反應(yīng)）。

1.2.5 穩(wěn)定性研究 將參考盤中的 14 種 HR-HPV 樣本按照以下條件處理：于室溫（20 ～ 27 ℃）放置 1 d 和反復(fù)凍融 5 次。然后系列稀釋 10、100 倍，使用商品化的人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑（熒光 PCR 法）、HPV 分型（25）檢測(cè)試劑（PCR-反向點(diǎn)雜交法）檢測(cè)原倍、10 倍、100 倍稀釋后樣本，使用高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒（雜交捕獲二代法）（即 HC2）和 Care HPV 核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)原倍樣本，結(jié)果與存放于–20 ℃條件下的參考品比較，以考核參考品的加速穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 參考品的組成

本參考品含 23 種不同型別的 HPV 全基因組 DNA，所有樣品經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，采用商品化 HPV 核酸檢測(cè)試劑（熒光 PCR 法）進(jìn)行復(fù)核測(cè)定。結(jié)果符合預(yù)期型別，且不同樣本間無交叉污染，表明可作為新一代國(guó)家參考品的候選樣本。為了評(píng)價(jià)試劑的特異性，本研究選取了 5 種經(jīng)性傳播的 HPV 陰性病原體，分別為 CMV、HSV-1、CT、GBS 和 UU。將上述 5 個(gè) HPV 陰性樣本和 23 種不同型別 HPV 質(zhì)粒組成新一代國(guó)家參考品。

2.2 不同型別 HPV DNA 的溯源賦值

對(duì) 23 種不同型別的 HPV DNA 進(jìn)行溯源賦值。以 HPV16 型別為例，HPV16 型國(guó)際參考品和 HPV16 國(guó)家參考品系列稀釋后檢測(cè)，獲得國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品曲線和測(cè)試曲線。結(jié)果顯示（圖1），兩條曲線的線性符合要求，且兩條曲線平行（> 0.01，= 1.08），雙平行線法賦值得到該型別 HPV DNA 含量為 1889748.693 IU/ml。平行 5 次實(shí)驗(yàn)測(cè)定 HPV DNA 含量分別為 3472702.503、2956621.885、1842298.508、4737508.297、1889748.693 IU/ml，計(jì)算均值后乘以稀釋倍數(shù) 5，即HPV16 DNA 終濃度為 1.49′107IU/ml。按照以上分析計(jì)算，所有 23 種不同型別的 HPV 參考品溯源賦值結(jié)果（表1）顯示，HPV DNA 的含量在6.59 ～ 7.17 Log10IU/ml。5 次檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）均不高于 0.27 Log10，變異系數(shù)（CV）≤ 4.1%。

2.3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

匯總來自不同實(shí)驗(yàn)室的 37 種 HPV 核酸檢測(cè)試劑的結(jié)果，大多數(shù)試劑能夠準(zhǔn)確地檢出各試劑檢測(cè)范圍內(nèi)的相應(yīng)型別，與預(yù)期的結(jié)果一致。極少數(shù)試劑在檢測(cè)中存在漏檢 HPV52 型或假陽性結(jié)果，可能與分析靈敏度低或?qū)嶒?yàn)室污染有關(guān)。對(duì)于各試劑的檢測(cè)范圍外的型別，高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒（雜交捕獲二代法）在檢測(cè) HPV43、HPV66、HPV82 出現(xiàn)交叉反應(yīng)，其余試劑的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，不存在交叉反應(yīng)。在檢測(cè) 5 份 HPV 陰性病原體，與預(yù)期結(jié)果一致，均為陰性。此外，通過系列稀釋不同型別 HPV 分析了不同檢測(cè)試劑的最低檢測(cè)限。由于不同試劑覆蓋的檢測(cè)范圍內(nèi)的型別不同，故本研究集中分析匯總不同試劑檢測(cè) 14 種 HR-HPV 的最低檢測(cè)限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同試劑的最低檢測(cè)限存在較大差異。各試劑的檢測(cè)限范圍為1 ～ 1.9 × 105IU/反應(yīng)。大多數(shù)基于 PCR-熒光法或 PCR-雜交法的試劑的檢測(cè)低于 104IU/反應(yīng)，3 種基于雜交捕獲法的 HPV 核酸試劑的檢測(cè)限在 104IU/反應(yīng)上下波動(dòng)。結(jié)果表明這些試劑由于不同的引物體系、樣本處理及靈敏度的差異，造成最低檢測(cè)限的差異也較大。

圖1 HPV16 型國(guó)家參考品與 HPV16 國(guó)際參考品的標(biāo)定

表1 23 種不同 HPV 型別全基因組質(zhì)粒的量值結(jié)果

注：HPV 參考品量值使用 IU/ml 表示，等同于 Geq/ml 和 copy/ml。

2.4 穩(wěn)定性研究

14 種不同型別 HR-HPV 參考品放置于不同條件后，HPV 核酸分型檢測(cè)試劑（PCR-反向點(diǎn)雜交法）的檢測(cè)結(jié)果顯示，原倍、10 倍和 100 倍稀釋的樣品在 3 種條件下均符合預(yù)期結(jié)果，且顯色均勻較一致。HPV 核酸分型檢測(cè)試劑（熒光 PCR 法）的結(jié)果顯示，不同的稀釋梯度 HPV樣品在 3 種條件下，結(jié)果一致且 Ct 值相近（△Ct ≤ 1，圖2）。上述結(jié)果顯示基于熒光 PCR 和 PCR 反向雜交法試劑檢測(cè)均表明該參考品比較穩(wěn)定。然而，基于雜交捕獲法的試劑檢測(cè)結(jié)果顯示，各個(gè)型別在不同的條件下，存在一定的差異，且沒有一定的規(guī)律性（圖3）。這種差異可能與雜交捕獲法是基于信號(hào)放大的原理有關(guān)。

圖2 HPV 核酸檢測(cè)試劑（熒光 PCR 法）評(píng)價(jià)國(guó)家參考品的穩(wěn)定性

圖3 HPV核酸檢測(cè)試劑（雜交捕獲法）評(píng)價(jià)國(guó)家參考品的穩(wěn)定性

2.5 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定

結(jié)合協(xié)作標(biāo)定和穩(wěn)定性研究的結(jié)果，參考上一代國(guó)家參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定了新一代國(guó)家參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。第二代國(guó)家參考品主要適用于熒光 PCR 法、PCR-雜交法、測(cè)序法等靶向擴(kuò)增法試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)滿足：①準(zhǔn)確性：檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)人乳頭瘤病毒不同型別國(guó)家分型參考品，結(jié)果應(yīng)均為相應(yīng)型別陽性；②特異性：檢測(cè) 5 份 HPV 陰性參考品，結(jié)果應(yīng)均為陰性且檢測(cè)不同型別的 HPV 參考品，要求高危型別 HPV 應(yīng)不得出現(xiàn)交叉反應(yīng)，低危型別 HPV 交叉反應(yīng)率應(yīng)不高于 10.0%；③精密度：檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi) HPV 型別參考品，重復(fù)檢測(cè)10 次，要求檢測(cè)結(jié)果均為相應(yīng)型別陽性，且Ct 值的變異系數(shù)不大于 5.0%；④最低檢測(cè)限：應(yīng)不高于104IU/反應(yīng)。

3 討論

HPV 核酸檢測(cè)對(duì)于宮頸癌篩查具有重要的臨床意義，通過檢測(cè) HPV 的感染狀態(tài)篩出宮頸癌前病變和宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)人群并及時(shí)進(jìn)行治療，能夠有效預(yù)防或降低宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。此外，HPV 核酸檢測(cè)對(duì)于 HPV 流行病學(xué)調(diào)查和 HPV 疫苗的效力評(píng)價(jià)具有重要的意義。目前，市場(chǎng)上有大量商品化核酸檢測(cè)試劑，大多數(shù)試劑能夠檢測(cè) 14 種高危型別，還有一部分試劑主要用于多種高、低危型別的分型檢測(cè)[3]。為了提高和規(guī)范這類試劑的質(zhì)量，本研究在延續(xù)上一代國(guó)家參考品的基礎(chǔ)上，研制了新一代 HPV 全基因組分型國(guó)家參考品。由于 HPV 不同于其他病原體，無法獲得病毒培養(yǎng)物。盡管臨床樣本容易收集，但無法滿足大量試劑的評(píng)價(jià)使用，且在量值的確定上也存在一定困難。新一代參考品延續(xù)上一代參考品，合成模擬的全基因組質(zhì)粒樣本用于評(píng)價(jià)試劑，這與 WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的性質(zhì)一致[7]。不同于上一代參考品覆蓋的型別，本參考品覆蓋了所有的高危型和潛在高危型型別樣本，能夠更好地評(píng)價(jià)目前市場(chǎng)上不同 HPV 核酸檢測(cè)試劑的性能，如準(zhǔn)確性、特異性和檢出限等。

為了保證不同檢測(cè)試劑的溯源和結(jié)果的可比，本研究對(duì)每種樣品進(jìn)行了一一標(biāo)定。傳統(tǒng)上，質(zhì)粒樣品可通過分子量換算確定拷貝數(shù)，然而，對(duì)于不同儀器不同批次間存在一定的差異。最近，WHO 在原有 HPV16 和 HPV18 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)上，增加了 HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV6 和 HPV11 等 7 種型別國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，覆蓋的型別依然有限。本研究參考了 WHO 協(xié)作標(biāo)定的方法，以保證不同代次間的差異[6]。針對(duì)質(zhì)粒通用區(qū)段設(shè)計(jì)引物和探針，采用熒光 PCR 方法將 23 種不同樣品溯源至 WHO HPV16 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于上述樣品的賦值，提高了不同試劑間分析靈敏度可比性。

此外，本套參考品發(fā)放至不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了適應(yīng)性驗(yàn)證。對(duì)于不同方法學(xué)的檢測(cè)試劑進(jìn)行了驗(yàn)證，比如高通量測(cè)序、雜交捕獲法、酶切信號(hào)放大法等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于雜交捕獲法在檢測(cè)HPV43、HPV66 和 HPV82 存在一定的交叉反應(yīng)，與之前的報(bào)道一致[8-9]。對(duì)于樣品的穩(wěn)定性采用基于雜交捕獲法的試劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，這可能是由于雜交捕獲類的檢測(cè)類試劑是基于信號(hào)放大的原理，其分析靈敏度較 PCR 方法低[10]。樣品接近試劑的檢測(cè)限，重復(fù)性較差，故不適用于該類試劑的性能評(píng)價(jià)。

總之，本研究建立了第二代 HPV 全基因組分型國(guó)家參考品，并制訂了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此參考品主要適用于基于 PCR-熒光探針法、PCR-反向雜交法、基因芯片法、恒溫?cái)U(kuò)增法、測(cè)序法等靶向擴(kuò)增方法學(xué)原理的 HPV核酸（分型）檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。該參考盤的建立有助于評(píng)價(jià)該類試劑，以保證在不同實(shí)驗(yàn)室和不同試劑盒檢測(cè)獲得有意義且可比的結(jié)果。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.011

許四宏，Email：xushong@nifdc.org.cn

2023-05-12