不同個體來源和低氧條件對人骨髓間充質干細胞生物學特性的影響

孫雪飛，李靜頤，陳媛，姜茜茜，張玲玲，王琳，劉元波

·論著·

不同個體來源和低氧條件對人骨髓間充質干細胞生物學特性的影響

孫雪飛，李靜頤，陳媛，姜茜茜，張玲玲，王琳，劉元波

100070 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院血液科（孫雪飛、劉元波）；102600 北京，九芝堂美科（北京）細胞技術有限公司（李靜頤、陳媛、姜茜茜、張玲玲、王琳）

研究 6 株不同個體（男：M1、M2、M3；女：F1、F2、F3）來源人骨髓間充質干細胞（BM-MSC）在不同低氧條件下生物學特性的差異。流式及誘導分化實驗鑒定間充質干細胞的標志物表達及三系分化能力。Transwell 法檢測遷移能力。CCK8 法檢測 5% 及 1% 氧氣下細胞活力差異。6 株 BM-MSC 陽性標志物表達均高于 99%，陰性標志物總表達均低于 2%，且均具有三系分化能力。不同個體來源 BM-MSC 成骨、成脂分化效率和細胞活力具有差異，性別分層統(tǒng)計顯示成脂分化差異可能與性別相關；不同低氧條件下 BM-MSC 的細胞活力和細胞遷移能力具有差異，5% 氧氣條件顯著優(yōu)于 1% 氧氣條件。同時考慮氧氣和性別因素時，發(fā)現(xiàn)不同低氧條件下男性來源的 BM-MSC 活力相對女性均具有較高的趨勢，而遷移能力則是女性來源的 BM-MSC 相對更強。提示應根據人骨髓間充質干細胞的應用目的所需特性對供者個體和擴增環(huán)境設立特定標準。

人骨髓間充質干細胞； 低氧； 性別； 細胞活力

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是多組織來源的一種具有多向分化潛能的干細胞，可從臍帶、胎盤、羊膜、脂肪、牙髓、骨髓等組織中獲取[1]。由于 MSC 具備較低的免疫原性且具有組織修復、免疫調節(jié)、炎癥調節(jié)等多種特性，因此在再生與康復醫(yī)學中占有重要地位[2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSC）由于方便取材、易于轉染、免疫原性低而廣泛應用于治療心血管病、肺病、免疫疾病、神經系統(tǒng)疾病等[3]。

BM-MSC 在解決醫(yī)療領域的各種嚴重健康問題方面顯示出巨大潛力[4]，推進骨髓間充質干細胞進入臨床已成為趨勢，目前針對 BM-MSC 的研究大多集中在療效、機制及不良反應方面，對于有助于 BM-MSC 成品化的藥學研究探討較少。藥學開發(fā)包括起始原材料控制和生產工藝的開發(fā)。但作為關鍵的起始原材料，骨髓來源的供者目前尚無細胞特性相關的篩選標準，培養(yǎng)條件對細胞特性的影響也尚需更多研究。因此本研究通過對比不同個體來源和低氧條件下 BM-MSC 的生物學特性，初步評估個體和環(huán)境因素對細胞的影響。

BM-MSC 在機體內通過多種機制發(fā)揮作用，包括免疫調節(jié)、炎癥調節(jié)、旁分泌等[5]，并且能夠定向遷移至機體特定損傷部位。有多項研究報道，低氧條件（5%）相對常氧條件（20%）可提升 MSC 遷移能力[6-7]，但很少有研究對比超低氧（1%）及低氧（5%）條件下 MSC 活力和遷移能力的差異。此外，MSC 的擴增能力直接影響干細胞藥物規(guī)?；a，因此在保證 MSC 遷移能力的基礎上探索最適宜的培養(yǎng)條件對于 MSC 作為藥品進行量產擴增至關重要。

本研究對不同個體來源的 BM-MSC 進行間充質干細胞特性鑒定，探討不同低氧條件下不同個體來源 BM-MSC 生物學特性、細胞活力及遷移能力的差異，為 BM-MSC 的質量影響因素研究提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BM-MSC 為九芝堂美科（北京）細胞技術有限公司產品；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；胎牛血清購自 Lonsera 公司；細胞活力檢測試劑盒（CCK8）購自上海碧云天生物技術有限公司；成骨分化試劑盒、成脂分化試劑盒和成軟骨分化試劑盒購自 Stemcell 公司；茜素紅染色試劑盒、油紅染色試劑盒和阿爾新藍染色試劑盒均購自美國 Sigma 公司；transwell 細胞培養(yǎng)皿購自廣州潔特；DAPI 染液購自索萊寶公司；流式抗體：CD14-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-APC、IgG1-PE 均購自美國R&D 公司；4% 組織固定液購自北京索萊寶科技有限公司。

三氣培養(yǎng)箱、離心機和酶標儀為美國 Thermo 公司產品；流式細胞儀為美國 Beckman公司產品；倒置熒光顯微鏡為 Leica 公司產品；細胞計數儀為 Countstar 公司產品；超凈臺為 Esco 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 骨髓樣本與 HBSS 混勻后加入到 1.077 kg/m3Ficoll-paque 分離液中，500 ×離心 30 min。收集單核細胞層后，于 HBSS 中洗滌 1 次。洗滌后的沉淀重懸于間充質干細胞培養(yǎng)基（DMEM + 10% FBS）中，在 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)基，棄去未貼壁的細胞，每隔 3 ～ 4 天換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。約 70% 融合度時采用 TrypLE 消化細胞。獲取的細胞凍存–130 ℃及以下條件。

待獲取不同供體細胞后，取出凍存的細胞在水浴鍋中快速復蘇后加入間充質干細胞培養(yǎng)基，500 ×離心 5 min。離心完成后棄上清，加入間充質干細胞培養(yǎng)基后混勻接種至 10 cm 細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待培養(yǎng)到可供后續(xù)實驗的數量時收獲。

1.2.2 表面標志物檢測 分別用無菌 PBS 重懸 6 個來源的 BM-MSC，按照流式檢測試劑盒要求加入抗體常溫孵育 1 h 后離心去上清，PBS 清洗 2 遍后加入 PBS 重懸細胞并上機進行流式檢測。

1.2.3 成骨分化 將 6 株不同個體（男：M1、M2、M3；女：F1、F2、F3）來源的 BM-MSC 分別接種于六孔板，細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，每孔加入 2 ml 分化試劑盒中的成骨分化培養(yǎng)基，每3 ～4 天更換一次培養(yǎng)基，分化培養(yǎng) 12 ～ 16 d 觀察到骨基質形成，使用茜素紅染色觀察成骨分化情況并拍照記錄。

1.2.4 成脂分化 將 6 株不同個體來源的 BM-MSC 分別接種于六孔板，細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，每孔加入 2 ml 分化試劑盒中的成脂分化培養(yǎng)基，每 3 ～ 4 天更換一次培養(yǎng)基，分化培養(yǎng) 12 ～ 16 d 觀察到脂滴形成后使用油紅染色觀察成脂分化情況并拍照記錄。

1.2.5 成軟骨分化 將 6 株不同個體來源的 BM-MSC 分別接種于 6 個 15 ml 離心管中，500 ×離心 5 min 后棄上清，將離心形成的細胞團留在離心管底部，加入 2 ml 分化試劑盒中的成軟骨分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，每 3 ～ 4 天更換一次培養(yǎng)基，分化培養(yǎng) 14 ～ 18 d 將細胞團吸出，4% PFA 固定后進行冰凍切片，使用阿爾新藍對冰凍切片染色觀察成軟骨分化情況并拍照記錄。

1.2.6 細胞遷移實驗 在 24 孔板的實驗孔中加入 500 μl 間充質干細胞培養(yǎng)基。取 1 × 105個 BM-MSC 細胞接種于 24 孔板的 transwell 培養(yǎng)板上層嵌入皿中，再加入 250 μl 間充質干細胞培養(yǎng)基，保證上層嵌入皿浸沒于培養(yǎng)基中。在低氧、超低氧條件下培養(yǎng) 4 h 后取出細胞培養(yǎng)板，棄掉嵌入皿及嵌入皿下層培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)孔中加入 400 μl 細胞消化液，液面可觸及嵌入皿底，消化細胞 8 min 后棄嵌入皿，充分吹打消化液后取 20 μl 與20 μl AOPI 染液 1:1 混合，使用細胞計數儀檢測遷移的細胞數量。

1.2.7 細胞活力檢測 分別取 6 個來源 BM-MSC 各 2500 個細胞接種于 96 孔板中，每孔加入 100 μl 間充質干細胞培養(yǎng)基。每組 BM-MSC均設 3 個平行。分別于接種后的第24、48、72 h 向實驗孔中加入 10 μl CCK8 試劑，37 ℃避光孵育 2 h 后使用酶標儀讀取450 nm 處的值，并根據值繪制 BM-MSC 的生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 細胞標志物的表達

使用流式細胞術對 6 株 BM-MSC 進行細胞表面標記物檢測，陽性標記物 CD73、CD90、CD105在所有 6 株細胞中的表達均在 95% 以上（圖1）。

陰性細胞表面標志物 HLA-DR、CD14、CD19、CD34、CD45（CD14、CD19、CD34、CD45 檢測結果合并用 CDM 表示），6 株 BM-MSC陰性標記物表達均在 2% 以下（圖1）。

圖1 BM-MSC 細胞表面標志物（M：男性；F：女性）

Figure 1 Cell surface markers of BM-MSC (M: Male; F: Female)

Figure 2 Triple differentiation potential of BM-MSC [A: Alizarin red staining for osteogenic differentiation (× 20); B: Comparison of osteogenic differentiation efficiency; C: Oil red staining of adipogenic differentiation (× 20); D: Comparison of adipogenic differentiation efficiency; E: Alcian blue staining for chondrogenic differentiation (× 20); M: Male; F: Female]

2.2 細胞多向分化潛能

2.2.1 BM-MSC 的成骨分化潛能 分別誘導 6 株 BM-MSC 成骨分化，在分化第 14 天均可被茜素紅染為橘紅色（圖2A），表明 6 株 BM-MSC 均具有成骨分化潛能，符合間充質干細胞鑒定要求中的成骨分化。不同個體來源 BM-MSC 細胞 M1、M2、M3、F1、F2、F3 的茜素紅染色面積分別為 0.542%、4.568%、8.737%、5.381%、1.270%、16.220%，顯示成骨分化效率個體差異較大。男性與女性來源 BM-MSC 成骨分化茜素紅染色面積（圖2B）無顯著差異（= 0.583）。

2.2.2 BM-MSC 的成脂分化潛能 分別誘導 6 株 BM-MSC 成脂分化，在第 14 天分化成的脂細胞中的脂滴可被油紅 O 染成紅色。6 株 BM-MSC 在成脂分化后均可見脂滴積累（圖2C），表明 6 株 BM-MSC 均具有成脂分化潛能，符合間充質干細胞鑒定要求中的成脂分化。不同個體來源 BM-MSC 細胞 M1、M2、M3、F1、F2、F3 的油紅染色面積分別為11.368%、14.284%、16.379%、11.123%、8.013%、5.702%。不同性別來源 BM-MSC 成脂分化油紅染色面積統(tǒng)計（圖2D）發(fā)現(xiàn)男性來源 BM-MSC 染色面積有高于女性來源的趨勢（= 0.0503）。

2.2.3 BM-MSC 的成軟骨分化潛能 分別誘導 6 株 BM-MSC 成軟骨分化，在分化第 16 天進行阿爾新藍染色，分化后的軟骨細胞中的蛋白多糖基質可被阿爾新藍染料染為藍綠色。6 株 BM-MSC 在成軟骨分化后均可被阿爾新藍染為藍綠色（圖2E），表明均具有成軟骨分化潛能，符合間充質干細胞鑒定要求中的成軟骨分化。

圖3 不同低氧條件下 BM-MSC 細胞活力

Figure 3 Cell viability of BM-MSC under different oxygen conditions

2.3 不同低氧條件下 BM-MSC 的細胞活力

2.3.1 低氧條件對細胞活力影響 分別在超低氧（1%）、低氧（5%）條件下培養(yǎng) 6 株 BM-MSC，細胞接種后每 24 小時進行一次 CCK8 檢測，通過值對比不同低氧條件下 BM-MSC 的生長情況（圖3）。

BM-MSC 接種后前 2 天，生長曲線呈平緩上升，細胞處于緩慢生長狀態(tài)，不同低氧條件下細胞活力差別不大，低氧條件下 BM-MSC 細胞活力略強。接種后第 3 天，細胞加快生長，低氧和超低氧條件下 BM-MSC 的值分別為 0.542 ± 0.169、0.457 ± 0.138，低氧培養(yǎng)的 BM-MSC 活力強于超低氧組。

2.3.2 性別條件對 BM-MSC 活力的影響 使用 CCK8 法在不同低氧條件下檢測不同性別個體來源 BM-MSC 活力差異，結果見圖4。男性來源BM-MSC 活力在不同低氧培養(yǎng)條件下均較女性來源的 BM-MSC 有更高的趨勢。

圖4 不同性別來源 BM-MSC 活力（A：低氧5%；B：超低氧1%；M：男性；F：女性）

Figure 4 Cell viability of BM-MSC from different genders (A: 5% oxygen; B: 1% oxygen; M: Male; F: Female)

2.3.3 不同個體來源細胞活力對比 使用 CCK8 法檢測 6 株不同個體來源 BM-MSC 的細胞活力。6 株細胞在不同氧氣條件下的生長趨勢一致，均為前 2 天緩慢生長，第 3 天快速生長。比較而言，M1、M3、F3 接種后細胞活力相對較高，其中 M3 接種后細胞活力最高（圖5）。

2.4 不同低氧條件對 BM-MSC 遷移能力的影響

2.4.1 低氧條件對遷移能力的影響 使用 transwell法分別在超低氧和低氧條件下對 6 株 BM-MSC 進行培養(yǎng)，4 h 后對穿過嵌入皿底部的細胞進行消化和計數。低氧條件下 BM-MSC 遷移數量為（32760.0 ± 14391.8）個，顯著高于超低氧條件下的（18948.3 ± 6074.6）個（< 0.0001）。

2.4.2 性別對 BM-MSC 遷移能力的影響 超低氧條件下不同性別來源 BM-MSC 遷移數量無顯著差異（圖6A）。低氧條件下女性來源BM-MSC 遷移數量為（41046.0 ± 11021.2）個，顯著高于男性來源的（24473.0 ± 12812.7）個（< 0.001）。

圖5 不同個體來源 BM-MSC 在不同低氧條件下的細胞活力（A：1% 超低氧；B：5% 低氧；M：男性；F：女性；*表示與 M2 對比細胞活力具有顯著性差異，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；#表示與 F1 對比細胞活力具有顯著性差異，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；+表示與 F2 對比細胞活力具有顯著性差異，+P < 0.05，++P < 0.01，+++P < 0.001；&表示與 F3 對比細胞活力具有顯著性差異，&P < 0.05，&&P < 0.01）

Figure 5 Cell viability of BM-MSC from different individual sources under different oxygen conditions (A: 1% oxygen; B: 5% oxygen; M: Male; F: Female;*< 0.05,**<0.01,***< 0.001 versus M2;#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001 versus F1;+< 0.05,++< 0.01,+++< 0.001 versus F2;&< 0.05,&&< 0.01 versus F3)

圖6 不同低氧條件下 BM-MSC 遷移能力差別（A：性別對 BM-MSC 遷移能力的影響，**P < 0.001；B：不同個體 BM-MSC 遷移能力的差別，*表示與 M1 對比有顯著差異，**P < 0.001；#表示與 M3 對比有顯著差異，#P < 0.05，##P < 0.01；+表示與 F2 對比有顯著差異，+P < 0.05，++P < 0.01；M：男性；F：女性）

Figure 6 Differences in migration ability of BM-MSC under different oxygen conditions (A: The impact of gender on the migration ability of BM-MSC,**< 0.001; B: Differences in migration ability of BM-MSC from different individual sources,**< 0.001 versus M1;#< 0.05,##< 0.01 versus M3;+< 0.05,++< 0.01 versus F2; M: Male; F: Female)

2.4.3 不同個體來源 BM-MSC 遷移能力的差異 超低氧條件下各組細胞遷移數量均較低，其中 M3 遷移細胞數量顯著低于 M2 和 F2。低氧條件下，M2、F1、F3 的遷移細胞數量顯著高于其他3 株細胞（圖6B），其中 F1 遷移能力最強。以上結果說明 BM-MSC 細胞遷移能力個體差異較大。

3 討論

MSC 是再生醫(yī)學領域最常用的干細胞類型[8]，易于獲得，可以在體外成倍擴增，因此可為今后臨床大規(guī)模應用提供足夠的產量[9]。而 MSC 廣泛應用于臨床的挑戰(zhàn)之一便是不同個體來源 MSC 之間的差異，細胞活力的差異可能直接影響 MSC 的生產效率和生產成本。BM-MSC 作為目前應用范圍最廣的 MSC 種類，有必要在大規(guī)模生產之前對不同個體來源的 BM-MSC 進行細胞特性鑒定及細胞活力檢測以評估成本經濟。

目前公認的 MSC 的識別標準為表達陽性表面標志物（CD73、CD105、CD90 等），不表達或極少表達陰性表面標志物（CD34、CD45、CD14 等），并且具備至少 3 個細胞譜系（成骨、成脂和成軟骨）的分化潛力[10]。本研究以國際細胞療法協(xié)會（ISCT）設定的 MSC鑒定標準為指導[11]，對BM-MSC 進行細胞標志物及三系分化能力的鑒定，結果顯示 6 株不同個體來源的 BM-MSC 表達間充質干細胞陽性表面標志物 CD73、CD90、CD105 的比例均在 99% 以上，表達間充質干細胞陰性表面標志物 HLA-DR、CD14、CD19、CD34、CD45 的比例均低于 2%，且均具備成骨、成脂、成軟骨的三系分化能力。這些結果表明本研究使用的 6 株不同個體來源 BM-MSC 均具備最基本的 MSC 細胞特性。定量結果分析發(fā)現(xiàn)不同個體來源 BM-MSC 的成骨分化及成脂分化效率有差異。將性別作為比較因素，發(fā)現(xiàn)不同性別來源 BM-MSC 的成骨分化能力差異不大，但不同個體間的差異較為明顯；男性來源 BM-MSC 的成脂分化效率較女性有更高的趨勢。由于研究納入的樣本較少，這一發(fā)現(xiàn)需擴大樣本量繼續(xù)驗證。總之，通過對比發(fā)現(xiàn)不同個體 BM-MSC 的成脂及成骨分化效率有明顯差異，其中成脂分化效率的差異可能與性別因素相關。

雖然不同個體來源的 BM-MSC 具備 MSC 群體之間的形態(tài)、表型及功能的相似性，但也有報道指出 MSC 不僅存在組織來源相關的特異性[12-15]，其他因素如培養(yǎng)條件、供體個體及供體性別、年齡等也會對 MSC 特異性產生影響[16-17]，因此在建立標準化程序的 BM-MSC 生產制備過程中必須注意這些影響因素。

氧氣濃度是細胞培養(yǎng)條件中最重要的影響因素之一，氧氣培養(yǎng)條件對細胞活力、增殖能力、分化能力、分泌功能等均具有重要影響[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)低氧條件（5% O2）可以促進 MSC 對 VEGF、IL-8 等因子的分泌功能[20]。Rahman 等[21]研究發(fā)現(xiàn)低氧（2% O2）條件下脂肪來源 MSC 無法誘導形成軟骨，但在常氧條件下可以自發(fā)形成軟骨。Lau 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件會延長小鼠 BM-MSC 的擴增時間，但不會對其分泌能力產生影響。以上研究表明 MSC 的特性與功能會受到氧氣培養(yǎng)條件的影響。由于 BM-MSC 原始生長環(huán)境處于低氧狀態(tài)，因此有研究表明體外培養(yǎng)的低氧環(huán)境有利于保留 BM-MSC 的多種細胞特性，如多能性[23]、旁分泌活性[24]以及對 BM-MSC 在機體內發(fā)揮治療作用至關重要的遷移能力[25]。雖然已有多項研究證明低氧環(huán)境對 BM-MSC 體外培養(yǎng)有利，但目前尚沒有在不同低氧條件下探究不同個體來源 BM-MSC 細胞活力及遷移能力的相關研究。

本研究在 MSC 細胞特性鑒定的基礎上，使用不同低氧條件對 6 株不同個體來源 BM-MSC 的遷移能力進行驗證，并使用 CCK8 法探究不同氧氣培養(yǎng)條件對不同個體來源BM-MSC 細胞活力的影響。研究結果顯示在細胞快速生長期低氧條件下 BM-MSC 的細胞活力高于超低氧條件，低氧條件下 BM-MSC 遷移能力顯著高于超低氧條件。此外，在不同氧氣條件下，男性 BM-MSC 的細胞活力均具有高于女性 BM-MSC 的趨勢，而女性 BM-MSC 遷移能力較男性更強。針對不同個體 BM-MSC 的細胞活力進行分析，發(fā)現(xiàn)不同個體來源 BM-MSC 在不同氧氣條件下的細胞活力和遷移能力均有明顯差異。這些結果表明 BM-MSC 的細胞活力、遷移能力不僅受氧氣培養(yǎng)環(huán)境影響，還具備個體差異。

我們的研究結果提示需要關注不同個體來源 BM-MSC 的細胞特性，尤其是細胞生長動力學，在起始原材料篩選階段評估細胞系的差異對大規(guī)模生產產生的影響。氧氣條件及性別差異對 BM-MSC 的生物學特性及細胞功能的影響同樣值得關注，結果的確證需要更大樣本量和研究的數據支持。

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Effects of different donor sources and hypoxia conditions on the biological characteristics of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells

SUN Xue-fei, LI Jing-yi, CHEN Yuan, JIANG Qian-qian, ZHANG Ling-ling, WANG Lin, LIU Yuan-bo

Author Affilications: Hematology, Beijing Tiantan Hospital, Beijing 100070, China (SUN Xue-fei, LIU Yuan-bo); Jiuzhitang Maker (Beijing) Cell Technology Co., LTD., Beijing 102600, China (LI Jing-yi, CHEN Yuan, JIANG Qian-qian, ZHANG Ling-ling, WANG Lin)

To investigate the differences in biological properties of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from six different individual donors (male: M1, M2, M3; female: F1, F2, F3) under different low oxygen concentration.Flow cytometry anddifferentiation assays were performed to identify the biomarker expressions and tri-lineage differentiation abilities of MSCs. Transwell method was performed to assess cell migration ability. Cell viability under 5% and 1% oxygen were measured by CCK8 test.All six BM-MSC strains showed a high expression level (above 99%) for positive markers and a low expression level (below 2%) for negative markers, and had the ability to differentiate into three lineages. There are differences in the osteogenic and adipogenic differentiation efficiencies as well as cell viability of BM-MSC derived from different donors. And the differences in adipogenic differentiation may be associated with gender. Both cell viability and migration ability of BM-MSC showed variations between different oxygen conditions, with 5% oxygen conditions showing significantly better outcomes than 1% oxygen conditions, When both oxygen and gender factors were considered, it was found that BM-MSC derived from male donors showed a greater tendency for higher viability under various hypoxic conditions, whereas BM-MSC derived from female donors exhibited relatively stronger migration ability.The study suggests that specific standards should be established for the individual donor and the expansion conditions based on the desired characteristics for BM-MSC applications.

human bone marrow-derived mesenchymal stem cells; hypoxia; gender; cell viability

LIU Yuan-bo, Email: yuanbol@ccmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.002

劉元波，Email：yuanbol@ccmu.edu.cn

2023-04-07