仙茅總黃酮誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究*

李 婷 汪小玉 稅丕先 石厚銀 張 旗 沈驊?！?/p>

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川西部醫(yī)藥技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，四川 成都 610041；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；4.四川省合江縣中醫(yī)醫(yī)院，四川 合江 646200）

骨肉瘤（OS）是一類原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年［1］。近5 年OS 患者的生存率雖有一定提高，但轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性問題依然未得到解決。治療OS 的經(jīng)典化療藥物順鉑等也只能縮小腫瘤體積，會產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)［2］。因此，化療藥物的多重耐藥以及尚無規(guī)范化新型治療方式等問題，也反映了OS當(dāng)前治療策略的不足與無突破性進(jìn)展的缺陷。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為OS屬于正虛邪實(shí)、邪盛正衰的一類惡性骨病［3］，依據(jù)中醫(yī)“腎藏精，主骨生髓”等理論［4］，應(yīng)從腎論治。仙茅是石蒜科一味具有補(bǔ)腎助陽、益精血、強(qiáng)筋骨和行血消腫作用的傳統(tǒng)中藥［5］，主要含有酚及酚苷、木質(zhì)素、三萜皂苷、黃酮類、揮發(fā)油及微量元素等化學(xué)成分［6-10］。已有研究表明，仙茅對人胃癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、小鼠肉瘤均有較好的抑制作用［11］；《本草求真》將仙茅與附子、補(bǔ)骨脂等辛溫補(bǔ)益藥物劃分為一類，而已有研究證明補(bǔ)骨脂素能夠誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡［12］。OS 的發(fā)病機(jī)制與多種信號通路和基因都有聯(lián)系，其中MAPK 信號通路也稱絲裂原活化蛋白激酶，屬于絲蘇氨酸蛋白激酶，能夠被細(xì)胞外刺激激活［13］。眾多文獻(xiàn)資料表明，OS發(fā)生和發(fā)展所必需的靶點(diǎn)、途徑和過程都有該信號通路的參與和調(diào)控［14］，其家族有4條途徑，分別包括ERK1/2、JNK、p38 MAPK 和ERK5。JNK 參與細(xì)胞應(yīng)激、分化及凋亡等過程，p38 MAPK 參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)以及凋亡等過程［15］。因此JNK 和p38 MAPK 兩個(gè)途徑與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)。該信號通路被異常激活后會導(dǎo)致OS 的發(fā)生。但目前針對仙茅黃酮的研究還較少，我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)仙茅總黃酮具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用趨勢，但并未深入研究其作用機(jī)理。因此，本研究擬以人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞為模型，探討仙茅總黃酮通過MAPK 信號通路及凋亡相關(guān)因子誘導(dǎo)其凋亡的作用，以期為開發(fā)有效治療OS的藥物提供新的方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物

仙茅飲片購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)鑒定為石蒜科植物仙茅的根莖。CCK-8 試劑盒購自武漢BOSTER 公司；Hoechst 33258 染色液購自北京索萊寶公司；AnnexinV-FITC 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2、Bax、Caspase-3、JNK、p38 MAPK、GAPDH抗體購自美國CST 公司；羊抗兔IgG（H+L）HRP、ECL超敏發(fā)光液購自Affinity 公司；彩色預(yù)染蛋白marker 購自賽默飛公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈雙抗購自以色列BI公司；水為超純水。

1.2 儀器

Synergy 2 型全波長酶標(biāo)儀，購自美國Bio Tek 公司；TS2R-LS 型倒置熒光顯微鏡，購自日本Nikon公司；FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀，購自美國BD 公司；LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR 儀，購自瑞士Roche 公司；Gel Doc XR 型凝膠成像系統(tǒng)、JT300C 型垂直電泳儀，購自美國Bio-Rad 公司；Eppenderf 5424R型高速冷凍離心機(jī)，購自德國Eppenderf 公司；BPN-150CRH 型CO2培養(yǎng)箱，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞

人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞株（MP-0046），購自河南多沃生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 仙茅總黃酮藥物提取純化 按本課題組前期研究所得方法［16］制備仙茅總黃酮。取仙茅藥材粉末（過4 號篩），以80%乙醇、質(zhì)量體積比1∶25（mg/mL）、85 ℃加熱回流提取2.5 h，提取液過濾，濃縮干燥后以AB-8型樹脂進(jìn)行純化，上樣濃度3 mg/mL，pH 5.0，1 mL/min上樣4 BV，7 BV 的50%乙醇1 mL/min 進(jìn)行洗脫，冷凍干燥后即得仙茅總黃酮，以蘆丁為對照品通過NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法檢測并計(jì)算得出仙茅總黃酮得率為13.95 mg/g，純度為9.28%；純化后純度提高至40.72%，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.4.2 藥物配制及細(xì)胞培養(yǎng) 使用前將仙茅總黃酮粉末用空白DMEM 高糖培養(yǎng)基溶解至總黃酮濃度為500 mg/L 的母液，過0.22 μm 濾膜除菌，備用。MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1% 青-鏈雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖［17］設(shè)置不加細(xì)胞的空白組、不加藥物的對照組和給藥組（總黃酮質(zhì)量濃度為25、50、100、200、300、400、500 mg/L），每組4 個(gè)復(fù)孔。取對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8×104/mL，每孔100 μL 均勻接種于96 孔板中，培養(yǎng)至完全貼壁后給藥，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育30 min，置酶標(biāo)儀上于450 nm處檢測各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，用SPSS 17.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞核凋亡形態(tài)［18］設(shè)置對照組及仙茅總黃酮低、中、高濃度組（50、100、200 mg/L），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。將對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)貼壁后分組給藥。棄去舊培養(yǎng)基，加藥培養(yǎng)48 h 后加入PBS洗滌細(xì)胞，加入0.5 mL 無水甲醇于4 ℃固定3 h，洗滌細(xì)胞后每孔加入0.2 mL Hoechst 33258 染色液，室溫避光染色10 min，吸除Hoechst洗滌2次，加入PBS 0.5 mL，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)并拍照。

1.4.5 AnnexinV-FITC 雙染法檢測細(xì)胞凋亡［19］將對數(shù)生長期的MG-63 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔板中，過夜完全貼壁后按“1.4.4”項(xiàng)下方法分組給藥，48 h 后分別收集每組細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 Western blotting 法檢測細(xì)胞MAPK 信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平［20］MG-63 細(xì)胞按“1.4.4”項(xiàng)下方法接種細(xì)胞、分組并給藥。48 h 后提取各組總蛋白，按BCA 法測定每組蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液按4∶1 的比例混合，95 ℃變性5 min。取各組蛋白樣品30 μg，依次經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3次，加入二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，TBST 清洗3次，顯影。采用Image J 軟件處理圖片，以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，以目標(biāo)蛋白與GAPDH的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。每個(gè)蛋白表達(dá)做3次重復(fù)。

1.4.7 RT-PCR 法檢測細(xì)胞MAPK 信號通路及凋亡相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)水平［21］MG-63 細(xì)胞按“1.4.4”項(xiàng)下方法接種細(xì)胞、分組并給藥。48 h后按Trizol試劑盒方法提取各組樣品總RNA，檢測RNA 純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法進(jìn)行cDNA 合成反應(yīng)。于95 ℃3 min，95 ℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，其所用引物序列見表1。每組基因重復(fù)做3 次，得到擴(kuò)增曲線和CT 值，對各樣本的CT 值進(jìn)行分析，以2-ΔΔCT表示各組基因表達(dá)量。計(jì)算公式如下：

表1 基因與引物序列

ΔCT = CT目的基因-CTGAPDH；-ΔΔCT = ΔCT目的基因-ΔCTGAPDH；2-ΔΔCT由-ΔΔCT值進(jìn)行2的冪運(yùn)算得到。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR 方法，檢測不同濃度仙茅總黃酮作用后JNK2、p38MAPK、Bax、Bcl-2 及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較

見表2。由此可知，仙茅總黃酮能對MG-63 細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，并呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴趨勢。作用24、48、72 h 后細(xì)胞的IC50分別為（273.32±2.44）、（108.35±2.04）、（78.41±1.89）mg/L。雖然藥物作用72 h時(shí)細(xì)胞的IC50值最低，但與作用48 h時(shí)的IC50值差距不大，因此以48 h作為藥物作用時(shí)間，以50、100、200 mg/L作為仙茅總黃酮給藥的低、中、高濃度。

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較（±s）

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。下同。

組 別對照組仙茅總黃酮25 mg/L組仙茅總黃酮50 mg/L組仙茅總黃酮100 mg/L組仙茅總黃酮200 mg/L組仙茅總黃酮300 mg/L組仙茅總黃酮400 mg/L組仙茅總黃酮500 mg/L組n3 3 3 3 3 3 3 3 24 h 98.78±2.25 89.02±6.34*84.11±3.33**81.27±2.84**79.32±5.69**49.78±3.67**30.04±1.54**23.80±4.59**48 h 95.64±2.60 84.60±3.51**78.22±2.79**65.54±4.51**29.99±1.14**16.10±1.03**8.19±4.51**5.77±3.00**72 h 94.13±1.10 81.72±1.88**61.62±2.17**49.85±1.90**21.06±2.76**8.92±3.61**5.65±1.76**3.43±1.97**

2.2 各組細(xì)胞核凋亡形態(tài)比較

見圖1。由圖可知，對照組中細(xì)胞表現(xiàn)為完整的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核大小均一，表現(xiàn)為均勻的藍(lán)色淡染；仙茅總黃酮作用后細(xì)胞隨著藥物劑量的升高逐漸固縮、破裂，細(xì)胞核表現(xiàn)出高亮的藍(lán)色濃染，染色質(zhì)逐漸固縮貼近細(xì)胞核，因凋亡而碎裂的細(xì)胞核也逐漸增多，并出現(xiàn)凋亡小體。因此，仙茅總黃酮作用后細(xì)胞表現(xiàn)出了典型的凋亡細(xì)胞細(xì)胞核熒光特征，且濃度越高，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯。表明仙茅總黃酮作用于MG-63細(xì)胞，可誘導(dǎo)其凋亡。

圖1 各組細(xì)胞凋亡染色（Hoechst 33258染色，200倍）

2.3 各組細(xì)胞凋亡比較

見圖2。仙茅總黃酮各組細(xì)胞加入藥物作用48 h后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組及仙茅總黃酮50、100、200 mg/mL 組的細(xì)胞凋亡率分別為（5.47±1.38）%、（16.61±1.19）%、（35.82±2.76）%、（47.98±2.51）%，呈現(xiàn)出濃度依賴趨勢，仙茅總黃酮各組與對照組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明不同濃度的仙茅總黃酮均能促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡。

圖2 各組流式細(xì)胞圖

2.4 各組細(xì)胞MAPK 信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

見圖3，表3。與對照組相比，仙茅總黃酮作用48 h后，JNK、p38 MAPK 的表達(dá)水平在中、高濃度組細(xì)胞中顯著降低，Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高；Bax的表達(dá)水平在藥物低、中、高濃度組中均顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平均顯著降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001）。

圖3 各組細(xì)胞中JNK、p38MAPK及凋亡相關(guān)蛋白電泳條帶

表3 各組細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表3 各組細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

組別對照組仙茅總黃酮50 mg/L組仙茅總黃酮100 mg/L組仙茅總黃酮200 mg/L組n3 3 3 3 JNK/GAPDH 0.81±0.15 0.66±0.21 0.60±0.18*0.51±0.16**P38 MAPK/GAPDH 0.83±0.08 0.68±0.09 0.59±0.10*0.47±0.02**Caspase-3/GAPDH 0.60±0.08 0.79±0.08 0.91±0.09*1.31±0.13**Bcl-2/GAPDH 1.09±0.07 0.94±0.06*0.86±0.09*0.69±0.05**Bax/GAPDH 0.51±0.03 0.68±0.04**0.79±0.04***0.99±0.05***

2.5 各組細(xì)胞MAPK 信號通路及凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平［22］

見表4。不同濃度仙茅總黃酮作用48 h 后，各基因的mRNA表達(dá)水平變化趨勢與對應(yīng)蛋白表達(dá)水平趨勢相同，且與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組基因mRNA表達(dá)量比較（±s）

表4 各組基因mRNA表達(dá)量比較（±s）

組別對照組（n=3）仙茅總黃酮50 mg/L組（n=3）仙茅總黃酮100 mg/L組（n=3）仙茅總黃酮200 mg/L組（n=3）時(shí)間ΔCT 2-ΔΔCT ΔCT 2-ΔΔCT ΔCT 2-ΔΔCT ΔCT 2-ΔΔCT p38 MAPK 8.59±0.28 1.00±0.18 8.80±0.34 0.87±0.20 9.46±0.20 0.55±0.08*9.59±0.20 0.50±0.07**JNK 2 5.54±0.17 1.00±0.11 5.94±0.06 0.76±0.03**5.95±0.04 0.75±0.02**6.16±0.05 0.65±0.02**Bcl-2 4.43±0.04 1.00±0.03 4.65±0.06 0.86±0.04*4.70±0.08 0.83±0.04**4.83±0.11 0.76±0.06***Bax 4.04±0.14 1.00±0.10 3.99±0.17 1.03±0.12 3.77±0.17 1.21±0.14 3.29±0.45 1.72±0.56*Caspase-3 4.21±0.29 1.00±0.19 4.08±0.19 1.03±0.14 3.71±0.44 1.18±0.10 3.33±0.53 1.47±0.05*

3 討 論

OS 雖整體發(fā)病率低于其他器官組織的惡性腫瘤，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)問題非常嚴(yán)重，惡性程度在病理上被列為高級別。近年來，標(biāo)準(zhǔn)OS 治療方案逐漸形成：新輔助化療-手術(shù)-輔助化療［22］。但仍然存在一些問題，導(dǎo)致OS的治療無顯著進(jìn)展，進(jìn)入治療的平臺期。文獻(xiàn)資料表明，OS 發(fā)生和發(fā)展所必需的靶點(diǎn)、途徑和過程都有MAPK 信號通路的參與和調(diào)控［23］，MAPK 信號通路中JNK 和p38 MAPK 兩個(gè)途徑與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)。Bax 和Bcl-2 蛋白在細(xì)胞凋亡過程中分別發(fā)揮著促凋亡和抗凋亡作用。Caspase 是細(xì)胞凋亡的核心成員，Caspase-3 激活后可誘導(dǎo)線粒體凋亡通路的激活，誘導(dǎo)半胱天冬酶的切割底物多聚聚合酶PARP 的裂解，從而引起細(xì)胞凋亡［24］。

本實(shí)驗(yàn)在陽性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同濃度的仙茅總黃酮對骨肉瘤MG-63 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。CCK-8、Hoechst 33258 染色、AnnexinV-FITC 雙染實(shí)驗(yàn)表明不同濃度的仙茅總黃酮能對MG-63 細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，并促進(jìn)MG-63 細(xì)胞凋亡，其促凋亡作用與仙茅總黃酮呈濃度依賴。進(jìn)一步利用了RT-PCR 和Western blotting 檢測驗(yàn)證了上述結(jié)果，并表明不同濃度的仙茅總黃酮能夠下調(diào)MAPK 信號通路中JNK、p38MAPK 和抗凋亡因子Bcl-2 基因和蛋白的表達(dá)水平、能夠上調(diào)促凋亡因子Bax、Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，仙茅總黃酮能抑制骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，究其機(jī)制可能與抑制MAPK 信號通路的活性、Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。以上研究表明仙茅作為常用的補(bǔ)腎助陽中藥，在OS的治療方面具有巨大的藥用價(jià)值等待發(fā)掘。后期，本課題組也將結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立裸鼠MG-63 細(xì)胞移植瘤模型，給予仙茅總黃酮進(jìn)行干預(yù)，通過體內(nèi)移植瘤各項(xiàng)指標(biāo)的檢測，進(jìn)一步探究仙茅總黃酮對OS 的治療作用，并進(jìn)一步證明其機(jī)理，為未來OS的治療提供新的更完整的理論依據(jù)。