放血療法促高原慢性低氧下雄性大鼠紅細(xì)胞衰亡的實(shí)驗(yàn)研究※

馮 琳,王順娟,劉文婧,李潤樂,湯 鋒

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810001;2.青海省人民醫(yī)院,西寧 810007;3.青海省藏醫(yī)院,西寧 810007;4.青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,西寧 810016;5.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用與基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001)

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在慢性低氧環(huán)境下紅細(xì)胞生成增加、衰亡減少。此研究結(jié)果在國際學(xué)界首次報(bào)道,并引發(fā)廣泛關(guān)注[1]。據(jù)此推測放血療法可促高原慢性低氧下雄性大鼠紅細(xì)胞衰亡。本課題就此開展相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組

SD雄性大鼠購自重慶騰鑫生物西安分公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0002],200 g/只。分為對照組(Control)、低氧組(Hypoxia)和放血組(Phlebotomy)。

本研究通過青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查。

1.1.2 主要試劑和儀器

Annexin V-FITC、Retic-Count和高速分選流式細(xì)胞儀購自BD公司,中型低壓氧艙購自貴州哈雷空天環(huán)境工程有限公司,全自動(dòng)血液體液分析儀購自希森美康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢性低氧下紅細(xì)胞增多雄性大鼠模型建立

Control置青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心動(dòng)物房28 d,Hypoxia和Phlebotomy置醫(yī)學(xué)院低壓氧艙28 d,Phlebotomy分別于第7、14、21 d經(jīng)尾靜脈放血500 μL。

1.2.2 血細(xì)胞分析

Phlebotomy于第7、14、21 d用EDTA抗凝管采血500 μL,檢測紅細(xì)胞(Red blood cell count,RBC)數(shù)目、血紅蛋白(Hemoglobin,HGB)含量、血細(xì)胞容積(Hematocrit,HCT)、血小板(Platelet,PLT)數(shù)量等指標(biāo)。并于第28 d取三組雄性大鼠全血進(jìn)行上述項(xiàng)目檢測。

1.2.3 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)

配置梯度濃度生理鹽水1號(6.8 g/L NaCl)、2號(6.4 g/L NaCl)……12號(2.4 g/L NaCl)和13號生理鹽水(0.9%)及14號尿素(1.9%)、15號去離子水。流式管中按序號各添加500 μL溶液,管中滴入一滴全血(約50 μL),靜置30 min觀察血液滲透脆性并記錄。

1.2.4 紅細(xì)胞衰亡檢測

全血離心(800 r/min)10 min,取血漿凍存。制備1×bufferr[Annexin V-FITC(BD)]溶液,每管取1×106個(gè)紅細(xì)胞,用1×PBS緩沖液清洗兩次。每管取1×106個(gè)紅細(xì)胞添加5 μL FITC試劑,在室溫下避光孵育20 min,添加1×bufferr[Annexin V-FITC(BD)]溶液至終體積500 μL,過濾膜后使用流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞衰亡水平。

1.2.5 網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測

全血離心(800 r/min)10 min,取血漿凍存。每管取5 μL紅細(xì)胞添加1 mL Retic-CountTM染色劑,在室溫下避光孵育30 min。離心(800 r/min)5 min棄上清,加入1 mL 1×PBS緩沖液,清洗兩次,最后添加1×PBS緩沖液至終體積500 μL,過濾膜后使用流式細(xì)胞儀檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞(Reticulocyte,Ret)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 放血對血細(xì)胞的影響

Hypoxia雄性大鼠置于模擬海拔5 000 m的低壓氧艙飼養(yǎng)4 w時(shí)從尾靜脈采血,進(jìn)行血常規(guī)檢測,結(jié)果見表1。Hypoxia紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量顯著增加,Phlebotomy相比于Control雖有增加,但明顯低于Hypoxia。同樣,Hypoxia紅細(xì)胞比容顯著高于Control和Phlebotomy。Control血小板數(shù)量顯著高于Hypoxia和Phlebotomy,同時(shí)Phlebotomy相比于Hypoxia明顯增加。

Table 1 Blood Cell Count Analysis

2.2 放血對紅細(xì)胞滲透脆性的影響

紅細(xì)胞起始溶血濃度為(5.2～4.4)g/L NaCl溶液,至低滲溶液中完全破裂,結(jié)果見圖1。低氧促使紅細(xì)胞在高于5.2 g/L濃度的NaCl溶液中破裂,紅細(xì)胞滲透脆性增加。Phlebotomy和Control溶血水平基本一致。Phlebotomy、Control紅細(xì)胞在NaCl溶液中起始溶血的濃度為5.2 g/L,Hypoxia紅細(xì)胞在NaCl溶液中起始溶血的濃度為6.0 g/L。結(jié)果見表2。

Table 2 Hemolysis of different tube numbers in each group(%)

Figure 1 Hypoxia increases the osmotic fragility of erythrocytes,which can be relieved by phlebotomy

2.3 放血對紅細(xì)胞衰亡的影響

Hypoxia雄性大鼠紅細(xì)胞衰亡減少。表3顯示,低氧可以抑制紅細(xì)胞衰亡,經(jīng)過放血治療,Phlebotomy紅細(xì)胞衰亡數(shù)量較Hypoxia顯著增加。流式結(jié)果顯示紅細(xì)胞衰亡:Hypoxia(0.07±0.01)與Phlebotomy(0.10±0.02)相比,P=0.001;Control(0.10±0.01)與Hypoxia(0.07±0.01)相比,P=0.001。

Table 3 Eryptosis was analyzed in different groups by flow cytometry

圖2顯示,放血可以促進(jìn)紅細(xì)胞在低氧下的衰亡;圖3顯示,當(dāng)紅細(xì)胞數(shù)量逐漸趨于正常狀態(tài)時(shí),紅細(xì)胞衰亡數(shù)量逐漸減少。結(jié)果見表4,2 w(0.20±0.01)與3 w(0.15±0.02)相比,P=0.001;3 w(0.15±0.02)與4 w(0.09±0.02)相比,P=0.001。

(A)and(B)Rat erythrocytes binding Annexin V-FITC after phlebotomy in three group

(A)and(B)Rat erythrocytes binding Annexin V-FITC after phlebotomy during the first week to the fourth week

Table 4 Dynamic results of eryptosis by flow cytometry

2.4 放血對網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響

圖4、表5顯示,網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量增加則新生紅細(xì)胞增加,隨之成熟紅細(xì)胞的數(shù)量增加,低氧和放血療法均可以刺激網(wǎng)織紅細(xì)胞增加,Hypoxia(0.04±0.01)與Phlebotomy(0.05±0.02)相比,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而網(wǎng)織紅細(xì)胞Phlebotomy動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)結(jié)果如圖4、表6,放血后網(wǎng)織紅細(xì)胞的增加始終維持在固定范圍,不會(huì)持續(xù)增加,1 w( 0.04±0.03)、2 w(0.05±0.04)、3 w(0.04±0.02)、4 w(0.06±0.03)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(A)and(B)is reticulocyte in Different groups at the same time.(C)and(D)is Dynamic analysis of reticulocyte

Table 5 Reticulocyte in different groups by flow cytometry

3 討論

放血療法雖被應(yīng)用于相關(guān)疾病治療[2],但目前針對其作用機(jī)制并無明確說明。本研究基于前期研究基礎(chǔ),提出放血療法可改善低氧對紅細(xì)胞衰亡的抑制作用。

紅細(xì)胞在長期慢性低氧環(huán)境下由代償性增加逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檫^度增加,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)慢性低氧促進(jìn)新生紅細(xì)胞增加、抑制成熟紅細(xì)胞衰亡。同時(shí)新生紅細(xì)胞增加,紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量不斷增加,紅細(xì)胞比容增加,血液粘稠致血流速度緩慢,加重機(jī)體微循環(huán)障礙及其他癥狀[3]。而放血使紅細(xì)胞數(shù)量減少、紅細(xì)胞比容降低、血液黏滯度下降,從而改善機(jī)體微循環(huán)障礙。

在紅細(xì)胞的生命周期里,紅細(xì)胞需要不斷經(jīng)受血流的高壓沖擊,經(jīng)過微小血管時(shí)不斷被擠壓,此過程中的紅細(xì)胞需要具有高度的變形性和結(jié)構(gòu)的完整性。慢性低氧延緩紅細(xì)胞程序性死亡致衰老的紅細(xì)胞增加,數(shù)量增加致細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則、紅細(xì)胞脆性增加、抵抗力減弱,在血流的沖擊和微血管的擠壓下,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到破壞,可塑性降低[4]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)放血干預(yù)后,紅細(xì)胞變形能力增強(qiáng)、脆性降低,功能恢復(fù)、抵抗力增加,在運(yùn)輸過程中不易被破壞,更易通過微小血管完成物質(zhì)交換。

雖然放血可以促進(jìn)紅細(xì)胞衰亡,但適當(dāng)?shù)姆叛⒉粫?huì)持續(xù)增加紅細(xì)胞的衰亡。針對放血療法,不論是治療高原紅細(xì)胞增多癥、真性紅細(xì)胞增多癥或其他疾病均效果明顯[5,6],放血排出的不止是成熟紅細(xì)胞,同時(shí)還包括各個(gè)階段的未成熟紅細(xì)胞,機(jī)體感應(yīng)到未成熟紅細(xì)胞減少,會(huì)自發(fā)生產(chǎn)紅細(xì)胞,紅細(xì)胞會(huì)代償性增加。網(wǎng)織紅細(xì)胞是晚幼紅細(xì)胞脫核后的未成熟紅細(xì)胞,最終發(fā)展成成熟紅細(xì)胞,是衡量骨髓造血功能和新生紅細(xì)胞的重要指標(biāo)[7]。本研究結(jié)果顯示,雖然Hypoxia和Phlebotomy網(wǎng)織紅細(xì)胞均有增加,但放血導(dǎo)致的紅細(xì)胞增加不同于低氧引起的紅細(xì)胞增加,低氧造成的紅細(xì)胞增加是一種長期、慢性的惡性循環(huán),最終導(dǎo)致紅細(xì)胞越來越多。而放血組動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)顯示,網(wǎng)織紅細(xì)胞的增加始終保持在一個(gè)范圍內(nèi),各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述,放血療法可促進(jìn)高原慢性低氧下雄性大鼠紅細(xì)胞的衰亡,降低慢性低氧對雄性大鼠紅細(xì)胞衰亡的抑制作用。同時(shí)放血不會(huì)持續(xù)刺激雄性大鼠紅細(xì)胞衰亡,也不會(huì)持續(xù)刺激雄性大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞增加。