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      乳酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞線粒體自噬的影響※

      2023-10-12 02:43:54王迦樂(lè)黃登亮張耀剛
      關(guān)鍵詞:溶酶體拷貝數(shù)低氧

      王迦樂(lè),黃登亮,張耀剛,姜 軍

      (1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2.青海大學(xué)研究生院,西寧 810016;3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科,西寧 810001)

      乳酸是腫瘤重要的代謝產(chǎn)物,低氧又是腫瘤的普遍特征,兩者之間的相互作用是否會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體功能產(chǎn)生影響?本研究通過(guò)相關(guān)研究初步探討乳酸對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞線粒體自噬的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 細(xì)胞株

      人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

      1.1.2 試劑與儀器

      乳酸(Sigma-Aldrich公司,L6402型),乳酸檢測(cè)試劑盒(Solarbio公司,A019-2型),二甲基亞砜DMSO(Solarbio公司,D8370型),胎牛血清(Biological Industries公司,04-001-1ACS型),0.1%胰酶(Gibco公司,27250018型),1640培養(yǎng)基(Gibco公司,23400-021型),FastStart Universal SYBR GreenMaster(Roche公司,04913914001型),MitoTracker?Deep Red FM線粒體深紅色熒光探針(Thermor Frsher Scientific公司,M2247型),CytoPainter LysoView Blue溶酶體染料(abcam公司,ab176825型),LC3B抗體(abcam公司,ab192890型),β-Actin 抗體(boster公司,BMO627型),TOM20抗體(abcam公司,ab56783型),HSP60抗體(Cell Signaling Technology公司,12165S型)。細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(BioTek公司,Cytation5型),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ROCHE公司,ROCHE Light Cycler 480Ⅱ型),超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(Nanodrop公司,Nanodrop 2000C型)。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

      將BEAS-2B、A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,置細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,95%濕度)培養(yǎng),2~3 d更換培養(yǎng)基,細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)用0.1%胰酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板或6孔板。將BEAS-2B、A549細(xì)胞分為常氧組(21%O2,5%CO2,37℃)、低氧組(1%O2,5%CO2,37℃)。將乳酸處理過(guò)的BEAS-2B、A549細(xì)胞分為常氧組(Lac-0、5、10 mM)、低氧組(Lac-0、5、10 mM)。

      1.2.2 乳酸測(cè)定

      將BEAS-2B、A549細(xì)胞接種于12孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè),在常氧和低氧條件下孵育24 h。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸濃度。

      1.2.3 線粒體DNA拷貝數(shù)分析

      使用酚-氯仿法提取細(xì)胞樣本的DNA,測(cè)定DNA濃度。將待測(cè)樣品稀釋為5 ng/μL??偡磻?yīng)體系:DNA 2 μL,2×SYBR Green 7.5 μL,上下游引物(10 μM)共3 μL,ddH2O 2.5 μL。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行待測(cè)樣品擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:預(yù)變性(95℃)10 min,變性(95℃)15 s,退火(60℃)延伸34 s,共40個(gè)循環(huán)。核DNA RPL13A基因上游引物:5′- CGCCCTACGACAAGAAAAAG-3′,下游引物:5′- CCGTAGCCTCATGAGCTGTT-3′;線粒體DNA mtCO1基因上游引物:5′-CAGGAGTAGGAGAGAGGGAGGTAAG-3′,下游引物:5′-TACCCATCATAATCGGAGGCTTTGG-3′。采用2-ΔΔCT 法分析mtCO1基因水平。

      1.2.4 自噬相關(guān)蛋白LC3B、HSP60、TOM20表達(dá)檢測(cè)

      收集低氧組和常氧組BEAS-2B、A549細(xì)胞,分別加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎、離心后提取蛋白,并用BCA法測(cè)定蛋白濃度,并將等量的蛋白(15 μg)加載到SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離蛋白后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用10%的脫脂奶粉封閉150 min后,用PBST緩沖液洗去膜表面多余的脫脂奶粉,按照不同目的蛋白大小將膜切開(kāi)并放入封口膜中,分別加入3 mL一抗孵育(4℃,過(guò)夜,β-Actin 1:1000,LC3B 1:1000,HSP60 1:1000,TOM20 1:4000)。用 PBST緩沖液洗膜后,加入3 mL山羊抗兔或山羊抗鼠 IgG(1:10000)孵育(室溫)1 h后,用PBST緩沖液洗膜30 min,加入適量超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑,放入暗匣中曝光、顯影。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值,以β-Actin蛋白為內(nèi)參照,對(duì)以上目的蛋白進(jìn)行灰度值分析,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白A值/內(nèi)參照A值。

      1.2.5 線粒體及溶酶體熒光強(qiáng)度共定位情況檢測(cè)

      將BEAS-2B、A549細(xì)胞接種于96孔板中,每種細(xì)胞接種12個(gè)孔(每孔接種100 μL細(xì)胞懸液,含4000個(gè)細(xì)胞),分設(shè)0、5、10 mM乳酸組;細(xì)胞貼壁后加乳酸,24 h后,棄原有培養(yǎng)基,加入100 μL含Mito tracker(線粒體染料)、CytoPainter LysoBlue(溶酶體染料)的培養(yǎng)基,Mito tracker的工作濃度為100 nM,CytoPainter LysoBlue的工作濃度為50 nM。染色(37℃,30 min)后棄含染料的培養(yǎng)基,加入100 μL PBS洗滌一次,再加入100 μL PBS,通過(guò)Cytation5酶標(biāo)儀檢測(cè)線粒體和溶酶體平均熒光強(qiáng)度及共定位情況。Mito tracker、CytoPainter LysoBlue檢測(cè)分別使用Texas Red和DAPI通道。

      1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      2 結(jié)果

      2.1 低氧條件對(duì)BEAS-2B、A549細(xì)胞內(nèi)乳酸生成的影響

      在常氧和低氧(1% O2)條件下培養(yǎng)BEAS-2B、A549細(xì)胞24 h,檢測(cè)其培養(yǎng)上清液中的乳酸含量。結(jié)果顯示,低氧培養(yǎng)條件下,BEAS-2B、A549細(xì)胞內(nèi)的乳酸生成明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

      表1 常氧和低氧條件下培養(yǎng)的BEAS-2B、A549細(xì)胞內(nèi)的乳酸生成情況

      2.2 低氧和乳酸對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

      相比于常氧培養(yǎng)組,低氧條件下A549細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)增加,BEAS-2B細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。由于低氧能使細(xì)胞內(nèi)的乳酸含量升高,故使用外源乳酸干預(yù)A549細(xì)胞分析乳酸對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。結(jié)果顯示,在常氧和低氧培養(yǎng)條件下,隨著乳酸濃度的進(jìn)一步增加,會(huì)引起A549細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)減少,BEAS-2B細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)增加。以上結(jié)果提示,外源乳酸干預(yù)能改變細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù),且對(duì)BEAS-2B、A549細(xì)胞的影響程度不同(表2)。

      表2 常氧和低氧條件下經(jīng)不同乳酸濃度處理的BEAS-2B、A549細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)

      2.3 外源乳酸對(duì)線粒體自噬的影響

      前述結(jié)果顯示,外源乳酸干預(yù)的BEAS-2B、A549細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)發(fā)生改變,在此基礎(chǔ)上分析乳酸對(duì)線粒體自噬的影響,以探索線粒體DNA拷貝數(shù)變化的原因。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在常氧和低氧培養(yǎng)條件下用乳酸干預(yù)的BEAS-2B、A549細(xì)胞中蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值增加(圖1、2和表3),提示經(jīng)乳酸干預(yù)后細(xì)胞自噬功能增強(qiáng)。進(jìn)一步分析線粒體熱休克蛋白(HSP60)和線粒體外膜蛋白(TOM20)的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),經(jīng)乳酸干預(yù)后,A549細(xì)胞中的HSP60、TOM20蛋白表達(dá)水平均降低(圖1),可能是線粒體自噬增強(qiáng)引起細(xì)胞內(nèi)線粒體含量減少所致;而在常氧和低氧條件下,乳酸干預(yù)的BEAS-2B細(xì)胞中的HSP60、TOM20蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變(圖2)。

      圖1 在常氧和低氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的A549細(xì)胞LC3B、HSP60、TOM20蛋白表達(dá)水平

      圖2 在常氧和低氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的BEAS-2B細(xì)胞LC3B、HSP60、TOM20蛋白表達(dá)水平

      表3 在常氧和低氧條件下用不同濃度乳酸處理BEAS-2B、A549細(xì)胞的LC3B蛋白表達(dá)量灰度值

      2.4 外源乳酸對(duì)線粒體和溶酶體共定位信號(hào)的影響

      由于線粒體自噬需要依賴(lài)溶酶體完成,故用線粒體和溶酶體熒光染料標(biāo)記活細(xì)胞觀察線粒體和溶酶體熒光信號(hào)共定位信號(hào)情況。分析結(jié)果顯示,在常氧和低氧條件下,和對(duì)照組相比,乳酸干預(yù)后的A549細(xì)胞中線粒體和溶酶體共定位信號(hào)增多(圖3、4和表4)。結(jié)合乳酸干預(yù)后的A549細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)減少,線粒體HSP60和線粒體TOM 20蛋白表達(dá)水平下降,提示,外源乳酸可能引起A549細(xì)胞線粒體自噬增強(qiáng)。

      圖3 在常氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的A549細(xì)胞線粒體和溶酶體共定位信號(hào)

      圖4 在低氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的A549細(xì)胞線粒體和溶酶體共定位信號(hào)

      表4 常氧和低氧條件下經(jīng)不同乳酸濃度處理后的A549細(xì)胞線粒體和溶酶體共定位熒光強(qiáng)度值

      3 討論

      近年來(lái),免疫治療的興起為非小細(xì)胞肺癌的治療帶來(lái)了一線生機(jī)。機(jī)體免疫系統(tǒng)負(fù)責(zé)監(jiān)控和殺傷腫瘤細(xì)胞,為了躲避免疫攻擊,腫瘤細(xì)胞常常增強(qiáng)一些關(guān)鍵的免疫抑制蛋白的表達(dá),以程序性死亡分子1(programmed cell death protein1,PD1)及其配體(programmed cell death protein 1 ligand 1,PD-L1)最為常見(jiàn),這些分子能抑制免疫細(xì)胞的激活,進(jìn)而減弱免疫應(yīng)答。免疫治療則是通過(guò)上述免疫抑制蛋白的抑制劑來(lái)激活免疫效應(yīng)細(xì)胞,以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[1]。而被腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞則是免疫治療中被激活的主要效應(yīng)細(xì)胞[2]。乳酸作為腫瘤微環(huán)境(TME)中的主要代謝物之一,它可以調(diào)節(jié)先天性免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的代謝,抑制CD+8T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的活化和增殖。越來(lái)越多的研究表明,從癌細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞流出的質(zhì)子偶聯(lián)乳酸在保持酸性表型方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用,并通過(guò)調(diào)節(jié)TME加速腫瘤進(jìn)展,包括細(xì)胞侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移發(fā)展和逃避免疫監(jiān)視[3]。在肺癌模型中也發(fā)現(xiàn)了乳酸化的組蛋白,提示乳酸在肺癌細(xì)胞中很可能也通過(guò)組蛋白乳酸化修飾調(diào)控肺癌細(xì)胞和微環(huán)境組分細(xì)胞的基因表達(dá)[4]??梢?jiàn),深入了解肺癌的免疫微環(huán)境特征是理解非小細(xì)胞肺癌腫瘤免疫調(diào)控機(jī)制及尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)的關(guān)鍵。故本研究通過(guò)探求由低氧和乳酸構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境對(duì)肺癌細(xì)胞線粒體自噬的影響,尋找免疫靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性。

      線粒體功能障礙所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是癌癥的主要驅(qū)動(dòng)因素之一[5]。線粒體是所有真核細(xì)胞的 “動(dòng)力工廠”,其主要功能是通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞提供三磷酸腺苷(ATP),同時(shí),還參與細(xì)胞代謝、增殖、衰老及程序性死亡等過(guò)程[6]。對(duì)于正常細(xì)胞來(lái)說(shuō),主要依賴(lài)線粒體氧化磷酸化來(lái)獲取生命活動(dòng)所需的ATP,而在腫瘤細(xì)胞中卻普遍存在能量代謝方式的改變情況,被稱(chēng)為“有氧糖酵解”,即在氧氣充足的條件下,腫瘤細(xì)胞仍然采用糖酵解的方式產(chǎn)生ATP[7]。線粒體是高等動(dòng)物細(xì)胞核外唯一含有DNA的細(xì)胞器。mtDNA的功能實(shí)現(xiàn)不但與其結(jié)構(gòu)完整性有關(guān),還與其拷貝數(shù)有關(guān)。線粒體DNA拷貝數(shù)代表了每個(gè)細(xì)胞的線粒體數(shù)目及線粒體基因組數(shù)目,是衡量線粒體功能的指標(biāo)之一[8]。本研究結(jié)果提示,人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)在無(wú)外源乳酸干預(yù)的情況下,低氧組相較于常氧組,線粒體DNA拷貝數(shù)有所增加,但在常氧和低氧條件下隨著乳酸濃度的增加,線粒體拷貝數(shù)減少,說(shuō)明低氧環(huán)境和乳酸對(duì)A549細(xì)胞的影響是不完全一致的,可能在于低氧環(huán)境不單增加乳酸濃度還會(huì)產(chǎn)生其他影響,如HIF信號(hào)通路的激活等[9,10]。

      自噬是一種高度保守的自我消化和分解代謝過(guò)程,受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器聚集在自噬體內(nèi),然后通過(guò)與溶酶體融合來(lái)降解,以維持細(xì)胞的新陳代謝和穩(wěn)定[11]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的誘因源于營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足、細(xì)胞毒劑的毒害等。[12-14]。大量研究證實(shí),自噬對(duì)腫瘤的發(fā)生有積極的調(diào)控作用。微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)是最常用的自噬相關(guān)標(biāo)記[15],是癌癥中最常見(jiàn)的LC3亞型,在自噬過(guò)程中,LC3-Ⅰ通過(guò)類(lèi)泛素系統(tǒng)的脂化作用轉(zhuǎn)移到LC3-Ⅱ中。LC3-Ⅱ的含量與自噬水平相關(guān),因此可作為自噬水平的標(biāo)志。熱休克蛋白60是一種重要的分子伴侶蛋白[16],位于2號(hào)染色體上,由核基因HSPD1[17]編碼,主要分布在線粒體中,在輔助伴侶蛋白HSP10的幫助下發(fā)揮作用,糾正新生蛋白質(zhì)的折疊,恢復(fù)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),并維持線粒體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)[18],是維持線粒體呼吸鏈的完整性和功能的正常性以及細(xì)胞生存所必需的過(guò)程[19]。故本研究首先檢測(cè)自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ比值,得出在常氧或低氧條件下,經(jīng)外源乳酸干預(yù)后,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)較正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)自噬增加的結(jié)果,而后通過(guò)檢測(cè)HSP60和線粒體TOM20的表達(dá)水平,分析線粒體與溶酶體熒光共定位信號(hào)的情況,進(jìn)一步驗(yàn)證了乳酸與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)線粒體自噬的發(fā)生有關(guān)。

      綜上所述,在常氧或低氧條件下,乳酸濃度的上調(diào)可以通過(guò)增加線粒體自噬和減少線粒體拷貝數(shù)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞線粒體功能產(chǎn)生影響。在腫瘤早期,細(xì)胞相對(duì)處于常氧環(huán)境下,自噬可通過(guò)清除損傷的大分子或ROS產(chǎn)物抑制腫瘤的進(jìn)展。而在腫瘤晚期,腫瘤細(xì)胞處于低氧條件下,自噬通過(guò)維持腫瘤細(xì)胞的生存促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究證實(shí),線粒體自噬可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中,致癌KRas細(xì)胞會(huì)誘發(fā)線粒體自噬的發(fā)生。在低氧條件下,腫瘤細(xì)胞發(fā)生糖酵解,并產(chǎn)生大量乳酸。ATP能量減少致細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而,線粒體自噬可以克服這種能量的缺乏[20,21]。因此,研究乳酸在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制,有助于通過(guò)免疫治療攻克非小細(xì)胞肺癌的研究;進(jìn)一步研究在低氧狀態(tài)下,乳酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲的影響,可為全面攻克非小細(xì)胞肺癌發(fā)揮重要作用。

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