腎移植器官保存研究進展*

何龍，張藝艦，楊宏偉

（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 器官移植中心，遼寧 沈陽 110016）

供體器官的靜態(tài)冷藏仍然是保存實體器官的主要方法。在靜態(tài)冷保存期間，供體器官先使用低溫保存液沖洗，隨后浸泡在該保存溶液中，并儲存在0～4 ℃冷水中。隨著器官冷卻，器官新陳代謝速度減慢，缺氧及營養(yǎng)缺乏有害影響減輕。缺氧的有害影響雖然有所減輕，但并沒有完全消除。目前有效的解決方案，包括減輕低溫引起的細(xì)胞腫脹、防止細(xì)胞內(nèi)酸中毒、防止細(xì)胞間隙的腫脹、防止再灌注過程中氧自由基的損傷，以及提供再生高能磷酸化合物底物。基于這些原則，學(xué)者們研制了幾種器官保存液并引入臨床。每種保存溶液都有其獨特的成分，可以抵消間質(zhì)和細(xì)胞水腫、細(xì)胞酸中毒和氧自由基的產(chǎn)生。

1 臨床常見腎移植器官保存液

1.1 Collins保存液

Collins保存液能在移植前通過簡單的低溫儲存成功保存腎臟。當(dāng)缺乏氧氣或營養(yǎng)時，腎臟可以吸收水分和鈉離子，并失去鉀離子。因此，Collins保存液被設(shè)計為具有高鉀、高鎂和低鈉濃度，以模擬細(xì)胞內(nèi)液的組成。其是一種高葡萄糖濃度的磷酸鹽溶液，可平衡滲透壓。后來，在Collins保存液的基礎(chǔ)上進行了幾次修改，被稱為EC（euor-collins）保存液。在接下來的15年里，EC保存液在臨床上一直被廣泛使用，直到“金標(biāo)準(zhǔn)”UW（university of wisconsun）保存液出現(xiàn)。

1.2 UW保存液

UW保存液是器官保存中最常見的低溫保存溶液。其最初是作為胰腺移植的保存方案而研制出來的，但近年來被廣泛用于保存不同種類的器官，包括腎臟、肝臟和小腸。UW保存液是一種模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境低鈉和高鉀的仿細(xì)胞內(nèi)液型保存液。UW保存液具有以下幾個優(yōu)點：①以大分子量的羥乙基淀粉（Hetastarch,HES）作為膠體載體，在灌注過程中減少細(xì)胞間質(zhì)水腫；②引入非滲透性物質(zhì)，如乳糖醛酸鹽和棉子糖代替葡萄糖，以防止細(xì)胞腫脹；③添加別嘌醇和還原型谷胱甘肽作為氧自由基清除劑，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)；④腺苷被用作合成ATP的底物。動物實驗和臨床試驗中，UW保存液優(yōu)于EC保存液[1]。例如，在狗自體腎移植模型中，所有腎臟在UW保存液中保存72 h均能存活，而在EC保存液中保存72 h均未存活，這表明UW保存液能有效保存腎臟72 h[2]。一項多中心試驗表明，與EC保存液相比，使用UW保存液的腎臟保存效果更好，移植物功能延遲恢復(fù)的發(fā)生率更低，1年移植物生存率更高[3]。最新研究表明，UW保存液也存在潛在的缺點，包括：①HES產(chǎn)生的高黏度使組織沖洗和飽和復(fù)雜化；②使用前需加入青霉素G、地塞米松、胰島素；③UW保存液的成本較高[4]。因此，需要進一步改良為更有效、更經(jīng)濟的保存方案。

1.3 HTK保存液

HTK（histidine-tryptophan-ketoglutarate）保存液最初是作為一種心臟手術(shù)的心臟停搏液[5]，隨后被證明能有效保存肝臟、腎臟和胰腺[6]。與UW保存液不同，HTK保存液是一種高鈉和低鉀濃度的仿細(xì)胞外型保存液。組氨酸、色氨酸、α-酮戊二酸是HTK保存液的3個關(guān)鍵成分。組氨酸作為緩沖液，能在冷缺血及缺氧條件下延緩組織pH值下降。色氨酸是自由基清除劑和膜穩(wěn)定劑。α-酮戊二酸是能量底物。HTK保存液的黏度與水相似。與UW保存液相比，這種較低的黏度能確保冷卻時間更短，也不需要加壓灌注。HTK保存液的有效性在20世紀(jì)90年代初的臨床試驗中得到了證實[7]。有研究指出，在腎移植保存中，HTK與UW保存液在保存能力方面是等效的，原發(fā)性無功能的發(fā)生率相同，3年移植腎生存率相似[8]。HTK與EC保存液相比，使用HTK保存液的移植物恢復(fù)延遲（delayed graft function,DGF）發(fā)生率更低[9]。與UW保存液相比，HTK保存液的總體成本較低[10]。然而，有研究指出在心臟死亡后的器官捐贈中，HTK保存與冷缺血時間＞ 8 h的移植物損失風(fēng)險將增加[11]。HTK保存液的一個潛在缺點是低黏度導(dǎo)致灌注量增加。盡管如此，HTK保存液仍是目前使用最多的腎臟保存液之一。

1.4 高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤保存液

高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤（hypertonic citrateadenine，HC-A）保存液是我國應(yīng)用最廣泛的腎臟保存液，是20世紀(jì)80年代末由上海長征醫(yī)院和上海中心血站研發(fā)的一種腎臟灌洗保存液[12]。HC-A保存液是一種高滲枸櫞酸溶液，添加腺嘌呤為營養(yǎng)物質(zhì)，增加腎臟對熱缺血的耐受力。HC-A保存液甘露醇濃度較高，抑制細(xì)胞水腫和氧化應(yīng)激反應(yīng)。HC-A保存液應(yīng)用20年后，上海長征醫(yī)院基于HC-A的配方又開發(fā)了HC-AⅡ（hypertonic citrate-adenineⅡ）保存液。HC-AⅡ保存液具有檸檬酸和磷酸鹽雙緩沖系統(tǒng)，增強了緩沖容量。與HC-A保存液相比，HC-AⅡ保存液中鎂離子濃度明顯降低，腺苷濃度增加。同時還添加了精氨酸、色氨酸和川芎嗪的新成分，以穩(wěn)定細(xì)胞膜、保護線粒體功能。我國一項多中心隨機對照試驗指出，HC-AⅡ保存液與HTK保存液在腎臟保存方面的有效性和安全性相似，提示HC-AⅡ保存液是一種全新的臨床器官保存方案[13]。由于HC-A保存液有效且成本低，目前在我國約50%的腎移植中使用，但國外文獻(xiàn)中對HC-A保存液的報道很少。事實上，HC-A保存液具有較高的有效性和安全性，因為其已經(jīng)在我國用于＞ 10萬次的腎臟保存[14]。

2 器官保存液的最新進展

近年來，人們對缺血再灌注損傷過程和常用保存液的成分有了更深入的了解，并開始努力研發(fā)新的保存方案，例如在標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加特定成分，進一步防止器官缺血再灌注損傷。

2.1 膠體

幾種高分子量膠體已被應(yīng)用于器官保存液中，以維持血管內(nèi)外壓力和防止細(xì)胞間質(zhì)水腫。UW溶液使用HES作為膠體，這是一種穩(wěn)定、無毒的溶液。此外，其他膠體也被用來替代HES，以降低保存液成本。右旋糖酐是研究最廣泛的HES替代品之一。其是一種安全的替代品，可用于臨床腎臟保存[15]。右旋糖酐可能在移植物再灌注階段發(fā)揮作用，因為其會降低血管阻力，并具有抗血栓生成的作用[16]。聚乙二醇是一種中性水溶性無毒聚合物，在器官保存液中替代HES[17]。IGL-1（institute georges lopez）保存液是一種基于聚乙二醇的保存液，與UW保存液相比，Na+/K+濃度完全相反[18]。在一項多中心研究中，IGL-1保存液保存的腎臟在DGF、排斥率、患者和移植物存活方面與UW溶液相似[19]。Polysol保存液是另一種基于聚乙二醇且含有抗氧化劑、氨基酸、能量底物和維生素的保存液[20]。在豬腎移植研究中，與UW和HTK保存液相比，Polysol保存液在長時間缺血后有改善微循環(huán)和保持結(jié)構(gòu)完整性的作用[21-23]。但沒有研究能證明Polysol保存液在活體腎移植中的優(yōu)勢。與UW保存液相比，受試者的急性排斥反應(yīng)率更高[24]。因此，Polysol保存液在臨床上的使用值得商榷。

2.2 氣體

近幾年在保存溶液中使用治療性氣體作為有效添加劑被廣泛關(guān)注[25]。氫氣H2是一種高度擴散的抗氧化氣體，很容易進入細(xì)胞。H2可以通過減少活性氧的產(chǎn)生來保護線粒體功能，從而防止細(xì)胞凋亡[21]。與單純UW保存液相比，富含H2的UW保存液可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、腎小管凋亡及間質(zhì)纖維化，改善移植腎功能并提高受者生存率[26]。一氧化碳CO通過減少促炎細(xì)胞因子釋放、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、改善線粒體功能來發(fā)揮保護細(xì)胞的作用[27-29]。在大鼠和豬移植研究中，補充含有CO或一氧化碳釋放分子的UW保存液對腎缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用[30-32]。一氧化氮NO與減輕缺血再灌注損傷相關(guān)[33]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶通過介導(dǎo)血管舒張而發(fā)揮細(xì)胞保護作用，誘導(dǎo)型內(nèi)皮型一氧化氮合酶介導(dǎo)移植后的移植物損傷[35]。硫化氫HS減輕缺血再灌注損傷的作用已在動物模型中得到證實[35-36]。HS可通過減少腎小球、腎小管細(xì)胞的壞死和凋亡來改善早期同種異體移植物的功能[37-38]。

2.3 藥物添加劑

除上述添加劑外，一些藥物添加劑，包括氧自由基清除劑、線粒體保護劑和藥物也被添加到保存液中。添加氧自由基清除劑可以直接捕獲氧自由基，并保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激反應(yīng)，有助于減少脂質(zhì)過氧化，提高腎臟保存的存活率[39]。此外，外源性添加硒[40-41]、異丙酚和丹參酮[42]的保存液往往有抗氧化作用并可以降低丙二醛濃度，進而改善移植物的長期功能。其他在動物研究中有益的藥物添加劑包括前列腺素E1[43]、?；撬?、雷諾嗪等。其也有被用于臨床的潛力，但潛在的作用機制和具體信號通路尚不清楚。因此，還需要更多的實驗研究和臨床試驗來證實。

3 體外器官機械灌注技術(shù)

體外器官機械灌注技術(shù)通常根據(jù)機械灌注的溫度進行分類。下面簡要介紹低溫（4～6 ℃）、亞常溫（20～30 ℃）和常溫（35～37 ℃）腎臟機械灌注的概念和目前的常用方案。

3.1 低溫機械灌注

低溫機械灌注保存已在臨床腎移植中成功應(yīng)用。目前幾種腎臟低溫機械灌注設(shè)備已上市，包括：LifePort、Kidney Assist、Waters RM3及Waves IGL。在離體灌注機中，使用滾輪或離心泵產(chǎn)生壓力控制脈動流，避免了灌注相關(guān)的移植物損傷。對腎臟低溫機械灌注，低壓力灌注（25～30 mmHg）更利于預(yù)防腎臟水腫和內(nèi)皮損傷。所使用的灌注溶液與低溫保存液有質(zhì)的不同。唯一被臨床證實用于腎臟低溫機械灌注的液體是KPS-1（kidney perfusion solution-1）。與傳統(tǒng)的UW保存液和其他低溫保存液不同，KPS-1具有類似于細(xì)胞外的Na+/K+平衡濃度。此外，其含有其他不滲透物質(zhì)（葡萄糖酸鹽和甘露醇，而不是乳糖酸鹽和棉子糖）和葡萄糖。隨著對器官需求的增加和供體人口的老齡化，使用擴大標(biāo)準(zhǔn)供者腎臟變得不可避免。低溫冷保存對高危器官的適用性有限，促使學(xué)者對替代方法和更復(fù)雜的保存方法進行廣泛研究。由MOERS等[44]進行的低溫機械灌注里程碑式研究將機器灌注帶回了臨床，這項研究納入672個腎臟移植受者，結(jié)果顯示與低溫冷保存相比，低溫機械灌注的移植物1年和3年存活率顯著提高，DGF發(fā)生率降低。在心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death,DCD）的腎移植受者研究中，低溫機械灌注的移植物1年和3年存活率也具有顯著優(yōu)勢[45]。

3.2 常溫機械灌注

盡管低溫機械灌注技術(shù)效果顯著，但低溫的有害影響仍然存在，腎移植的結(jié)果仍然非常依賴?yán)淙毖獣r間（cold ischemia time,CIT）。即使在低溫機械灌注技術(shù)應(yīng)用于臨床后，邊緣供腎尤其是DCD的利用仍然有限。新興的常溫機械灌注技術(shù)可以減少甚至消除CIT和低溫造成的危害，在擴大標(biāo)準(zhǔn)供方面具有巨大潛力。在常溫機械灌注過程中，器官在常溫（35～37 ℃）下用含氧血液或其他含有灌注液、營養(yǎng)物質(zhì)和藥物的氧氣載體進行灌注。臨床前期試驗發(fā)現(xiàn)，腎臟常溫機械灌注的最佳動脈壓是腎臟自我調(diào)節(jié)生理范圍的下限即95 mmHg[46]。低溫機械灌注液和常溫機械灌注液的主要區(qū)別是常溫機械灌注液需要一個氧氣載體。白細(xì)胞和血小板耗竭的自體全血已在實驗研究中用于腎臟的常溫機械灌注[47-48]。清除白細(xì)胞和血小板可以促進器官功能恢復(fù)，且不會誘導(dǎo)正常體內(nèi)再灌注過程中的炎癥反應(yīng)和血栓形成。血漿中的白蛋白和球蛋白可以維持穩(wěn)定的滲透壓，血漿中的電解質(zhì)可以調(diào)節(jié)pH值。然而，在臨床工作中采集自體血液并現(xiàn)場制備灌注液難以實現(xiàn)。此外，剩余的纖維蛋白原可能會促進微血栓的形成。在大多數(shù)方案中，常溫機械灌注液包含肝素（基于血液或紅細(xì)胞的灌注液）、血管擴張劑、甘露醇、皮質(zhì)類固醇、抗生素、含葡萄糖、氨基酸和胰島素等營養(yǎng)制劑[49-50]。總而言之，常溫機械灌注不僅是一種保存技術(shù)，而且是一種器官調(diào)節(jié)工具，其中氧似乎是關(guān)鍵因素，但還需要更多的臨床研究來證實這一假設(shè)。

3.3 亞常溫機械灌注

亞常溫機械灌注是一種研究較少，但也很有前景的供腎保存替代方案。20～30 ℃器官機械灌注旨在避免冷誘導(dǎo)的移植物損傷，但不會將代謝增加到需要氧氣載體進行充分氧合的水平。目前，這項技術(shù)仍處于實驗階段。一項研究表明，37 ℃、1 h的缺血腎灌注比32 ℃相同持續(xù)時間的灌注更好地保留了腎小管和腎功能，即低于生理溫度可能會降低紅細(xì)胞的攜氧能力[51]。亞常溫機械灌注降低了Toll樣受體信號分子的表達(dá)，并降低了腎損傷標(biāo)志物中性粒細(xì)胞明膠酶脂蛋白和白細(xì)胞介素-6水平[52]。盡管臨床前期試驗結(jié)果很好，但還需要進一步研究來證明這些技術(shù)的適用性，并在時機和灌注成分方面建立最佳方案。

4 小結(jié)

在過去的幾十年里，器官的保存方法有了很大進步。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)千例手術(shù)成功地使用了傳統(tǒng)的保存方法。器官保存解決方案的主要原則是在保存期間最大限度地維持器官活力，以便在再灌注階段后獲得更好的結(jié)果?？傊?，隨著移植歷史和器官保存方法的進步，至少腦死亡供者腹部器官在最低保存時間可確保臨床應(yīng)用，但對胸部器官保存時間的延長、在狀態(tài)較差的供者和腦死亡供者器官保存法等方面還有許多工作要做。為提高移植器官的成活率，更進一步的器官保存研究是必要的。