農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)CP4基因秈稻的研究

胡 歡，李 媛，丁 筠，曹含章，呂尊富，李飛飛

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300）

在遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗性植株時，轉(zhuǎn)化體的抗性篩選是遺傳轉(zhuǎn)化能否取得成功的關(guān)鍵步驟。通常在選擇培養(yǎng)基中加入合適種類和濃度的篩選劑，使其產(chǎn)生一定的篩選壓起到抗性篩選的作用。轉(zhuǎn)化體內(nèi)選擇標記基因的表達產(chǎn)物可對特定篩選劑產(chǎn)生抗性，使轉(zhuǎn)化受體材料繼續(xù)保持正常的生長發(fā)育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作為篩選劑使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈傷組織對抗生素具有生理抗性，以抗生素為選擇標記進行抗性篩選，不能起到很好的篩選效果，且經(jīng)抗生素篩選后的轉(zhuǎn)化體在分化和再生階段易受抑制或產(chǎn)生白化苗[4-6]。以草甘膦作為篩選劑可以提高選擇的靈敏度，消除轉(zhuǎn)化體生理抗性對篩選結(jié)果的影響，克服了以往研究中抗生素篩選的局限性?？蛇z傳的草甘膦抗性基因突變率低，并可在后代中穩(wěn)定表達，因此進行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。秈稻Oryza sativasubsp.indica和粳稻Oryza sativasubsp.japonica是栽培稻的2個亞種，隨著水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，大部分粳稻品種已經(jīng)建立了成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并成功引入抗蟲、抗病、生長發(fā)育調(diào)控等諸多有利基因[8]。而大多數(shù)秈稻品種組培特性不佳，愈傷組織誘導(dǎo)率低，繼代過程易褐化且分化再生頻率低，導(dǎo)致秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化效率低，有的品種甚至難以轉(zhuǎn)化。尤其是對生產(chǎn)上廣泛推廣、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的重要品種而言，其改良與育種進程受到嚴重限制[9]。CHAN等[10]于1992年嘗試利用農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化秈稻幼根愈傷組織，對轉(zhuǎn)化體進行Southern印記雜交，結(jié)果表明：目的基因片段已成功轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化體細胞中。后經(jīng)酶活性檢測，目的基因可在轉(zhuǎn)化體中穩(wěn)定表達。1994年，HIEI等[11]為建立高效穩(wěn)定的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，采用了“雙超元”載體，并通過在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高轉(zhuǎn)化效率等方法，推進了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在秈稻中的研究應(yīng)用。目前，雖然已有轉(zhuǎn)抗草甘膦基因的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的報道，但是轉(zhuǎn)化效率低，還未建立一個高效的轉(zhuǎn)化體系[12]?；诖耍狙芯窟x取具有成功再生體系的秈稻‘中恢161’Oryza sativasubsp.indica‘Zhonghui 161’為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，轉(zhuǎn)入草甘膦抗性基因(CP4)，探索適合的草甘膦質(zhì)量濃度用于抗性篩選，并對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程進行了合理優(yōu)化，建立‘中恢161’農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

秈稻‘中恢161’成熟胚；農(nóng)桿菌菌株EHA105；含CP4基因的表達載體p1300-HC。

1.2 方法

1.2.1 成熟胚胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖 將成熟種子去殼，進行消毒[13]，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L-12.4-D+0.5 g·L-1脯氨酸+0.1 g·L-1肌醇+0.3 g·L-1水解酪蛋白+30.0 g·L-1蔗糖+4.0 g·L-1Gelrite]上，接種20 粒·皿-1。放入培養(yǎng)條件為28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的組培室中誘導(dǎo)培養(yǎng)。5～7 d后，可觀察到幼芽處有淡黃色愈傷組織，統(tǒng)計每皿的出愈數(shù)和出愈率。15 d后，剝下色澤鮮黃、結(jié)構(gòu)緊密、生理狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，分散平鋪于新鮮配制的胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基R1上進行增殖培養(yǎng)。繼代2～4次后，增殖并產(chǎn)生大量的胚性愈傷組織，可用做后期轉(zhuǎn)化的受體材料。

1.2.2 胚性愈傷組織的草甘膦敏感性測試 設(shè)置5組草甘膦質(zhì)量濃度(100、200、300、400和500 mg·L-1)，重復(fù)3次，設(shè)空白對照，接種20塊·皿-1。15 d后，觀察胚性愈傷組織的色澤、是否增殖等外觀形態(tài)，統(tǒng)計胚性愈傷組織褐化率，選出合適的草甘膦質(zhì)量濃度范圍作為篩選壓。

1.2.3 胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化和抗性篩選 利用懸浮培養(yǎng)基R2(NB+0.5 g·L-1脯氨酸+0.1 g·L-1肌醇+0.3 g·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖+100 μmol·L-1乙酰丁香酮)將培養(yǎng)好的含CP4基因表達載體的農(nóng)桿菌菌株EHA105稀釋至D(600)為0.5～0.8，用其侵染胚性愈傷組織[14]。將轉(zhuǎn)化好的胚性愈傷組織用無菌濾紙吸干多余的菌液，適當干燥后，用滅菌鑷子夾取愈傷組織分散地平鋪在鋪有1層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基 R3(NB+0.5 g·L-1脯氨酸+0.1 g·L-1肌醇+0.3 g·L-1水解酪蛋白+30.0 g·L-1蔗糖+100 μmol·L-1乙酰丁香酮+4.0 g·L-1Gelrite)上，20 塊·皿-1。于25 ℃培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)2～3 d。取出共培養(yǎng)后的愈傷組織，用含100 mg·L-1羧芐青霉素的無菌蒸餾水清洗3～4次，直至清洗液澄清透明。適度干燥后，用鑷子夾取愈傷組織整齊均勻地平鋪在篩選培養(yǎng)基 R4(NB+3 mg·L-12.4-D+0.5 g·L-1脯氨酸+0.1 g·L-1肌醇+0.3 g·L-1水解酪蛋白+0.5 g·L-1谷氨酰胺+30.0 g·L-1蔗糖+4.0 g·L-1Gelrite+0.5 g·L-1頭孢霉素+不同質(zhì)量濃度草甘膦)上。抗性篩選培養(yǎng)基中草甘膦質(zhì)量濃度分別為300、350和400 mg·L-1。

1.2.4 分化、生根、移栽成活 將抗性愈傷組織系移至分化培養(yǎng)基R5(NB+0.5 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-16-BA+0.5 g·L-1脯氨酸+0.1 g·L-1肌醇+0.3 g·L-1水解酪蛋白+0.5 g·L-1谷氨酰胺+30.0 g·L-1蔗糖+4.0 g·L-1Gelrite)上進行分化培養(yǎng)。約15～25 d，部分抗性愈傷組織長出綠點。待綠點進一步分化形成小苗，并長至2 cm左右時將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基R6(1/2NB+20.0 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+8.0 g·L-1瓊脂)上生根培養(yǎng)。待幼苗生長出大量的茁壯根系，可將其從生根培養(yǎng)基中取出，小心洗凈其根系附著的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中煉苗，增強幼苗對環(huán)境的適應(yīng)性，1周后將健壯的幼苗移至大棚成活。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測和CP4基因試紙條檢測蛋白表達 利用TPS法提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG,CP4-R: TCCTTCATGTTCGGC GGTCTC)進行CP4基因的PCR擴增，目的片段大小為400 bp。擴增后的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，統(tǒng)計陽性率。取陽性植株葉片，利用CP4基因表達檢測試紙條進行再生植株抗性檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 草甘膦抗性篩選最適質(zhì)量濃度

圖1和圖2所示：‘中恢161’的胚性愈傷組織在不含草甘膦的培養(yǎng)基中可正常生長且大量增殖，未發(fā)生褐化現(xiàn)象；在含100 mg·L-1草甘膦的培養(yǎng)基中，絕大多數(shù)胚性愈傷組織可正常生長增殖，褐化率低，僅為5.00%，未起到選擇作用；在含200 mg·L-1草甘膦的培養(yǎng)基中褐化率為16.67%，選擇效果不明顯；在含300 mg·L-1草甘膦的培養(yǎng)基中，褐化率為41.67%，且與 200 mg·L-1相比差異顯著(P＜0.05)，選擇效果好，適合作為篩選壓；在含400 mg·L-1草甘膦的培養(yǎng)基中，大部分胚性愈傷組織發(fā)生褐化，少部分正常生長，褐化率為65.00%，選擇效果明顯；在含500 mg·L-1草甘膦的培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織基本發(fā)生褐化，褐化率為91.67%，顯著高于其他質(zhì)量濃度下的褐化率(P＜0.05)，說明選擇壓過大。結(jié)果表明：草甘膦質(zhì)量濃度為300～400 mg·L-1時，胚性愈傷組織褐化率約50%，具有很好的篩選效果。

圖1 秈稻‘中恢161’胚性愈傷組織在不同質(zhì)量濃度草甘膦培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days

圖2 秈稻‘中恢161’胚性愈傷組織在不同質(zhì)量濃度草甘膦培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后的褐化情況Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days

2.2 抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷組織在含有300、350和400 mg·L-1草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進行抗性篩選，分別獲得200、113、和84塊抗性愈傷組織，提取抗性愈傷組織DNA進行CP4基因的PCR檢測，陽性愈傷組織的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳可獲得長度為400 bp的條帶，與預(yù)期相符，表明CP4基因已成功整合到轉(zhuǎn)化體內(nèi)。進行3個草甘膦質(zhì)量濃度抗性篩選后愈傷組織陽性率分別為40.16%、61.72%和84.04%。共獲得67株再生植株，提取再生植株葉片DNA進行CP4基因的PCR檢測。其中陽性植株43株，再生植株陽性率為64.18%(圖3)。

圖3 秈稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR檢測Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants

2.3 CP4 基因試紙條檢測蛋白表達

抗性檢測結(jié)果(圖4)表明：檢測的43株P(guān)CR陽性植株中，有25株表現(xiàn)為CP4基因表達，表達率為58.13%。

圖4 CP4蛋白活性試紙條檢測Figure 4 Protein activity of CP4 by strip test

2.4 ‘中恢 161’成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

遺傳轉(zhuǎn)化再生過程如圖5所示：對秈稻‘中恢161’成熟胚進行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，約7 d可誘導(dǎo)出胚性愈傷組織(圖5A)。胚性愈傷組織進行2～4次繼代增殖(圖5B)，約40 d后進行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上進行抗性篩選(圖5C～D)，一段時間后，抗性愈傷組織系會出現(xiàn)增殖(圖5E)。約50 d后，抗性愈傷組織于R5培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，約15～25 d，長出綠點(圖5F)。1個月左右，長出小苗(圖5G)。小心取出轉(zhuǎn)移至R6培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)(圖5H)。約15 d，幼苗長出大量的茁壯根系，將其從培養(yǎng)基中移出，小心洗凈根部培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中煉苗，煉苗1周后可移至大棚成活。對再生植株進行CP4基因的PCR檢測，保留陽性植株。從誘導(dǎo)胚性愈傷組織至獲得抗草甘膦再生植株的整個過程需要4～6個月。

圖5 CP4基因轉(zhuǎn)化秈稻‘中恢161’胚性愈傷組織的各個階段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’

3 結(jié)論與討論

3.1 草甘膦抗性篩選及其優(yōu)勢

本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4為選擇標記的‘中恢161’遺傳轉(zhuǎn)化體系。非轉(zhuǎn)化體的EPSPS酶活性較低，草甘膦可與S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦復(fù)合體而競爭性抑制EPSPS酶活性，植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，生長受到抑制，不能正常生長分化[15]。而轉(zhuǎn)化體抗草甘膦基因CP4的表達產(chǎn)物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦親和力不易與草甘膦結(jié)合，故能夠進行正常的生長分化。因此，通過草甘膦篩選可獲得轉(zhuǎn)抗草甘膦基因CP4的再生植株。相較于以抗生素抗性基因為選擇標記，草甘膦抗性基因不僅能作為篩選標記也能作為目的基因，使受體植物獲得除草劑抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物細胞對草甘膦的抗性存在差異，選擇合適的草甘膦質(zhì)量濃度作為抗性篩選的篩選壓是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。本研究將轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷組織分別在含有300、350和400 mg·L-1草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進行抗性篩選，進一步分化、成苗，共獲得67株再生植株，進行CP4基因的PCR檢測，其中陽性植株43株，再生植株陽性率為64.18%，達到很好的選擇效果。

3.2 秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

3.2.1 受體材料的選擇及胚性愈傷組織的代齡 能否成功進行遺傳轉(zhuǎn)化的重要前提是選擇適合的植物材料作為轉(zhuǎn)化受體。水稻幼胚分裂能力強，易形成大量優(yōu)質(zhì)胚性愈傷組織，但受季節(jié)的影響，水稻幼胚利用不便，且在組織培養(yǎng)過程中易受微生物污染，轉(zhuǎn)化效率不高，因此作為轉(zhuǎn)化體存在一定的困難[16]。成熟胚方便儲存與利用，不受季節(jié)限制和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高，通常被作為遺傳轉(zhuǎn)化和再生的良好的外源體材料。蘇軍[17]比較了不同代齡的胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)第4、5代的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化效率較高，并且分化能力也較強。早代愈傷組織不易接受外源遺傳物質(zhì)。但晚代愈傷組織容易出現(xiàn)質(zhì)地軟、水漬化等現(xiàn)象，影響遺傳轉(zhuǎn)化成功率。本研究選擇胚性愈傷組織代齡為3～4代，可有效減少愈傷組織老化、色澤暗黃、結(jié)構(gòu)松散和褐化率高等問題，有效提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。

3.2.2 轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化 為提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，本研究采取一系列措施對轉(zhuǎn)化過程進行合理優(yōu)化。①轉(zhuǎn)化階段選用色澤鮮黃、外觀形態(tài)良好、結(jié)構(gòu)緊致的愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，淘汰外觀發(fā)白發(fā)軟發(fā)褐的愈傷組織。②在共培養(yǎng)基R2和懸浮培養(yǎng)基R3中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮，可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進外源基因的整合，極大提高轉(zhuǎn)化效率[18]。③農(nóng)桿菌菌液經(jīng)懸浮培養(yǎng)液R3稀釋后，D(600)為0.5～0.8。此時為最適菌液濃度，既不會使農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化體表面過多繁殖影響其正常生長，又具一定的侵染能力，提高了轉(zhuǎn)化效率。④黑暗條件下共培養(yǎng)2～3 d為適合的共培養(yǎng)時長。共培養(yǎng)時間過短，目的基因不能成功整合至轉(zhuǎn)化體細胞內(nèi)[19-20]。