BMI-1影響全反式維A酸對皮膚鱗狀細胞癌敏感性及其作用機制

劉彥婷,張欣悅,曾維惠,馬慧群,牛新武,耿松梅

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC)是最常見的皮膚惡性腫瘤,具有侵襲性和潛在的生命威脅［1-3］。低風險cSCC可通過局部治療或手術切除治愈,但不適合切除及高風險cSCC則對治療提出更高要求［1, 4］。全反式維A酸(all-trans retinoic acid, ATRA)具有調(diào)控細胞生長、分化和凋亡的重要作用,在多種腫瘤中抑制其發(fā)生和進展［5］。ATRA作為抗腫瘤藥物,已成功應用于腫瘤的預防和治療,包括急性早幼粒細胞白血病(APL)、非小細胞肺癌、乳腺癌和cSCC等［5-6］,并在2021年為《中國皮膚鱗狀細胞癌診療專家共識》推薦用于高風險SCC輔助治療［7］。但是,臨床上ATRA耐藥情況常見,cSCC對ATRA治療抵抗機制尚不明確［6］。

干細胞更新因子BMI-1在腫瘤的形成、浸潤及轉(zhuǎn)移過程和腫瘤耐藥機制中都有著非常重要的作用［8］。研究表明,沉默BMI-1可顯著改善胃癌、骨髓瘤和頭頸部鱗癌等腫瘤的化療敏感性,提高了抗腫瘤效率［8-10］。 BMI-1在cSCC組織和細胞系中的表達顯著增加,包括A431 細胞［11］。cSCC中BMI-1高表達是否影響其腫瘤細胞對ATRA治療的藥物敏感性尚不清楚。筆者推測,降低BMI-1表達可能成為增強ATRA敏感性的途徑。本研究通過構建BMI-1沉默的A431細胞株,通過細胞增殖能力及小鼠成瘤實驗,探討ATRA在cSCC治療中藥物敏感性的變化及其機制。

1 材料與方法

1.1構建BMI-1基因沉默A431細胞株 A431細胞系購于中國科學院細胞庫,采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法分別將無關序列vector和BMI-1干擾序列shBMI-1(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)轉(zhuǎn)染至A431細胞,經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選、傳代、收集和提取細胞的總RNA和蛋白,進行Real-time PCR、Western blot和免疫熒光檢測BMI-1的表達水平,確認成功構建BMI-1基因沉默的A431細胞系(A431-shBMI-1)。

1.2Real-time PCR 使用TRIzol試劑提取各組細胞RNA,借助Prime Script RT試劑盒 (Takara, 日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行PCR擴增 (Applied Biosystems PCR儀,美國),每個反應體系總體積為20 μL,每組設3個復孔,95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃30 s,40 cycles。檢測指標的引物如下:BMI-1:5′-CTGGTTGCCCATTGACAGCG -3′ and 5′-AAATCCCGGAAAGAGCAGCC -3′; ABCB1:5′-TGACTCAGGAGCAGAAGTTTGAACA-3′ and 5′-AAATACATCATTGCCTGGGTGAAG-3′; ABCC3:5′-GACAGATCCCAGATGGTGGTG-3′ and 5′-GGTGCTGCTGAAGCCTTGTG-3′; β-actin (internal control):5′-TGGCACCCAGCACAATGAA -3′ and 5′-C TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA -3′。結果分析:采用2-△△Ct法分析。

1.3Western blot 提取各組細胞的蛋白,裂解后測定每個樣本的蛋白濃度,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗BMI-1 (Abcam, 英國)、ABCB1 (Cell Signaling Technology, 美國)、ABCC3(Santa Cruz, 美國)和β-actin (Santa Cruz, 美國),4 ℃ 孵育過夜后用TBST洗膜液漂洗3次,再進行二抗 (Santa Cruz,美國)孵育,洗膜、發(fā)光、拍照,測定條帶的面積及灰度值,以平均灰度值表示蛋白質(zhì)相對含量,并計算目的蛋白/β-actin比值,表示目的蛋白在各組的相對表達水平。

1.4細胞增殖能力檢測 ① MTT法:用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,以每孔2×104個細胞接種到96孔板,ATRA(濃度:10、20、40、60、80 μmol/L)作用培養(yǎng)細胞24/48 h后,每孔加入MTT溶液20 μL,孵育4 h后終止培養(yǎng),加入DMSO,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上490 nm波長測定各孔光吸收值,記錄結果。② EdU法:分組同前,干預24 h后,每孔加入EdU培養(yǎng)基(試劑盒購于廣州銳博生物),細胞固定、染色、脫色、清洗等步驟后,于熒光顯微鏡下觀察結果,紅色熒光反應細胞DNA復制活性。

1.5小鼠成瘤實驗 20只6周齡雌性裸鼠購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心,分為2組,每組10只,分別于小鼠右側(cè)臀部注射A431-vector細胞和A431-shBMI-1細胞3×106個,于第6天進行隨機分組,即將之前的兩組分別再分為兩組,共4組(A431-vector組;A431-vector+ATRA組;A431-shBMI-1組;A431-shBMI-1+ATRA組),每組5只,第6～14天給予腹腔注射ATRA(10 mg/kg·d),測量瘤體大小及重量,于15 d(對照組腫瘤直徑10～15 mm)時處死小鼠,剝離瘤體并測量其大小及重量(瘤體體積=a×b2/2)。

1.6免疫組織化學 在動物實驗中,選取A431-vector細胞和A431-shBMI-1細胞成瘤的瘤體,進行石蠟包埋、切片、抗原修復、封閉、孵育一抗(BMI-1和RARβ,Abcam, 英國)、二抗、DAB顯色等步驟,完成BMI-1和RAR在瘤體中的免疫組化檢測。

2 結果

2.1檢測A431-shBMI-1細胞株的BMI-1表達 通過慢病毒轉(zhuǎn)染使BMI-1-shRNA序列進入靶基因后,導致BMI-1基因沉默,靶基因序列為GAAAGTAAACAAAGACAAA。提取A431、A431-vector和A431-shBMI-1三組細胞的RNA和蛋白,Real-time PCR(F=235.30,P<0.001)和Western blot結果(F=163.10,P<0.001)一致顯示,與陰性對照組(A431-vector)相比,A431-shBMI-1組細胞的BMI-1表達水平明顯降低,表明穩(wěn)定沉默BMI-1的A431細胞株構建成功,見圖1。

Note:* P<0.05 compared with the control group.

2.2沉默BMI-1后ATRA對A431細胞作用的影響 ATRA作用A431細胞48 h的殺傷效果強于24 h,且在同樣濃度的藥物作用下,BMI-1沉默組的細胞較對照組存活率更低,BMI-1沉默組的細胞需要較低的藥物濃度就可以達到與對照組同樣的殺傷率。BMI-1沉默組的細胞,增殖能力相比對照組細胞減弱;不同濃度的ATRA作用A431細胞24 h后發(fā)現(xiàn),同樣濃度的ATRA,BMI-1基因沉默組的細胞增殖能力明顯低于陰性對照組(t=17.19、7.30、6.93、8.57,P<0.01)。MTT和EdU結果一致顯示,沉默BMI-1能夠增加A431細胞對ATRA的作用敏感性,見圖2。

2.3檢測耐藥基因ABCB1和ABCC3的表達 通過Real-time PCR和Western blot方法檢測了BMI-1沉默前后A431細胞耐藥基因ABCB1和ABCC3的表達,結果顯示,與陰性對照組相比,BMI-1基因沉默組細胞耐藥蛋白的mRNA(F=54.45、13.85,P<0.01)和蛋白表達水平(F=469.54、172.10,P<0.001)明顯減少,這提示了沉默BMI-1可能通過下調(diào)耐藥蛋白在腫瘤細胞中的表達,從而提高A431細胞對ATRA的作用敏感性,見圖3。

2.4沉默BMI-1對ATRA抑制A431細胞成瘤能力的影響 小鼠成瘤后進行ATRA干預,檢測瘤體體積和腫瘤,瘤體體積的變化如下,與陰性對照組(612.01±231.74)mm3相比,BMI-1基因沉默組(205.13±46.05) mm3及ATRA作用組(283.20±98.12)mm3的腫瘤大小明顯減小,沉默BMI-1與ATRA聯(lián)合治療組(147.65±57.43)mm3的腫瘤體積最小(n=5,F=4.82,P<0.05)。瘤體重量的變化如下,與陰性對照組(437.20±122.12) mg相比,BMI-1基因沉默組( 193.60±44.77) mg及ATRA作用組(223.00±58.69) mg的腫瘤重量明顯降低,沉默BMI-1與ATRA聯(lián)合治療組(125.00±40.44) mg的腫瘤體積最小(n=5,F=5.36,P<0.05)。裸鼠成瘤實驗的體積曲線和腫瘤重量結果的趨勢一致,見圖4。

Note:*P< 0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared with the control group.

2.5小鼠成瘤中沉默BMI-1對維A酸受體β(retinoic acid receptor β, RARβ)表達的影響 為了驗證體內(nèi)實驗中BMI-1的敲減效率,在裸鼠成瘤的瘤體組織通過免疫組織化學方法檢測了BMI-1的表達,結果顯示,和陰性對照組相比,A431-shBMI-1組的瘤體中BMI-1表達顯著降低,再次證實BMI-1基因敲減成功。為了進一步研究BMI-1增強ATRA敏感性的機制,在瘤體中檢測RARβ的表達變化,與陰性對照組相比,BMI-1基因沉默組的RARβ表達明顯增加(t=144.63、116.93,P<0.001),提示RARβ可能參與了BMI-1改善ATRA耐藥的過程,見圖5。

3 討論

ATRA具有抑制腫瘤生長、誘導細胞分化和凋亡的能力,在多種癌癥中發(fā)揮了抗癌活性,包括cSCC［5-6, 12］。既往研究發(fā)現(xiàn),ATRA通過抑制端粒酶活性從而抑制cSCC細胞(HSC-1)的增殖［13］,ATRA通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) -AP1途徑從而抑制cSCC細胞生長、誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯［14］,表明ATRA對cSCC具有明確的抑制作用。筆者的研究發(fā)現(xiàn),ATRA以濃度和時間依賴的方式抑制A431細胞的增殖,在加入ATRA并孵育24 h和48 h后,MTT結果表明,高濃度ATRA對cSCC增殖有明顯抑制作用,這與文獻報道一致,再次證實了ATRA對cSCC細胞增殖的抑制作用。然而,臨床中存在高危型cSCC對ATRA治療不敏感,提示部分cSCC存在對ATRA耐藥的現(xiàn)象。為了避免高濃度ATRA藥物不良反應,提高ATRA對cSCC的療效,分析ATRA耐藥機制,探索增強ATRA的藥物敏感性具有非常重要的臨床意義。

腫瘤干細胞在ATRA耐藥過程中有重要貢獻,組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)能夠通過誘導腫瘤干細胞分化從而改善ATRA的治療抵抗［15］。已知干細胞更新因子BMI-1在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用,且在cSCC及維A酸作用不敏感的A431細胞中高表達,提示下調(diào)BMI-1可能成為增強ATRA作用cSCC的重要途徑。在本研究中,構建BMI-1沉默的A431細胞株,探討沉默BMI-1是否能增強ATRA對鱗狀細胞癌的藥物敏感性。結果表明,在ATRA處理后,沉默的BMI-1細胞的存活率與對照組相比顯著下降,并呈濃度和時間依賴性。此外,EdU結果顯示,ATRA處理24 h后,BMI-1沉默組細胞的增殖能力較對照組細胞明顯下降。上述結果提示,BMI-1高表達可能是A431細胞對ATRA治療抵抗的重要阻礙因素,而下調(diào)BMI-1表達可增加ATRA的藥物敏感性。

裸鼠成瘤實驗進一步證實了BMI-1對ATRA作用cSCC敏感性的影響,沉默BMI-1后,腫瘤的成瘤能力顯著下降,ATRA干預組的成瘤能力較對照組也顯著下降,這與細胞學實驗一致,表明沉默BMI-1或ATRA干預能夠抑制cSCC的進展。此外,單獨沉默BMI-1基因與單獨ATRA作用相比,前者對腫瘤生長的抑制作用更明顯,提示BMI-1基因?qū)[癌的進展非常重要,是一個不可忽視的有效的治療靶點。值得關注的是,在BMI-1沉默組使用ATRA干預后,腫瘤的成瘤能力下降最為顯著,提示沉默BMI-1和ATRA治療對抑制cSCC的增殖具有協(xié)同作用,也就是說,降低BMI-1表達能夠增加cSCC對ATRA的敏感性。

ATRA耐藥機制復雜,與維A酸受體異常、腫瘤干細胞、維A酸代謝和CRABP-Ⅱ和FABP5信號通路、耐藥蛋白表達等相關［5, 15］。在本研究中,沉默BMI-1一方面降低了腫瘤的干性,從而增強了ATRA的敏感性。另一方面,ABC轉(zhuǎn)運蛋白在多種惡性腫瘤中高表達,它們通過影響化療藥物的攝取和運輸,導致腫瘤的化療敏感性降低［16］。但是,在BMI-1調(diào)控A431細胞對ATRA敏感性的過程中,是否涉及ABC家族蛋白的改變尚不可知。本研究檢測了沉默BMI-1前后ABCB1和ABCC3兩種耐藥蛋白的表達,結果顯示,上述兩種耐藥蛋白的表達與BMI-1的表達呈正相關,降低BMI-1的表達明顯下調(diào)了ABCB1和ABCC3的蛋白表達水平。這一結果提示沉默BMI-1在增加ATRA作用敏感性的過程中,除了細胞干性降低以外,耐藥蛋白的表達下調(diào)也參與其中。此外,既往研究發(fā)現(xiàn),RARβ表達減少或缺失,是導致腫瘤對ATRA不敏感的重要原因之一,而重新升高RARβ表達后可恢復ATRA對細胞的促凋亡和周期停滯作用［17］。本研究在瘤體組織中檢測RARβ表達,發(fā)現(xiàn)BMI-1沉默組的RARβ表達顯著升高,因此,筆者推測,RARβ表達的增加可能參與了BMI-1對ATRA作用敏感性的調(diào)控。

綜上所述,沉默BMI-1和ATRA均可抑制cSCC腫瘤細胞增殖,且二者具有協(xié)同作用,即沉默BMI-1能夠顯著增強cSCC對ATRA的敏感性,耐藥蛋白的降低和維A酸受體RARβ表達的升高可能參與這一過程,提示BMI-1可能成為調(diào)控cSCC進展的重要靶點,并且,抑制BMI-1聯(lián)合ATRA可能成為治療cSCC的潛在策略。