辣木葉與黃梁木葉混貯的組合效應：發(fā)酵參數(shù)和蛋白質(zhì)水解

■ 李紫欣 董晨曦 劉 萍 張 微，2 和立文，2*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，畜禽營養(yǎng)與飼養(yǎng)全國重點實驗室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學三亞研究院，海南三亞 572000）

辣木和黃梁木是（亞）熱帶地區(qū)優(yōu)質(zhì)的木本飼料資源，產(chǎn)量高，營養(yǎng)豐富，且富含多種藥用活性成分，是重要的飼料蛋白和功能成分來源。由于反芻動物對非蛋白氮的沉積效率普遍低于真蛋白，因此青貯過程中蛋白質(zhì)大量降解會降低青貯飼料的飼用價值。前期研究表明，高水分辣木葉青貯過程中有超過一半的蛋白質(zhì)發(fā)生水解，而高水分黃梁木葉青貯的蛋白質(zhì)水解卻很少，可能與其較高的單寧含量及特別的蛋白酶活性有關。據(jù)此推測，混入黃梁木葉可能有助于抑制辣木葉青貯的蛋白質(zhì)水解，改善青貯品質(zhì)。

辣木（Moringa oleifera），辣木科辣木屬的多年生熱帶落葉喬木，原產(chǎn)于印度，廣泛種植于非洲、亞洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國云南、貴州、廣東、海南等地均有種植。由于其具有豐富的生物活性（抗氧化性、抗菌性）、營養(yǎng)價值高[1-2]和產(chǎn)量大[3]的特點，被世界廣泛種植并應用于醫(yī)藥、食品、飼料及工業(yè)生產(chǎn)。目前，辣木還被開發(fā)成家畜重要的蛋白質(zhì)來源和功能性飼料。研究表明，在奶牛飼糧中添加辣木（或提取物），不僅可以改善動物飼料利用效率、生產(chǎn)性能和健康狀況[4-6]，還能減少溫室氣體的排放[7-8]；混入辣木葉還可以提高豆科飼草的青貯品質(zhì)[9-10]。然而，辣木葉青貯發(fā)酵過程中有超過一半的蛋白質(zhì)發(fā)生降解，這可能會降低動物氮素利用效率，導致氮排放增加。

黃梁木（Neolamarckia cadamba），又稱團花樹，是茜草科團花屬一種大型落葉速生熱帶樹種，在我國主要分布在廣東、廣西、云南等省區(qū)，同時也是熱帶和亞熱帶地區(qū)新興的一種木本飼料植物，具有生長速度快、單位產(chǎn)量高和生物活性豐富的特點[11-12]。黃梁木葉具有較高的飼用價值和較好的青貯品質(zhì)[11，13]，并且在青貯發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解程度很低，這可能與其含有豐富的單寧和獨特的蛋白酶活性有關[11，14]；混入一定比例黃梁木葉可顯著降低豆科青貯飼料非蛋白氮和氨態(tài)氮的含量[15]。

混入辣木葉或黃梁木葉可以一定程度改善常規(guī)牧草青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)保存，但兩種材料在青貯發(fā)酵上是否存在協(xié)同作用尚不清楚，適宜混合比例仍不明確。因此，在本研究中，將新鮮的辣木葉和黃梁木葉按一定比例混合青貯(100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100，鮮樣基礎)，并在青貯發(fā)酵的第3、7、14、30 天取樣，分析青貯發(fā)酵品質(zhì)、氮組分、蛋白酶活性等指標，以研究這兩種木本飼料在青貯發(fā)酵方面的組合效應。

1 材料與方法

1.1 原料準備與青貯制作

從試驗田人工采集新鮮的辣木嫩枝葉和黃梁木葉，在實驗室用鍘草刀分別將其剪碎至1～2 cm，然后按一定鮮樣比例（100∶0、75∶25、50∶50、25∶75 和0∶100）稱取兩種原材料進行復配，每份總量200 g鮮重，每個復配比例稱取12 份，分別混合均勻后裝入實驗室用聚乙烯青貯袋（20 cm×30 cm），用家用食品真空封口機抽氣密封，準確稱量記錄每袋青貯的初始重量后避光室溫存放。整個試驗共制備60 份袋裝青貯（5個混合比例×4個采樣時間點×3個重復），分別在青貯發(fā)酵第3、7、15、30 天，每個復配比例隨機挑選3 袋青貯開封取樣，每袋青貯取樣一式三份，每份20 g，分別用于微生物數(shù)量平板計數(shù)、pH 和有機酸、蛋白酶活性檢測，余下青貯烘干用于養(yǎng)分分析。此外，每次開封前稱量每袋青貯重量，根據(jù)青貯前后的質(zhì)量差估算青貯干物質(zhì)損失。

1.2 青貯微生物數(shù)量、發(fā)酵參數(shù)、蛋白質(zhì)組分和蛋白酶活性檢測

試驗流程參照He 等[14]。取一份20 g 樣品加入180 mL 滅菌生理鹽水浸提，置于搖床上低速搖蕩30 min，浸提液10×梯度稀釋，分別用MRS 培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基進行乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌培養(yǎng)，放置在普通培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，3 d后挑選菌落數(shù)為30～300之間的平板進行菌落計數(shù)。另取一份20 g 樣品加入180 mL 純化水浸泡，置于4 ℃冰箱中過夜，隨后用定性濾紙過濾，收集濾液用于測定pH、氨態(tài)氮和有機酸的含量。其中，pH 測定用便攜式玻璃電極pH 計（PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司），氨態(tài)氮含量檢測采用苯酚-次氯酸鈉法[16]，有機酸含量分析采用高效液相色譜法（島津LC-14型，日本）。此外，取20 g青貯樣品，加入100 mL 預冷磷酸鈉緩沖液后進行勻漿處理，過濾收集濾液，采用Guo 等[17]和Feller 等[18]的方法測定酸性蛋白酶、羧肽酶和氨基肽酶的活性。剩余的青貯飼料轉移到牛皮紙大信封袋中，置于65 ℃烘箱中干燥48 h，測定干物質(zhì)含量，最后將烘干樣粉碎過1 mm篩，參照Licitra 等[19]的方法分析青貯蛋白質(zhì)組分（粗蛋白質(zhì)、真蛋白質(zhì)、非蛋白氮），其中氮含量采用凱氏定氮法（Kjeltec 2300，F(xiàn)OSS）測定，粗蛋白含量通過N 含量×6.25計算。

此外，借鑒飼料間組合效應評價方法，通過組合效應指數(shù)合理評估兩種原料混合青貯的組合效應，以期篩選出最佳的復配比例。組合效應指數(shù)計算公式參照王旭[20]。

單項組合效應指數(shù)（SFAEI）=（組合后實測值-加權估算值）/加權估算值

式中：綜合組合效應指數(shù)——各單項組合效應值之和。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用SAS 9.2 軟件的GLM 程序進行雙因素方差分析，同時采用正交多項式對混合比例的線性和二次響應結果進行評估。采用Duncan’s 檢驗法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 辣木葉和黃梁木葉的原料特性

新鮮辣木葉和黃梁木葉的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)組分和微生物數(shù)量的分析結果見表1。新鮮辣木葉和黃梁木葉的干物質(zhì)含量分別為21.73%、23.81%，蛋白質(zhì)含量分別為21.25%、11.45%，真蛋白比例分別為81.28%和88.91%，且兩種原料間以上指標存在極顯著差異（P＜0.01）。新鮮辣木葉和黃梁木葉的乳酸菌數(shù)量分別為3.93、4.14 lg CFU/g FM，大腸桿菌數(shù)量分別為4.30、4.80 lg CFU/g FM，酵母菌和霉菌數(shù)量均少于4.00 lg CFU/g FM。

表1 新鮮辣木葉和黃梁木葉的蛋白質(zhì)組分和微生物組成

2.2 辣木葉與黃梁木葉混貯的發(fā)酵品質(zhì)

辣木葉與黃梁木葉混貯的發(fā)酵特性參數(shù)如表2所示。隨著黃梁木葉含量的增加，混合青貯的干物質(zhì)含量隨之增加（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01）。在青貯發(fā)酵過程中，干物質(zhì)損失逐漸增加（D：P＜0.01）；與辣木葉青貯、黃梁木葉青貯相比，混合青貯的干物質(zhì)損失較?。═：P＜0.01；L：P＜0.01；Q：P＜0.01）。與辣木葉青貯相比，混合青貯3 d 的pH 較低，但隨后相對更高（D：P＜0.01），最終所有青貯飼料的pH 均低于4.20。隨著黃梁木葉含量的增加，混合青貯的乳酸菌數(shù)量、乳酸和乙酸含量逐漸降低（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01）。此外，與辣木葉青貯、黃梁木葉青貯相比，混合青貯的酵母菌和大腸桿菌的數(shù)量較多（T：P＜0.01）。

表2 不同比例辣木葉與黃梁木葉混貯的發(fā)酵特性

2.3 辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白質(zhì)組分

辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白質(zhì)含量及各組分比例見表3。隨著黃梁木葉含量的增加，混合青貯的蛋白質(zhì)含量、非蛋白氮比例和氨態(tài)氮比例均降低（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01），而真蛋白比例增加（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01）。在青貯發(fā)酵過程中，青貯飼料的真蛋白質(zhì)比例逐漸降低（D：P＜0.01），非蛋白氮比例和氨態(tài)氮比例增加（D：P＜0.01）。與辣木葉青貯相比，混合青貯和黃梁木葉青貯的氨態(tài)氮比例極顯著降低（T：P＜0.01）。

表3 不同比例辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白質(zhì)組分

2.4 辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白酶活性

辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白酶活性如表4 所示。在青貯發(fā)酵過程中，青貯飼料中的羧基肽酶、氨基肽酶和酸性蛋白酶的活性逐漸增強（D：P＜0.01），特別是在青貯發(fā)酵14 d以后。與辣木葉青貯相比，黃梁木葉青貯和混合青貯的三種蛋白酶的活性均較高（T：P＜0.01），并隨著黃梁木葉含量的增加，混合青貯的氨基肽酶和酸性蛋白酶的活性線性增加（T：P＜0.01；L：P＜0.01）。

表4 不同比例辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白酶活性(U/g DM)

2.5 辣木葉與黃梁木葉混貯的組合效應

辣木葉與黃梁木葉混貯在青貯發(fā)酵參數(shù)、蛋白組分和蛋白酶活性的組合效應指數(shù)如表5 所示。辣木葉與黃梁木葉混貯在青貯干物質(zhì)損失、乳酸和乙酸含量、非蛋白氮和氨態(tài)氮比例的單項組合效應指數(shù)均為負值，且不同比例混貯在干物質(zhì)損失和氨態(tài)氮比例的組合效應指數(shù)存在極顯著差異（P＜0.01）；25%、50%和75%黃梁木葉比例混貯的多項組合效應指數(shù)（負向）依次為-1.82、-1.47 和-2.68。辣木葉和黃梁木葉混貯在pH 和蛋白酶活性（氨基肽酶、羧基肽酶、酸性蛋白酶）的單項組合效應值上均為正值，且不同比例混貯的效應指數(shù)存在顯著差異（P＜0.05），不同比例混貯的多項組合效應指數(shù)（正向）依次為3.83、1.60 和0.49。

表5 辣木葉和黃梁木不同比例混貯的組合效應指數(shù)

3 討論

3.1 辣木葉和黃梁木葉的原料特性

在本研究中，辣木葉和黃梁木葉的干物質(zhì)含量遠低于優(yōu)良青貯飼料的理想干物質(zhì)含量（30%～35%），這可能不利于青貯生產(chǎn)[21]。研究表明，除了潛在的流出損失外，較高的水分會稀釋營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是水溶性碳水化合物的濃度，并有利于植物酶和梭狀芽孢桿菌等微生物的活動，抑制青貯pH 快速下降，最終導致顯著的營養(yǎng)損失和蛋白質(zhì)水解[14-15]。與真蛋白質(zhì)利用效率相比，反芻動物對非蛋白氮的利用效率相對較低，因此真蛋白質(zhì)比例可作為反映蛋白質(zhì)飼料質(zhì)量的一個簡單指標[14，22]。盡管辣木葉和黃梁木葉的粗蛋白含量相差較大，但它們均含有較高比例的真蛋白質(zhì)，這與He 等[14]和Wang 等[23]報告的數(shù)據(jù)一致。除營養(yǎng)組成外，附生微生物菌群是影響青貯發(fā)酵的另一個重要因素。研究顯示，青貯時乳酸菌初始數(shù)量大于5.0 lg CFU/g FM 是制作優(yōu)良青貯的必要條件[24]，因此，單獨青貯辣木葉或黃梁木葉的難度較大，特別是這兩種原料中大腸桿菌的數(shù)量多于乳酸菌。

3.2 辣木葉與黃梁木葉混貯的發(fā)酵品質(zhì)

混貯干物質(zhì)含量隨著黃梁木葉含量的增加而增加，因為黃梁木葉原料干物質(zhì)含量高于辣木葉。與辣木葉或黃梁木葉青貯相比，混合青貯的干物質(zhì)損失較小，這表明辣木葉和黃梁木葉青貯具有協(xié)同效應。鑒于水分是影響酶和微生物活性的關鍵因素，因此混貯可能在一定程度上有助于減少干物質(zhì)損失。Wang等[15]報道，混合黃梁木葉減少了柱花草青貯和苜蓿青貯的干物質(zhì)損失，可能得益于黃梁木葉的抗菌活性。本研究中所有青貯的最終pH 均低于優(yōu)良青貯的基準pH（4.20）[22]，說明辣木葉和黃梁木葉單獨或混合青貯都可以達到理想的pH。原料的含糖量、緩沖能力和細菌群落等因素差異都可能造成青貯pH 不同。青貯過程中pH 的下降由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸引起[14]，與黃梁木葉青貯相比，辣木葉青貯中的乳酸和乙酸含量都較高，這可能源于二者水溶性碳水化合物含量或抗菌活性的差異。本試驗中，混合青貯的酵母菌數(shù)量在青貯發(fā)酵的前14 d 有所增加，但在之后便下降到一個相當?shù)偷乃?。這可能與青貯初期的pH 較高和乙酸含量較低有關，乙酸是眾所周知的抗真菌劑，而較低的pH 條件有助于抑制微生物生長[25]。綜上所述，辣木葉與黃梁木葉混貯可能通過抑制細菌發(fā)酵來減少辣木葉和黃梁木葉青貯的干物質(zhì)損失。

3.3 辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白質(zhì)組分

青貯過程中的蛋白質(zhì)水解可以分為兩個階段，蛋白質(zhì)首先在植物蛋白酶作用下水解產(chǎn)生游離氨基酸和肽，接著在微生物的作用下進一步脫氨產(chǎn)生酰胺、胺和氨等產(chǎn)物[14,26]。在本研究中，由于辣木葉和黃梁木葉中粗蛋白含量的差異，混合青貯的粗蛋白含量隨著黃梁木葉含量的增加而降低。青貯過程中，辣木葉青貯的蛋白質(zhì)被大量水解，而黃梁木葉青貯的蛋白質(zhì)僅有少量被水解，與之前的研究一致[14]。這可能是因為黃梁木葉豐富的單寧對蛋白質(zhì)的保存起到幫助作用[15]。因此，隨著黃梁木葉含量的增加，混合青貯飼料中的真蛋白比例增加（最優(yōu)比例為75%），非蛋白氮比例顯著降低。這意味著，混合黃梁木葉可以提高辣木葉青貯的蛋白質(zhì)質(zhì)量，從而減少氮的排泄和對環(huán)境的影響。與非蛋白氮相比，氨態(tài)氮是更能反映氨基酸或多肽脫氨程度的指標[26]。由于氨態(tài)氮的利用效率低于真蛋白質(zhì)，且氨態(tài)氮含量過高會對動物采食量產(chǎn)生負面影響[27]，因此一般建議青貯氨態(tài)氮比例小于總氮10%，最好低于5%[28]。在本研究中，辣木葉青貯的氨態(tài)氮比例遠高于黃梁木葉青貯。這意味著，辣木葉青貯中參與氨態(tài)氮生成的微生物活性可能更強。即便如此，所有青貯飼料中的氨態(tài)氮比例處在較低的水平，這說明大部分非蛋白氮是多肽和游離氨基酸。綜上所述，將辣木葉與黃梁木葉混貯可以降低其非蛋白氮的含量并提高真蛋白質(zhì)含量，改善混合青貯中蛋白質(zhì)的保存。

3.4 辣木葉與黃梁木葉混貯的蛋白酶活性

從辣木葉青貯和黃梁木葉青貯的蛋白質(zhì)組分和蛋白酶活性的比較關系來看，蛋白酶活性的差異可能不是導致辣木葉青貯和黃梁木葉青貯的蛋白質(zhì)組分差異的主要影響因素。單寧結合導致的蛋白質(zhì)可及性降低可能是造成黃梁木葉青貯蛋白質(zhì)水解受限的原因。研究表明，黃梁木葉含有較高含量的可水解單寧（＞4% DM）和縮合單寧（＞6% DM）[11,15]，并且大多數(shù)可提取的縮合單寧會在青貯過程中轉化為蛋白質(zhì)結合或纖維結合的縮合單寧[29]。此外，酸性蛋白酶的活性遠高于羧基肽酶和氨基肽酶，這可能與它們最優(yōu)pH（4.5、7.0、7.0）的差異密切相關[14,30]。綜上所述，混合黃梁木葉可以改善辣木葉青貯飼料的蛋白質(zhì)組分，但這并不是主要通過抑制蛋白酶的活性而達到的，其原因有待進一步研究。此外，黃梁木葉這種蛋白質(zhì)保護作用可能會對動物體內(nèi)氮的利用產(chǎn)生影響，甚至對其他營養(yǎng)物質(zhì)的消化產(chǎn)生影響，值得繼續(xù)關注研究。

3.5 辣木葉與黃梁木葉混貯的組合效應

通常，我們根據(jù)發(fā)酵參數(shù)、養(yǎng)分保存的各項指標對青貯品質(zhì)優(yōu)劣進行評判，相對較好的青貯應該是有機酸含量較高而pH 較低，蛋白質(zhì)降解少（真蛋白比例高而氨態(tài)氮比例低），營養(yǎng)保存好而干物質(zhì)損失少。由于原料特性的差異，不同原料混合青貯可能存在正向或負向協(xié)同效應。本研究中，辣木葉與黃梁木葉混貯在青貯干物質(zhì)損失、乳酸和乙酸含量、非蛋白氮和氨態(tài)氮比例等指標上存在負向組合效應，尤其在干物質(zhì)損失和氨態(tài)氮比例，數(shù)值越低越好，基于這些指標的多項組合效應指數(shù)判斷，辣木葉與黃梁木葉混貯中黃梁木葉比例為75%時青貯效果較好。同時，辣木葉和黃梁木葉混貯在pH 和蛋白酶活性（氨基肽酶、羧基肽酶、酸性蛋白酶）存在正向組合效應，這4 個指標越低對青貯營養(yǎng)保存越有利，因此基于這些指標的多項組合效應指數(shù)判斷，多項組合效應指數(shù)較低的混貯質(zhì)量較好（黃梁木葉比例為75%的混貯）。綜上所述，基于組合效應指數(shù)評估，辣木葉與黃梁木葉混貯的最適比例為25∶75。

4 結論

本研究結果顯示，相對于辣木葉單獨青貯，辣木葉與黃梁木葉混貯降低了青貯的干物質(zhì)損失以及乳酸、乙酸、非蛋白氮和氨態(tài)氮含量，提高了氨基肽酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶活性，綜合評估以25∶75 比例混合效果最好。這些結果說明，辣木葉與黃梁木葉混貯有利于青貯過程中干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的保存，且這種組合效應可能是由于微生物活動受到抑制而非蛋白酶活性變化造成的。