甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯褪綠矮化病毒檢測(cè)方法的建立

陳濤 薛婷 楊志堅(jiān) 陳選陽(yáng) 陳由強(qiáng) 陳建楠

摘 要：為了建立甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）和甘薯矮化褪綠病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)方法，提高檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)結(jié)果的可視化。根據(jù)SPFMV外殼蛋白基因（CP）的核苷酸序列和SPCSV的熱休克蛋白基因（Hsp 70）的核苷酸序列設(shè)計(jì)4條RT-LAMP特異性引物，采取單因素優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)RT-LAMP反應(yīng)體系中的多個(gè)因素包括時(shí)間、溫度、BST聚合酶、Mg2+、RNase抑制劑、dNTPs和Betaine濃度優(yōu)化，恒溫?cái)U(kuò)增60 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，SYBR Green I可視化顯色，結(jié)果表明：SPFMV的優(yōu)化反應(yīng)體系為：FIP/BIP

2 μL、F3/B3 0.5 μL、BST聚合酶1.0 μL、dNTPs 0.6 μL、MgSO4 1.5 μL、RNase抑制劑1.0 μL、Betaine 7 μL，62℃ 60 min。SPCSV的優(yōu)化反應(yīng)體系為：FIP/BIP 2 μL、F3/B3 0.5 μL、BST聚合酶 1.0 μL、dNTPs 0.6 μL、MgSO4 1.5 μL、RNase抑制劑1.2 μL、Betaine 7 μL，64℃ 60 min。進(jìn)一步利用SPFMV全基因組的4個(gè)片段（SPFMV-1、SPFMV-2、SPFMV-3、SPFMV-4）、SPCSV-Hsp 70和RGNNV進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，分別建立了SPFMV和SPCSV的特異性RT-LAMP檢測(cè)方法，擴(kuò)增出了具有RT-LAMP的典型瀑布狀條帶，與凝膠電泳和SYBR Green I顯色結(jié)果一致，SPFMV和SPCSV的靈敏度檢測(cè)下限分別為：1×10-6、1×10-3 ng·μL-1，該方法檢測(cè)靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了結(jié)果的可視化。對(duì)田間甘薯苗和離體組織培養(yǎng)甘薯苗進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，SPFMV-RT-LAMP檢測(cè)方法成功率為100%，SPCSV-RT-LAMP檢測(cè)方法的成功率為95%，表明研發(fā)的SPFMV和SPCSV的RT-LAMP檢測(cè)方法適用于SPFMV和SPCSV的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：甘薯；甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）；甘薯矮化褪綠病毒（SPCSV）；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）；建立

中圖分類號(hào)：S 435.31 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號(hào)：0253-2301（2023）06-0011-11

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.06.002

Establishment of the Detection Methods for Sweet Potato Feathery Mottle Virusand Sweet Potato Chlorotic Stunt Virus

CHEN Tao1，2，3， XUE Ting1，2，3*， YANG Zhi-jian4， CHEN Xuan-yang4， CHEN You-qiang1，2，3， CHEN Jian-nan1，2，3*

（1. College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Public Service

Platform for Industrialization Development Technology of Marine Biological Medicine and Products of the

State Oceanic Administration Fuzhou， Fujian 350117， China; 3. Fujian Key Laboratory of Special Marine

Bioresource Sustainable Utilization， Fuzhou， Fujian 350117， China; 4. Fujian Key Laboratory of Crop

Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： In order to establish a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） method to detect the sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）and sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）， improve the detection sensitivity and realize the visualization of the results， four RT-LAMP specific primers were designed according to the nucleotide sequences of SPFMV coat protein gene （CP） and SPCSV heat shock protein gene （Hsp 70） in this study， and then the single factor optimization experiment was used to optimize the multiple factors in the RT-LAMP reaction system including time， temperature， BST polymerase， Mg2+， RNase inhibitor， dNTPs and Betaine concentration， with the constant temperature amplification for 60 min. Through the agarose gel electrophoresis analysis， and the SYBR Green I visual color development， the results showed that： the optimal reaction system of SPFMV was as follows： FIP/BIP 2 μL， F3/B3 0.5 μL， BST polymerase 1.0 μL， dNTPs 0.6 μL， MgSO4 1.5 μL， RNase inhibitor 1.0 μL， Betaine 7 μL， at 62℃ for 60 min. The optimal reaction system of SPCSV was as follows： FIP/BIP 2 μL， F3/B3 0.5 μL， BST polymerase 1.0 μL， dNTPs 0.6 μL， MgSO4 1.5 μL， RNase inhibitor

1.2 μL， Betaine 7 μL， at 64℃ for 60 min. The four fragments of the whole genome of SPFMV （SPFMV-1， SPFMV-2， SPFMV-3， and SPFMV-4）， SPCSV-Hsp 70 and RGNNV were used to test the specificity. Then ，the specific RT-LAMP detection methods of SPFMV and SPCSV were established respectively， and the typical waterfall-like bands with RT-LAMP were amplified， which were consistent with the results of gel electrophoresis and SYBR Green I coloration. The lower limits of sensitivity detection of SPFMV and SPCSV were as follows： 1×10-6 and 1×10-3 ng·μL-1. The detection sensitivity of this method was high， and the results could be visualized. Field sweet potato seedlings and in vitro tissue culture sweet potato seedlings were tested， and the success rate of SPFMV-RT-LAMP detection method was 100%. The success rate of SPCSV-RT-LAMP detection method was 95%， indicating that the developed RT-LAMP detection method of SPFMV and SPCSV was suitable for the rapid detection of SPFMV and SPCSV.

Key words： Sweet potato； Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）； Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）； Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）； Establishment

甘薯Ipomoea batatas （Linnaeus） Lamarc隸屬于旋花科Convolvulaceae是世界上僅次于馬鈴薯Solanum tuberosum L和木薯Manihot esculenta Crantz的第三大根系作物，對(duì)減緩世界饑餓有巨大作用［1］。我國(guó)甘薯種植面積達(dá)670萬(wàn)hm2，產(chǎn)量穩(wěn)居世界第1，是主要的經(jīng)濟(jì)和糧食作物之一［2］。甘薯為營(yíng)養(yǎng)繁殖，容易感染和積累病毒，據(jù)報(bào)道世界各地有15種病毒影響甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)。甘薯病毒?。⊿PVD）是甘薯中最常見、造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的病毒病，由甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）共同侵染形成［3-5］。白粉虱傳播的SPCSV和蚜蟲傳播的SPFMV共同侵染甘薯，將給甘薯產(chǎn)量帶來50%的損失，甚至是絕收［6-7］。甘薯種植區(qū)一旦爆發(fā)甘薯病毒病，將對(duì)甘薯產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性的打擊，因此急需建立一種快速、便捷、靈敏的甘薯病毒檢測(cè)方法，以防治甘薯病毒的危害，減少甘薯產(chǎn)量損失。

SPFMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）病毒，是侵染甘薯最常見的病毒之一，可能發(fā)生在種植甘薯的任何地方［2］。SPFMV病毒RNA基因組全長(zhǎng)為10 820個(gè)核苷酸，含有1個(gè)開放閱讀框（ORF），起始于核苷酸118 bp，終止于10 599 bp，可能編碼由3 493個(gè)氨基酸組成的多蛋白（Mr 393 800）［8］。SPCSV屬于長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形狀病毒屬（Crinivirus），世界各地都有該病毒的出現(xiàn)，如：盧旺達(dá)、烏干達(dá)、坦桑尼亞、美國(guó)、巴西等地［9］。SPCSV病毒粒子呈彎曲線狀，其長(zhǎng)度為850～950 nm，主要依靠半持久方式傳播，SPCSV主要存在于寄主韌皮部細(xì)胞內(nèi)，并在維管束內(nèi)堆積［6］。目前，部分學(xué)者開展了甘薯病毒檢測(cè)研究，許永清［10］等利用RT-PCR和ELISA方法相結(jié)合的方式檢測(cè)福建地區(qū)的甘薯病毒；盧會(huì)翔等［11］利用血清檢測(cè)法和qPCR相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)甘薯病毒病的檢測(cè)；張春雨等［12］利用RNA沉默（RNAi）病毒防御機(jī)制，通過高通量測(cè)序，利用病毒來源的小RNA鑒定植物病毒，但都存在一定的缺點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)（RT-LAMP）通過設(shè)計(jì)四條特異性引物（兩條內(nèi)引物、兩條外引物），識(shí)別模板基因的不同區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對(duì)少量RNA的快速擴(kuò)增，且RT-LAMP可在水浴鍋中進(jìn)行，結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳分析，而加入SYBR Green I后可在試管中通過顏色變化進(jìn)行肉眼簡(jiǎn)單的觀察，逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）是RT-PCR技術(shù)的一種高效、穩(wěn)定、便捷的替代方法，其具有靈敏度高、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求簡(jiǎn)單和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)［13-14］。RT-LAMP技術(shù)被廣泛運(yùn)用于各種病毒的檢測(cè)，其檢測(cè)下限低，靈敏度高，是RT-PCR的100倍。如Veronica等［15］利用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)新冠病毒，其最低檢測(cè)下限為1×10-3 ng·μL-1，王瑩等［16］在馬鈴薯中檢測(cè)出馬鈴薯Y病毒，其最低檢測(cè)下限為2×10-3 ng·μL-1、Jantana Kampeera等［17］在羅非魚中檢測(cè)出TiLV病毒、高彥萍等［18］在馬鈴薯中檢測(cè)出馬鈴薯卷葉病毒，其最低檢測(cè)下限為5×10-3 ng·μL-1、李晉玉［19］利用RT-LAMP檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒其檢測(cè)下限為7.2×10-3 ng·μL-1。本研究根據(jù)SPFMV外殼蛋白基因（CP）的核苷酸序列和SPCSV的熱休克蛋白基因（Hsp 70）的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)4條引物，建立和優(yōu)化SPFMV、SPCSV的RT-LAMP檢測(cè)方法，提高檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)結(jié)果的可視化，為甘薯病毒病檢測(cè)和防治提供了有效的檢測(cè)技術(shù)和手段。

1 材料與方法

1.1 生物材料

感染甘薯病毒病的甘薯苗、無毒甘薯苗（經(jīng)離體組織培養(yǎng)）均由福建農(nóng)林大學(xué)作物生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳選陽(yáng)老師提供。

1.2 主要試劑

TransZol Up Plus RNA Kit（ER501）、EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix（AT311）、Super Mix、TransScript Uni Reverse Transcriptase（AU101）和RNase抑制劑（Ribonuclease inhibitor）均購(gòu)自北京全式金生物公司，BstDNA Polymerase3.0（M0374S）、High Pure dNTPs、10×Buffer、Betaine、MgSO4和SYBR Green I（SR4110）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，TAE電泳緩沖液和瓊脂糖等其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中SPFMV外殼蛋白基因（CP）的核苷酸序列和SPCSV的熱休克蛋白基因（Hsp 70）的核苷酸序列，使用LAMP引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）分別設(shè)計(jì)4條特異性引物（內(nèi)引物：F3、B3外引物：FIP、BIP）以此來識(shí)別病毒的特定區(qū)域。引物均由福州尚亞公司合成。

1.3.2 總RNA的提取與檢測(cè) 利用高純度RNA提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）提取感染SPVD的甘薯葉片總RNA和脫毒甘薯葉片總RNA。提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒提取說明書操作。提取完成后用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和完整性。

1.3.3 基本反應(yīng)體系 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)初步設(shè)定RT-LAMP基本反應(yīng)體系［20-27］：Bst DNA Polymerase3.0 1 μL（8 000 U·mL-1）、dNTPs 0.3 μL（10 mmol·L-1）、M-MLV 0.2 μL（200 U·μL-1）、10×Buffer 2.5 μL、Betaine 5 μL（5 mol·L-1）、RNase抑制劑1 μL（50 U·μL-1）、MgSO4 2 μL（8

mmol·L-1）、FIP/BIP 2μL（10 mmol·L-1）、F3/B3 0.5 μL（10 mmol·L-1）、RNA模板1 μL（100 ng·μL-1）、ddH2O 7 μL。62℃水浴加熱60 min，80℃ 10 min。

1.3.4 反應(yīng)體系的優(yōu)化 通過單一變量法，對(duì)RT-LAMP反應(yīng)體系設(shè)置不同的反應(yīng)條件，進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。設(shè)置不同的反應(yīng)時(shí)間（80、70、60、50、40、30 min）、反應(yīng)溫度（65、64、63、62、61、60℃）、BST聚合酶加入量（1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μL）、MgSO4加入量（3.5、3.0、2.5、2.0、1.5 μL）、RNase抑制劑加入量（1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 μL）、dNTPs加入量（1.5、1.2、0.9、0.6、0.3 μL）和Betaine加入量（7.0、6.0、5.0、4.0、3.0 μL）進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和SYBR Green I觀察結(jié)果。RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I后，陽(yáng)性樣品呈綠色，陰性對(duì)照顏色不發(fā)生變化呈黃色。

1.3.5 靈敏度檢測(cè) RNA濃度的起始濃度為100 ng·μL-1，按照10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，一共稀釋11個(gè)梯度。RNA加入量為1 μL，根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和取適量產(chǎn)物進(jìn)行SYBR Green I結(jié)果判定，為防止試驗(yàn)偶然性，進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)。

1.3.6 RT-LAMP特異性驗(yàn)證 SPFMV-CP、SPCSV-Hsp具有高度保守性的特點(diǎn)，以SPFMV全基因組4個(gè)片段（SPFMV-1、SPFMV-2、SPFMV-3、SPFMV-4、其中SPFMV-4包含SPFMV-CP完整序列）、SPCSV-Hsp70的cNDA以及Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus（RGNNV）赤點(diǎn)石斑神經(jīng)壞死病毒RNA為模板，利用優(yōu)化好的RT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整度的檢測(cè)

本試驗(yàn)最終測(cè)得RNA濃度為：807.55 ng·μL-1，OD260/280值：1.937，并利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整度，結(jié)果表明提取的RNA濃度和完整性都滿足試驗(yàn)的要求。

2.2 甘薯苗攜帶病毒檢測(cè)結(jié)果

利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證田間甘薯苗和離體組織培養(yǎng)甘薯苗是否攜帶SPFMV和SPCSV兩種病毒。田間甘薯苗和離體組織培養(yǎng)甘薯苗檢測(cè)100次，田間甘薯苗共檢測(cè)100次，檢測(cè)出有病毒次數(shù)100次，離體組織培養(yǎng)甘薯苗共檢測(cè)100次，檢測(cè)出有病毒次數(shù)0次，表明田間甘薯苗攜帶SPFMV和SPCSV兩種病毒，離體組織培養(yǎng)甘薯苗不攜帶SPFMV和SPCSV兩種病毒，即離體組織培養(yǎng)甘薯苗為無毒苗（表2）。

2.3 RT-LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.2.1 SPFMV RT-LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)化 為建立SPFMV RT-LAMP的最優(yōu)檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)時(shí)間、溫度、BST聚合酶、MgSO4、RNase抑制劑、dNTPs和Betaine濃度進(jìn)行優(yōu)化。（1）對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化：反應(yīng)時(shí)間為30、40 min時(shí)無條帶產(chǎn)生，反應(yīng)時(shí)間為50 min，可看到明亮的條帶，60 min擴(kuò)增條帶最為清晰明亮（圖1-B），加入SYBR Green I后，1～4號(hào)管為綠色，5～6號(hào)管為黃色（圖1-A），與凝膠電泳結(jié)果一致。（2）對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化：60℃～65℃時(shí)，均有瀑布狀條帶產(chǎn)生，在62℃時(shí)最為清晰明亮，對(duì)照組無明顯條帶（圖2-B），加入SYBR Green I后，1～6號(hào)管為綠色，對(duì)照組（c）為黃色與凝膠電泳分析一致（圖2-A）。（3）對(duì)BST聚合酶加入量進(jìn)行優(yōu)化：1～4號(hào)泳道均有瀑布狀條帶產(chǎn)生，1.0 μL時(shí)條帶最為清晰，對(duì)照組無明顯條帶（圖3-B），加入SYBR Green I后，1～4號(hào)管均為綠色，5號(hào)管為黃色，表明在加入量為0.3 μL時(shí)無法檢測(cè)到甘薯病毒（圖3-A），與凝膠電泳分析一致。（4）對(duì)MgSO4加入量進(jìn)行優(yōu)化：加入量為1.5～3.5 μL時(shí)，均有條帶產(chǎn)生（圖4-B），加入SYBR Green I后1～5號(hào)管為綠色與凝膠電泳結(jié)果一致（圖4-A），從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，其加入量應(yīng)為1.5 μL。（5）對(duì)RNase抑制劑加入量進(jìn)行優(yōu)化：加入量為0.8～1.2 μL時(shí)有條帶產(chǎn)生，加入量為1.0 μL時(shí)有最為明亮的瀑布狀條帶（圖5-B），加入SYBR Green I后，1～3號(hào)管為綠色，4～5號(hào)管為黃色（圖5-A）與凝膠電泳結(jié)果一致。（6）對(duì)dNTPs加入量進(jìn)行優(yōu)化：加入量為0.6～1.5 μL時(shí)，有典型的瀑布狀條帶（圖6-B），加入SYBR Green I后，1～4號(hào)管為綠色，5號(hào)管為黃色（圖6-A）與凝膠電泳分析一致，且從節(jié)約成本的角度出發(fā)其加入量應(yīng)為0.6 μL。（7）對(duì)Betaine加入量進(jìn)行優(yōu)化：加入量為7 μL時(shí)，條帶最為清晰明亮（圖7-B），加入SYBR Green I后，1～5號(hào)管均為綠色（圖7-A），與凝膠電泳結(jié)果一致。綜上所述，SPFMV的RT-LAMP反應(yīng)體系為：FIP/BIP 2 μL、F3/B3 0.5 μL、BST聚合酶1.0 μL、dNTPs 0.6 μL、MgSO4 1.5 μL、RNase抑制劑1.0 μL、Betaine 7 μL，62℃60 min，80℃10 min使酶失活，結(jié)束反應(yīng)。

2.3.2 SPCSV RT-LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)化 為建立最優(yōu)檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)溫度、BST聚合酶、MgSO4、RNase抑制劑、dNTPs和Betaine濃度進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和SYBR Green I進(jìn)行驗(yàn)證。（1）對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化：4～6號(hào)泳道無明顯無典型的條帶產(chǎn)生，1～3號(hào)泳道有條帶產(chǎn)生，即63℃～65℃時(shí)，可擴(kuò)增出明亮的條帶，在64℃時(shí)有最為清晰明亮（圖8-B），加入SYBR Green I后，1～3號(hào)管為綠色，3～6號(hào)管為黃色（圖8-A）與凝膠電泳結(jié)果一致。（2）對(duì)BST聚合酶加入量?jī)?yōu)化，1～5號(hào)泳道有條帶，加入量為1.0 μL時(shí)條帶最為清晰明亮（圖9-B），加入SYBR Green I后，1～5號(hào)管均為綠色（圖9-A）與凝膠電泳結(jié)果一致。（3）對(duì)MgSO4加入量進(jìn)行優(yōu)化：1～5號(hào)泳道均有條帶，即加入量為1.5～3.5 μL時(shí)，均能擴(kuò)增出產(chǎn)物（圖10-B），加入SYBR Green I后，1～5號(hào)管均為綠色（圖10-A），與凝膠電泳結(jié)果一致，從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，其加入量應(yīng)為1.5 μL。（4）對(duì)RNase抑制劑加入量進(jìn)行優(yōu)化：1～5號(hào)泳道均有條帶，即其加入量為0.4～1.2 μL時(shí)有條帶產(chǎn)生，當(dāng)加入量為1.2 μL時(shí)條帶最為明亮（圖11-B），加入SYBR Green I后，1～5號(hào)管均為綠色（圖11-A），與凝膠電泳結(jié)果一致。（5）對(duì)dNTPs加入量?jī)?yōu)化：2～5號(hào)泳道有明亮條帶，加入量為0.6～1.5 μL時(shí)，可擴(kuò)增出典型的瀑布狀條帶（圖12-B），加入SYBR Green I后，1～5號(hào)管均為綠色（圖12-A）與凝膠電泳結(jié)果一致，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，dNTPs加入量應(yīng)為0.6 μL。（6）對(duì)Betaine加入量進(jìn)行優(yōu)化：1、3號(hào)泳道有瀑布狀條帶，2、4、5號(hào)泳道無條帶，即加入量為5或7 μL時(shí)能擴(kuò)增出典型的瀑布狀條帶，且7 μL時(shí)條帶最為清晰明亮（圖13-B），加入SYBR Green I后，1、3號(hào)管為綠色，2、4、5號(hào)管為黃色（圖13-A），與凝膠電泳結(jié)果一致。綜上所述，SPCSV的RT-LAMP反應(yīng)體系為：FIP/BIP 2 μL、F3/B3 0.5 μL、BST聚合酶1.0 μL、dNTPs 0.6 μL、MgSO4 1.5 μL、RNase抑制劑1.2 μL、Betaine 7 μL，64℃ 60 min，80℃ 10 min使酶失活，結(jié)束反應(yīng)。

2.4 RT-LAMP靈敏度檢測(cè)

2.4.1 SPFMV RT-LAMP靈敏度檢測(cè) 提取感染SPFMV的甘薯葉片總RNA為模板，按照10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，一共稀釋11個(gè)梯度，分別進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示：1～9號(hào)泳道有清晰明亮的瀑布狀條帶產(chǎn)生，10～11號(hào)泳道無清晰明亮的瀑布狀條帶產(chǎn)生（圖14-B），即10-6～102稀釋液為模板的情況下可擴(kuò)增出典型的瀑布狀條帶，取適量的擴(kuò)增產(chǎn)物加入核酸染料SYBR Green Ⅰ，1～9號(hào)管呈綠色、10～11管呈黃色且陰性對(duì)照（C）和空白對(duì)照（O）管均為黃色（圖14-A），與瓊脂糖凝膠結(jié)果一致，表明SPFMV的檢測(cè)下限為1.0×10-6 ng·μL-1。按照最優(yōu)體系進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均一致。

2.4.2 SPCSV RT-LAMP靈敏度的檢測(cè) 提取感染SPCSV的甘薯葉片總RNA為模板，按照10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，一共稀釋11個(gè)梯度。分別進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示：1～6號(hào)泳道有清晰明亮的瀑布狀條帶產(chǎn)生，7～11號(hào)泳道無條帶產(chǎn)生，即10-3～102稀釋液為模板的情況下可擴(kuò)增出典型的瀑布狀條帶（圖15-B），取適量的擴(kuò)增產(chǎn)物加入核酸染料SYBR Green Ⅰ，1～6號(hào)管呈綠色、7～11管呈淡黃色且陰性對(duì)照（C）和空白對(duì)照（O）管都呈黃色（圖15-A），與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，表明SPCSV的檢測(cè)下限為1.0×10-3 ng ·μL-1。按照最優(yōu)體系進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果均一致。

2.5 RT-LAMP特異性檢測(cè)

2.5.1 SPFMV 特異性檢測(cè) SPFMV侵染的甘薯總RNA、RGNNV總RNA、SPFMV全基因組的4個(gè)片段SPFMV-4（SPFMV的CP蛋白保守序列在SPFMV-4中）、

SPFMV-3、SPFMV-2、SPFMV-1、SPCSV-Hsp 70為模板，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果可以看出：1、2泳道有明顯的瀑布狀條帶，2號(hào)泳道最亮的一條帶為SPFMV-4、3～5泳道無LAMP產(chǎn)物的明顯特征，都有略微明亮的條帶，為SPFMV全基因組的其他3個(gè)片段，分別為SPFMV-3、SPFMV-2、SPFMV-1、6號(hào)泳道為SPCVS-Hsp 70，7～9泳道無典型瀑布狀條帶的產(chǎn)生（圖16），表明建立的SPFMV RT-LAMP檢測(cè)方法只能特異性擴(kuò)增出SPFMV病毒，不能擴(kuò)增出其他病毒，具有良好的特異性，可利用該檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)SPFMV的快速檢測(cè)。

2.5.2 SPCSV RT-LAMP特異性驗(yàn)證 SPCSV侵染的甘薯總RNA、RGNNV總RNA、SPFMV-4、SPCSV-Hsp 70為模板，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果可以看出：1、2泳道有明顯的瀑布狀條帶產(chǎn)生，而陰性對(duì)照3號(hào)泳道未擴(kuò)增出條帶，4～6泳道無RT-LAMP產(chǎn)物的明顯特征，其中5號(hào)泳道有略微明亮的條帶，為SPFMV-4（圖17），表明建立的SPCSV RT-LAMP檢測(cè)方法只能檢測(cè)出SPCSV病毒，不能檢測(cè)出其他病毒，具有良好的特異性，可利用該檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)SPCSV的快速檢測(cè)。

2.6 SPFMV-RT-LAMP和SPCSVRT-LAMP檢測(cè)方法的驗(yàn)證

利用SPFMV-RT-LAMP檢測(cè)方法，分別對(duì)田間甘薯苗和離體組織培養(yǎng)甘薯苗進(jìn)行驗(yàn)證，各檢測(cè)100次，其中100次檢測(cè)出田間甘薯苗攜帶甘薯病毒，成功率為100 %，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SPFMV的RT-LAMP檢測(cè)方法適用于SPFMV的快速檢測(cè)（表3）。

利用SPCSV-RT-LAMP檢測(cè)方法，分別對(duì)田間甘薯苗和離體組織培養(yǎng)甘薯苗進(jìn)行驗(yàn)證，各檢測(cè)100次，其中95次檢測(cè)出田間甘薯苗攜帶甘薯病毒，成功率為95%，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SPCSV的RT-LAMP檢測(cè)方法適用于SPCSV的快速檢測(cè)（表3）。

3 結(jié)論與討論

本研究針對(duì)SPFMV的外殼蛋白（CP）和SPCSV的熱激蛋白（Hsp 70）分別設(shè)計(jì)引物，和單一變量法進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，在64℃、62℃的恒溫條件下擴(kuò)增60 min，瓊脂糖凝膠電泳分析和SYBR Green I可視化檢驗(yàn)，結(jié)果顯示被病毒侵染的甘薯樣品瓊脂糖凝膠電泳具有典型的瀑布狀條帶，加入SYBR Green I后呈現(xiàn)綠色，對(duì)照呈黃色，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，實(shí)現(xiàn)了結(jié)果的可視化；通過SPFMV和SPCSV的RT-LAMP靈敏度檢測(cè)，3次重復(fù)性試驗(yàn)，反應(yīng)體系的特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示SPFMV的最低檢測(cè)RNA濃度為1.0×10-6 ng·μL-1，SPCSV的最低檢測(cè)RNA濃度為1.0×10-3 ng·μL-1，說明該方法具有檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性好和高特異性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于SPFMV和SPCSV的快速檢測(cè)。對(duì)田間甘薯苗和離體組織培養(yǎng)甘薯苗進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，SPFMV-RT-LAMP檢測(cè)方法成功率為100%；SPCSV-RT-LAMP檢測(cè)方法的成功率為95%，表明本試驗(yàn)研發(fā)的SPFMV和SPCSV的RT-LAMP檢測(cè)方法適用于SPFMV和SPCSV的快速檢測(cè)。

LAMP呈典型的瀑布狀條帶，為具有不同莖長(zhǎng)的莖-環(huán)DNA和具有多個(gè)環(huán)的花椰菜狀結(jié)構(gòu)的混合物，這些莖環(huán)通過在同一鏈中目標(biāo)序列的交替反向重復(fù)之間退火形成［24］，加入SYBR Green I可直接用肉眼觀察，即陽(yáng)性樣品呈綠色，陰性對(duì)照顏色無變化為黃色。在同一地方長(zhǎng)時(shí)間試驗(yàn)，容易導(dǎo)致氣溶膠的出現(xiàn)［22］。為防止試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，應(yīng)提前將SYBR Green I加入到干凈的PCR試管頂部，蓋住保持分離狀態(tài)直至測(cè)試結(jié)果的完成。

基于RT-LAMP的簡(jiǎn)單性、檢測(cè)靈敏度高和結(jié)果的可視化的優(yōu)點(diǎn)，喬奇等［28］利用RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)SPCSV-WA株系的檢測(cè)，其方法可特異對(duì)SPCSV-WA 進(jìn)行檢測(cè)其最低檢測(cè)下限為：1.0×10-1 ng·μL-1，姜珊珊等［29］在甘薯中檢測(cè)SPFMV的最低檢測(cè)下限為1.26×10-4 ng·μL-1。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法相對(duì)于喬奇等［28］、姜珊珊等［29］的研究具有更高的靈敏度，可為SPFMV和SPCSV的發(fā)生進(jìn)行早期預(yù)警，可有效減少甘薯病毒病害造成的產(chǎn)量損失，同時(shí)也為甘薯病毒田間檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便可行的方案。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-05-16

作者簡(jiǎn)介：陳濤，男，1998年生，碩士，主要從事甘薯病毒的檢測(cè)。

*通信作者：陳建楠，男，1991年生，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事甘薯種植與甘薯病毒檢測(cè)（E-mail：381220681@qq.com）；

薛婷，女，1989年生，博士，正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事甘薯種植與甘薯病毒檢測(cè)（E-mail：xueting7872126@163.com）。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020N5013）；福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020N0003）。