房水與角膜樣本對皰疹病毒陽性角膜移植后不同層次病毒DNA檢測效率比較

臧云曉 彭榮梅 肖格格 何林輝 洪晶

北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科 眼部神經(jīng)損傷的重建保護與康復(fù)北京市重點實驗室,北京 100191

目前已知感染角膜組織的病毒多為皰疹病毒,包括1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV),上述皰疹病毒可以分布于角膜任何層次,造成不同層次的角膜感染[1]。在既往研究中,HSV-1相關(guān)的角膜感染多見于角膜上皮層和基質(zhì)層。有研究顯示,在357例新發(fā)HSV角膜炎中,角膜上皮炎和基質(zhì)炎分別占66%和30%[2]。HSV角膜內(nèi)皮炎未見流行病學(xué)報道;VZV可以感染角膜各個層次,但常見于角膜基質(zhì)炎和內(nèi)皮炎[3-4];CMV主要造成角膜內(nèi)皮炎[5],在亞洲人群中常見,日本一項研究顯示,在29例病因未明的角膜內(nèi)皮炎中,CMV DNA陽性率為24%[6]。CMV角膜上皮炎和基質(zhì)炎僅有少量病例報道[7-8];目前對EBV角膜感染知之甚少,僅在干燥性角結(jié)膜炎患者的淚液、角膜基質(zhì)炎和角膜內(nèi)皮炎的房水中檢測到EBV DNA存在[5,9-10]。本課題組前期研究顯示,在連續(xù)收集的44例病毒性角膜內(nèi)皮炎患者中,CMV、HSV、VZV和EBV的占比分別為45%(20/44)、18%(8/44)、23%(10/44)和14%(6/44)[4]。當(dāng)前,皰疹病毒性角膜炎的診斷主要依據(jù)臨床癥狀和體征,例如HSV角膜上皮炎在特殊時期存在典型的樹枝狀或地圖狀角膜上皮缺損;VZV角膜基質(zhì)炎表現(xiàn)為對應(yīng)部位的基質(zhì)混濁,通常發(fā)生在皮疹痊愈后;大多數(shù)CMV角膜內(nèi)皮炎可見錢幣狀角膜后沉著物、局限性角膜水腫以及輕度前葡萄膜炎[11]。然而,一些不被人們熟知的皰疹病毒性角膜炎,如HSV角膜內(nèi)皮炎、CMV角膜基質(zhì)炎等往往無法通過臨床特征診斷。實時熒光定量PCR是近年來廣泛應(yīng)用于眼部皰疹病毒感染的一種檢測方法,該方法可以幫助診斷之前無法確診病原體的病毒性角膜炎[12-13]。病毒DNA PCR檢測可以幫助確定皰疹病毒種類[14],從而明確診斷和調(diào)整用藥。在皰疹病毒角膜炎的病毒DNA檢測中,角膜和房水是2種常用的取材檢測樣本,在角膜移植患者中非常容易獲取[13]。然而,對于非角膜移植患者,角膜通常難以獲取,房水也需要進行前房穿刺才能獲得,因其為有創(chuàng)操作,增加了眼部感染和出血的風(fēng)險,很多患者不愿接受,因此經(jīng)驗性診治仍然是目前的臨床現(xiàn)狀。然而,經(jīng)驗性治療使得在抗病毒藥物的選擇上存在困難,往往貽誤最佳治療時機。本研究選取皰疹病毒DNA陽性的角膜移植患者,通過分析皰疹病毒DNA在角膜層次中的分布,比較角膜和房水樣本在該人群中的病毒DNA檢測效率,旨在提高臨床皰疹病毒DNA的檢出率,明確皰疹病毒性角膜炎的分類診斷,盡早開展合理治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用診斷試驗研究方法,收集2015年5月至2021年8月在北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科行角膜移植手術(shù)且術(shù)中行房水和/或角膜組織病毒學(xué)檢測的患者資料。納入患者至少有1種樣本病毒檢測結(jié)果陽性。病毒檢測包括CMV、VZV、HSV-1、HSV-2和EBV。納入標(biāo)準:(1)既往或目前存在角膜炎癥反應(yīng);(2)存在相應(yīng)部位角膜病變;(3)符合不同皰疹病毒角膜感染的臨床癥狀和體征;(4)房水和/或角膜組織的病毒檢測陽性。排除標(biāo)準:(1)2種或2種以上皰疹病毒陽性的患者;(2)由于臨床證據(jù)不足無法判斷角膜病變層次的患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(批文號:M2021283),入組患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1資料收集和分析指標(biāo) 通過北京大學(xué)第三醫(yī)院臨床病歷系統(tǒng)收集皰疹病毒DNA陽性患者的一般資料,包括性別、年齡、皰疹病毒類別和病變層次。分析皰疹病毒DNA在角膜的分布層次和比例。樣本檢測種類包括角膜和房水。病變層次依據(jù)手術(shù)方式和輔助檢查結(jié)果進行判斷。病變層次分為角膜內(nèi)皮層和基質(zhì)層。因角膜基質(zhì)病變行前部板層角膜移植術(shù)(anterior lamellar keratoplasty,ALK)或穿透角膜移植術(shù)(penetrating keratoplasty,PKP)而術(shù)中觀察內(nèi)皮層正常者視為基質(zhì)層病變,因角膜水腫無基質(zhì)浸潤和瘢痕而行角膜內(nèi)皮移植術(shù)(Descemet stripping automated endothelial keratoplasty,DSAEK)的患者視為內(nèi)皮層病變。

通過北京大學(xué)第三醫(yī)院臨床醫(yī)囑系統(tǒng)收集同時存在角膜和房水雙樣本病毒DNA檢測結(jié)果患者的臨床和樣本資料,分析不同種類皰疹病毒在角膜和房水中病毒DNA檢測的樣本數(shù)和比率,通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲線下面積(area under curve,AUC)評估不同皰疹病毒在角膜和房水中的病毒檢測效率,即靈敏度。

1.2.2樣本收集 角膜移植手術(shù)操作均由同一經(jīng)驗豐富的眼科醫(yī)生完成,手術(shù)方式分為PKP、ALK和DSAEK。在角膜移植術(shù)中采集角膜和房水樣本。在鉆取角膜組織前,用1 ml注射器行前房穿刺抽取足量房水,然后處理患者病變角膜組織。術(shù)中刮除患者角膜上皮組織,取下的病變角膜若為板層組織,撕除角膜前部板層,留取角膜后部基質(zhì)層送檢;若為全層角膜,則分別撕取角膜內(nèi)皮層和基質(zhì)層,并分別送檢;若為內(nèi)皮層則直接送檢。

1.2.3PCR法檢測病毒種類 取出的房水和角膜分別放入1.5 ml EP管中,送至北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科臨床檢驗中心進行檢測。根據(jù)產(chǎn)品說明,使用QIAamp DNA微量試劑盒(德國Qiagen公司),從獲取的角膜或房水中提取DNA。將檢測樣品置于1.5 ml離心管中并用加有蛋白酶K的緩沖液ATL消化。將提取到的DNA在DEPC水(上海碧云天生物技術(shù)公司)中稀釋;DNA均定量50 ng進行PCR。按照說明,使用熒光定量PCR儀(美國PE Biosystems公司),通過基于TaqMan探針熒光定量PCR的方法(HSV-1、HSV-2 RT-PCR試劑盒,Z-SD-0136-02;VZV RT-PCR試劑盒,OD-0024-02;CMV RT-PCR試劑盒,Z-OD-002-02;EBV RT-PCR試劑盒,Z-OD-0023-02;上海之江生物科技股份有限公司)進行檢測。病毒DNA的檢測限度為每個樣品大小10個拷貝。每個樣品均添加內(nèi)部對照以評估分離和擴增功效。試劑盒制造商提供陽性、陰性和內(nèi)部對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 皰疹病毒DNA陽性的病毒種類

共納入角膜移植術(shù)中皰疹病毒DNA陽性患者166例166眼,其中CMV DNA檢出率最高,陽性75眼(占45.2%),男34眼,女41眼,平均年齡(40±29)歲;其次為HSV-1 DNA,陽性34眼(占20.5%),男27眼,女7眼,平均年齡(59±21)歲;第3位為VZV DNA,陽性30眼(占18.1%),男17眼,女13眼,平均年齡(45±26)歲;第4位為EBV DNA,陽性27眼(占16.3%),男12眼,女15眼,平均年齡(46±29)歲;未檢測到HSV-2陽性者。

2.2 皰疹病毒DNA在角膜的層次分布比較

CMV和VZV DNA在角膜內(nèi)皮層分布者分別為47眼(占62.7%)和26眼(占86.7%),明顯多于基質(zhì)層的28眼(占37.3%)和4眼(占13.3%),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.813、16.133,均P<0.05)。HSV-1和EBV DNA在角膜內(nèi)皮層分布者分別為8眼(占23.5%)和5眼(占18.5%),分別少于基質(zhì)層的26眼(占76.5%)和22眼(占81.5%),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.529、10.704,均P<0.001)(表1)。

表1 皰疹病毒DNA在角膜的檢出層次分布比較[眼數(shù)(%)]Table 1 Comparison of layer distribution of herpesvirus DNA detection in cornea [eyes (%)]病變層次總眼數(shù)CMV DNA陽性VZV DNA陽性HSV-1 DNA陽性EBV DNA陽性基質(zhì)層8028(37.3)4(13.3)26(76.5)22(81.5)內(nèi)皮層8647(62.7)26(86.7)8(23.5)5(18.5)χ2值4.81316.1339.52910.704P值<0.05<0.001<0.001<0.001 注:(χ2檢驗) CMV:巨細胞病毒;VZV:水痘-帶狀皰疹病毒:HSV:單純皰疹病毒;EBV:EB病毒 Note:(χ2test) CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Ep-stein-Barr virus

2.3 皰疹病毒DNA在角膜和房水樣本中的檢測效率

在皰疹病毒DNA陽性患者的166眼中,具有房水和角膜雙樣本病毒檢測結(jié)果者73眼,其中CMV、VZV、HSV-1、EBV DNA陽性的樣本數(shù)分別為28、14、18和13眼。在73眼146例檢測樣本中,CMV、VZV、EBV角膜陽性房水陰性、房水陽性角膜陰性、角膜和房水均陽性占比總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.143、6.143、11.231,均P<0.05)(表2)。皰疹病毒DNA陽性樣本的檢測靈敏度結(jié)果顯示,角膜樣本的病毒PCR檢測總體靈敏度為71.6%,高于房水的54.1%,其中,CMV和VZV DNA陽性的角膜樣本檢測靈敏度分別為64.3%(AUC=0.821,95%CI:0.705～0.938)和35.7%(AUC=0.679,95%CI:0.475～0.882),分別低于房水樣本的71.4%(AUC=0.875,95%CI:0.750～0.964)和85.7%(AUC=0.929,95%CI:0.816～1.000)。HSV-1和EBV DNA陽性的角膜樣本檢測靈敏度分別為100%(AUC=1.000,95%CI:1.000～1.000)和92.3%(AUC=0.962,95%CI:0.875～1.000),明顯高于房水樣本的27.8%(AUC=0.639,95%CI:0.455～0.823)和23.1%(AUC=0.615,95%CI:0.395～0.835)(表3,圖1)。

表2 皰疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒檢測結(jié)果比較[眼數(shù)(%)]Table 2 Comparison of herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples [eyes (%)]類別總眼數(shù)CMV DNA陽性VZV DNA陽性HSV-1 DNA陽性EBV DNA陽性角膜陽性房水陰性33(44.6)8(28.6)2(14.3)13(72.2)10(77.0)房水陽性角膜陰性20(27.0)10(35.7)9(64.3)0(0.0)1(7.7)角膜和房水均陽性20(27.0)10(35.7)3(21.4)5(27.8)2(15.4)χ2值4.2435.1436.1433.55911.231P值0.1200.0230.0460.0590.004 注:(χ2檢驗) CMV:巨細胞病毒;VZV:水痘-帶狀皰疹病毒:HSV:單純皰疹病毒;EBV:EB病毒 Note:(χ2 test) CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Ep-stein-Barr virus

表3 皰疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒檢測效率[例數(shù)(%)]Table 3 Efficiency of herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples [cases (%)]樣本類別總例數(shù)CMV DNA陽性VZV DNA陽性HSV-1 DNA陽性EBV DNA陽性角膜組織PCR陽性53(36.3)18(32.1)5(17.9)18(50.0)12(46.1)角膜組織PCR陰性20(13.7)10(17.9)9(32.1)0(0.0)1(3.8)AUC0.8580.8210.6791.0000.96295% CI0.793-0.9230.705-0.9380.475-0.8821.000-1.0000.875-1.000靈敏度71.6%64.3%35.7%100%92.3%房水樣本PCR陽性40(27.4)20(35.7)12(42.9)5(13.9)3(11.5)房水樣本PCR陰性33(22.6)8(14.3)2(7.1)13(36.1)10(38.5)AUC0.7700.8750.9290.6390.61595% CI0.692-0.8490.750-0.9640.816-1.0000.455-0.8230.395-0.835靈敏度54.1%71.4%85.7%27.8%23.1% 注:CMV:巨細胞病毒;VZV:水痘-帶狀皰疹病毒;HSV:單純皰疹病毒;EBV:EB病毒;AUC:曲線下面積;CI:置信區(qū)間 Note:CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Epstein-Barr vi-rus;AUC:area under curve;CI:confidence interval

圖1 皰疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒檢測ROC曲線 A:病毒檢測ROC曲線 角膜樣本AUC=0.858,房水樣本AUC=0.770 B:CMV檢測ROC曲線 角膜樣本AUC=0.821,房水樣本AUC=0.875 C:VZV檢測ROC曲線 角膜樣本AUC=0.679,房水樣本AUC=0.929 D:HSV-1檢測ROC曲線 角膜樣本AUC=1.000,房水樣本AUC=0.639 E:EBV檢測ROC曲線 角膜樣本AUC=0.962,房水樣本AUC=0.615Figure 1 ROC curves for herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples A:ROC curves for overall viral detection AUC for corneal samples was 0.858,and for aqueous humor samples was 0.770 B:ROC curves for CMV detection AUC for corneal samples was 0.821,and for aqueous humor samples was 0.875 C:ROC curves for VZV detection AUC for corneal samples was 0.679,and for aqueous humor samples was 0.929 D:ROC curves for HSV-1 detection AUC for corneal samples was 1.000,and for aqueous humor samples was 0.639 E:ROC curves for EBV detection AUC for corneal samples was 0.962,and for aqueous humor samples was 0.615

3 討論

針對不同種類的皰疹病毒,抗病毒藥物選擇存在差異。美國HEDS(The Herpetic Eye Disease Studies)提出,阿昔洛韋對HSV/VZV感染治療效果較好,之后發(fā)現(xiàn)伐昔洛韋、泛昔洛韋作為其前體藥物更為有效,且給藥方式更為簡單[15]。更昔洛韋是治療CMV感染的一線用藥[16],在更昔洛韋出現(xiàn)耐藥后,可選擇性使用膦甲酸作為二線用藥。眼部樣本病毒DNA檢測是目前明確診斷皰疹病毒種類的最有效方法,但病毒DNA檢測結(jié)果假陰性率較高,一些患者往往需要多次送檢才能得到陽性結(jié)果[17]。研究不同眼部樣本病毒DNA的檢測效率有助于盡早明確皰疹病毒種類,及時開展治療。

本研究排除了同一個體多種皰疹病毒DNA陽性的患者,避免了同一個體不同皰疹病毒在角膜分布層次上造成的混雜。本組皰疹病毒陽性的角膜移植患者中,CMV DNA的檢出率最高,與歐美等國家的報道有所區(qū)別。CMV在亞裔人群中檢出率較高,尤其在內(nèi)皮病變患者中發(fā)生率更高[18]。在角膜內(nèi)皮層的皰疹病毒DNA分布中,CMV和VZV DNA分別位于第1位和第2位,因此應(yīng)引起眼科醫(yī)生警覺。

本研究發(fā)現(xiàn),皰疹病毒在角膜和房水樣本中病毒DNA檢測效率可能與皰疹病毒DNA的角膜分布層次和潛伏位點有關(guān)。CMV和VZV DNA多分布于角膜內(nèi)皮層,在病毒DNA檢測中,房水的檢出率和檢測效率均高于角膜。這可能是由于病毒在角膜內(nèi)皮細胞內(nèi)不斷復(fù)制,裂解細胞釋放病毒,從而引起房水中病毒滴度升高[18];而角膜內(nèi)皮層在移植術(shù)前往往僅殘留極少量內(nèi)皮細胞,因此病毒滴度低于其在房水中的滴度。研究認為CMV角膜炎可能來自體內(nèi)皰疹病毒的再激活,CMV透過血-房水屏障到達前房,感染角膜內(nèi)皮細胞、小梁網(wǎng)內(nèi)皮細胞等,進而引發(fā)廣泛的眼前節(jié)炎癥反應(yīng)[19-22]。HSV-1和EBV的角膜感染多發(fā)生于基質(zhì)層,在病毒DNA檢測中,角膜的檢出率和檢測效率高于房水。這可能是由于HSV-1復(fù)制產(chǎn)生的病毒難以突破后彈力層及內(nèi)皮層進入房水,從而積聚在角膜中造成的。研究顯示,HSV-1和EBV在角膜、房水、淚液中均可檢測到[5,23],但未見各種樣本檢出率的比較研究。對于HSV-1角膜感染,動物實驗認為其來自于潛伏神經(jīng)節(jié)細胞的病毒再激活,沿神經(jīng)軸突逆行引起角膜上皮炎或基質(zhì)炎[24],這與本研究中HSV-1 DNA角膜分布層次的研究結(jié)果相一致。

本研究探討了皰疹病毒陽性的角膜移植患者這一特定人群中皰疹病毒DNA在角膜組織中的分布,屬于抽樣調(diào)查,在一定程度上反映了人群中皰疹病毒陽性患者在角膜組織間的分布特點,為今后的相關(guān)研究提供了參考。

總之,本研究結(jié)果顯示在皰疹病毒陽性的角膜移植患者中,CMV DNA的檢出率最高,CMV和VZV DNA多在角膜內(nèi)皮層被檢出,HSV-1和EBV DNA多在角膜基質(zhì)層被檢出。在針對角膜和房水對皰疹病毒角膜感染檢測效率的評估中,對皰疹病毒整體而言,角膜的病毒檢測靈敏度高于房水;對于具體的皰疹病毒而言,CMV和VZV房水檢測敏感性高于角膜組織,HSV-1和EBV角膜檢測敏感性高于房水。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明臧云曉:直接參與選題、醞釀和設(shè)計試驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草及修改文章;彭榮梅:設(shè)計試驗、分析/解釋數(shù)據(jù),對文章內(nèi)容審閱和修改;肖格格:采集數(shù)據(jù)、起草文章、對文章內(nèi)容審閱和修改;何林輝:設(shè)計試驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章;洪晶:采集數(shù)據(jù)、對文章內(nèi)容審閱和修改及定稿