膀胱癌組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)及與患者腫瘤特征、預(yù)后的相關(guān)性分析*

姬文莉，王翠翠，林珍珍，張煥

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 病理科，新疆 烏魯木齊 830011）

膀胱癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，可引起膀胱纖維化，降低膀胱容量，出現(xiàn)尿液反流，造成腎積水和腎臟炎癥，使患者出現(xiàn)尿急、尿痛等排尿系統(tǒng)損害，甚至危及患者生命[1]。膀胱癌惡性程度高、預(yù)后差且早期診斷率較低，故積極探索與疾病進(jìn)展、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，或許能夠?yàn)轭A(yù)后評(píng)估提供新的思路，并為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。Beclin1蛋白是酵母自噬基因Atg6的同源基因，作為與自噬相關(guān)的腫瘤抑制基因，其具有抑制腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展、誘導(dǎo)凋亡、自噬等功能，與多種惡性腫瘤的抗腫瘤治療相關(guān)[2-3]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）蛋白也屬于自噬相關(guān)基因之一，參與自噬體形成，在自噬的溶酶體降解過程中發(fā)揮抑癌作用[4-5]。本研究觀察膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)狀況，并分析兩者與預(yù)后的相關(guān)性，旨在為膀胱癌的治療及預(yù)后評(píng)估提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2021年8月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理資料完整的110例膀胱癌患者。其中，男性79例，女性31例；年齡54～78歲，平均（65.49±6.13）歲；體質(zhì)量指數(shù)20～29 kg/m2，平均（25.82±2.16）kg/m2；白細(xì)胞計(jì)數(shù)4.2～11.5×109/L，平均（7.52±2.03）×109/L；血紅蛋白89～128 g/L，平均（116.42±7.18）g/L；合并糖尿病14例，高血壓42例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《臨床腫瘤學(xué)》[6]中膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診；③預(yù)計(jì)生存期＞6個(gè)月；④接受根治性切除治療；⑤患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前接受放射治療、化學(xué)治療或其他輔助治療；②長(zhǎng)期服用免疫抑制劑；③伴有其他惡性腫瘤；④合并血液系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)功能障礙；⑤膀胱癌以外的因素導(dǎo)致死亡。

1.3 方法

1.3.1 膀胱癌組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白檢測(cè) 采集患者癌組織、癌旁組織樣本，生理鹽水沖洗，置于10%甲醛固定24 h，取出用酒精洗滌待測(cè)。采用分支DNA-液相芯片法檢測(cè)樣本中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白，具體操作：在待測(cè)樣本中加入一定量裂解液，置于55～58 ℃環(huán)境中裂解120 min，移至孵育板上，加入緩沖液、探針-微球、延伸探針置于55 ℃環(huán)境中震蕩孵育過夜；第2天將孵育板靜置于磁力架上60 s，使磁性微球沉積至底部，去除上清液，加入洗滌液，震蕩洗滌60 s，再次置于磁力架上靜置60 s，去除上清液，反復(fù)3次；加入標(biāo)記延伸探針、探針，50 ℃環(huán)境下震蕩反應(yīng)60 min；再次加入洗滌液，震蕩洗滌60 s，磁力架上靜置60 s，去除上清液，洗滌2次；加入藻紅蛋白，50 ℃環(huán)境下震蕩反應(yīng)30 min，磁力架上靜置60 s，去除上清液，洗滌2次；加入洗滌液震蕩5 min，采用Luminex閱讀儀讀取數(shù)據(jù)，獲得檢驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判讀：Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平≥75%視為高表達(dá)，65%～＜ 75%視為中偏高表達(dá)，40%～＜ 65%視為中表達(dá)，25%～＜ 40%視為中偏低表達(dá)，＜ 25%視為低表達(dá)。將高表達(dá)、中偏高表達(dá)作為高表達(dá)，中表達(dá)、中偏低表達(dá)、低表達(dá)作為中低表達(dá)。

1.3.2 病理參數(shù) 詳細(xì)記錄膀胱癌患者病理參數(shù)，包括性別、年齡（＜ 60歲、≥ 60歲）、腫瘤直徑（＜ 3 cm、≥ 3 cm）、血管侵犯（是、否）、組織學(xué)分級(jí)（高級(jí)別、低級(jí)別）、臨床分期（Ta～T1、T2～T4）、浸潤(rùn)性（是、否）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是、否）。

1.3.3 預(yù)后評(píng)估 隨訪1年，將腫瘤病灶完全緩解或部分緩解且持續(xù)生存的患者視為預(yù)后良好；將腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤病灶穩(wěn)定、進(jìn)展、出現(xiàn)新發(fā)病灶或病死的患者視為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Phi法；影響因素的分析采用多因素逐步Logistic回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織與癌旁組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)率比較

膀胱癌組織與癌旁組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），膀胱癌組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率較癌旁組織低，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白中低表達(dá)率較癌旁組織高。見表1。

表1 膀胱癌組織與癌旁組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)比較 [n =110，例（%）]

2.2 不同因素膀胱癌患者Beclin1蛋白高表達(dá)率比較

有49例膀胱癌患者Beclin1蛋白高表達(dá)。不同組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、預(yù)后和是否浸潤(rùn)性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Beclin1蛋白高表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高組織學(xué)分級(jí)、T2～T4分期、浸潤(rùn)性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良的膀胱癌患者低于低組織學(xué)分級(jí)、Ta～T1分期、非浸潤(rùn)性、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后良好的患者。不同性別、年齡、腫瘤直徑、血管侵犯的膀胱癌患者Beclin1蛋白表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同因素膀胱癌患者Beclin1蛋白高表達(dá)率比較 例（%）

2.3 不同因素膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率比較

36例膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)。不同組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、預(yù)后和是否浸潤(rùn)性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高組織學(xué)分級(jí)、T2～T4分期、浸潤(rùn)性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良的膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率低于低組織學(xué)分級(jí)、Ta～T1分期、非浸潤(rùn)性、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后良好的患者。不同性別、年齡、腫瘤直徑、血管侵犯的膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同因素膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率比較 例（%）

2.4 膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

經(jīng)Phi系數(shù)相關(guān)性分析，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白與預(yù)后不良均呈負(fù)相關(guān)（Phi= -0.277和-0.222，P=0.004和0.020）。

2.5 影響膀胱癌患者預(yù)后的多因素逐步Logistic回歸分析

將患者預(yù)后作為因變量（預(yù)后良好= 0，預(yù)后不良= 1），Beclin1蛋白表達(dá)（中低表達(dá)= 0，高表達(dá)= 1）和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)（中低表達(dá)= 0，高表達(dá)= 1）為自變量，采用向前逐步法，進(jìn)行多因素逐步Logistic回歸分析。結(jié)果顯示：Beclin1高表達(dá)[=3.892（95% CI：1.504，10.072）]、LC3Ⅱ蛋白中低表達(dá)[=3.358（95% CI：1.165，9.677）]是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響膀胱癌患者預(yù)后的多因素逐步Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

自噬主要指通過溶酶體途徑降解一些細(xì)胞內(nèi)源性底物和細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的生理過程，是機(jī)體對(duì)外界不良刺激的主動(dòng)防衛(wèi)策略，也是一種細(xì)胞程序性死亡形式，是真核生物普遍存在的生理過程之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，自噬與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞死亡、進(jìn)展等病理過程[7]。在前列腺癌、肝癌、甲狀腺癌、卵巢癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白缺失或活性下調(diào)，并對(duì)患者預(yù)后及生存產(chǎn)生重要影響[8-9]。但目前，有關(guān)自噬在膀胱癌中的潛在分子機(jī)制尚無(wú)明確定論。

Beclin1基因位于染色體17q21，是具有450個(gè)氨基酸序列、12個(gè)外顯因子的蛋白質(zhì)，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端是與抗凋亡家族成員BCL-w、BCL-xl、BCL-2等結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠破壞腫瘤的抗凋亡能力；中間為螺旋結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合紫外線輻射抵抗的相關(guān)蛋白，形成自噬膜并對(duì)腫瘤進(jìn)展產(chǎn)生抑制作用；C端與細(xì)胞膜相連，為進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域，可與Vps34相結(jié)合，啟動(dòng)自噬達(dá)到抑制腫瘤的作用[10-11]。ZHANG等[12]研究指出，Beclin1過表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)自噬。ZHANG等[13]研究表明，靶向ARBeclin1復(fù)合物能夠有效抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率低于癌旁組織，表明Beclin1蛋白表達(dá)減少與腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)；進(jìn)一步分析其與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，Beclin1與患者預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)，Beclin1蛋白中低表達(dá)是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。細(xì)胞自噬凋亡能夠消除衰老細(xì)胞，維持生物體動(dòng)態(tài)平衡。自噬基因Beclin1結(jié)合其配體能夠調(diào)節(jié)自噬，誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬性凋亡；而自噬基因Beclin1表達(dá)缺失時(shí)，腫瘤則可能逃避自噬性死亡。Beclin1作為促凋亡分子能夠抑制BCL-w、BCLxl、BCL-2等抗凋亡因子活性，并增強(qiáng)半胱氨酸蛋白酶活性，增強(qiáng)順鉑、白樺脂酸、甲氨蝶呤等抗癌藥物功效，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。有研究認(rèn)為，Beclin1能夠上調(diào)去泛素化酶人泛素特異性肽酶13（USP13）、USP10、USP2活性，增強(qiáng)抑癌基因活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展[15]。而Beclin1表達(dá)缺失或降低則可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)、促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和新血管成熟，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生不利影響。

LC3與酵母自噬基因Atg8約有30%的氨基酸同源，LC3在細(xì)胞內(nèi)部主要定位于自噬泡表面和前自噬泡。LC3可分為Ⅰ型和Ⅱ型，未出現(xiàn)自噬時(shí)，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)常規(guī)表達(dá)Ⅰ型LC3，出現(xiàn)自噬時(shí)，LC3Ⅰ可與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，形成LC3Ⅱ，并始終結(jié)合在自噬體膜上，是標(biāo)志性自噬基因[16]。HUANG等[17]研究指出，LC3乙酰haul水平降低可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。吳筱蔓等[18]觀察喉癌組織及正常組織中LC3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，喉癌組織中LC3陰性表達(dá)率更高，LC3表達(dá)陰性可能是影響喉癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中LC3Ⅱ蛋白高表達(dá)率低于癌旁組織，與患者預(yù)后密切相關(guān)，LC3Ⅱ蛋白中低表達(dá)是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。研究指出，自噬的自我降解過程廣泛存在于真核細(xì)胞中，其在細(xì)胞廢物清除、生長(zhǎng)發(fā)育、重建等過程中發(fā)揮重要作用[19]。而作為自噬溶酶體最基本的組成成分，LC3表達(dá)與自噬活性相關(guān)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3含量明顯增加。LC3表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞自噬能力也隨之降低，惡性細(xì)胞增殖速度加快，機(jī)體不能及時(shí)、有效地清除損傷、變異的細(xì)胞，則可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[20]。此外，LC3表達(dá)下調(diào)或缺失還可能對(duì)多種癌基因產(chǎn)生激活作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，加重病情進(jìn)展，影響患者預(yù)后。

綜上所述，膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白中低表達(dá)是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，臨床應(yīng)密切關(guān)注膀胱癌患者癌組織中兩種蛋白表達(dá)情況，并采取對(duì)應(yīng)干預(yù)措施，以改善患者預(yù)后。