骨髓增生異常綜合征患者血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)變化及其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

姜銘，徐娟，賁海祥，丁林林，尹紅

1 如皋市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇如皋226500；2 如皋市人民醫(yī)院血液內(nèi)科；3 南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液病研究室

骨髓增生異常綜合征（MDS）是起源于造血干細(xì)胞的一組異質(zhì)性髓系克隆性疾病，主要表現(xiàn)為病態(tài)造血或無效造血、難治性血細(xì)胞減少等。約30%MDS患者會進(jìn)展為急性髓系白血病［1］。近年來，盡管去甲基化、化療、免疫抑制劑、造血干細(xì)胞移植等治療手段不斷改進(jìn)，MDS的治療效果有所提升，但其預(yù)后依然較差，5年總體生存率仍不足30%［2］。迄今為止，MDS的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。微小核糖核酸（miRNA）是一類由20～24個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA分子，可與目標(biāo)mRNA結(jié)合并調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。miRNA異常表達(dá)能夠參與包括MDS在內(nèi)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-125b-5p屬于miR-125家族，定位于人11號染色體區(qū)域，是一種抑癌基因。有研究報道，miR-125b-5p可通過靶向抑制腫瘤蛋白D52表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［4］。miR-17-5p屬于miR-17家族，定位于人染色體13q31.3，是一種促癌基因。有研究報道，miR-17-5p可通過靶向抑制熱休克蛋白B2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［5］。但miR-125b-5p、miR-17-5p在MDS中作用的研究報道較少。鑒于此，本研究探討了MDS患者血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)變化及其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2020年1月如皋市人民醫(yī)院收治的MDS患者76例（觀察組）。MDS診斷依據(jù)《骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國專家共識（2014年版）》［7］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診；③入院前未接受任何抗腫瘤治療；④年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤等其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤者；②合并自身免疫性疾病者；③合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者；④合并嚴(yán)重神經(jīng)或精神疾病者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。其中，男52例、女24例，年齡53～77（68.12 ± 7.65）歲；WHO分型：病態(tài)造血（SLD）13例，多系病態(tài)造血（MLD）14例，難治性貧血（RA）18例，原始細(xì)胞增多（EB）21例，不能分類（U）10例；國際預(yù)后評分系統(tǒng)（IPSS-R）分級［6］：低危20例，中危23例，高危17例，極高危16例。同期選擇在如皋市人民醫(yī)院體檢健康的志愿者32例（對照組），男19例、女13例，年齡50～78（67.95 ± 7.02）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)如皋市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審批編號：KY20200161），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-125b-5p、miR-17-5p檢測 觀察組入組次日，對照組體檢當(dāng)日，采集空腹外周靜脈血3 mL，注入干燥試管中，待血液凝固后，3 204 × g離心5 min，留取上層血液，－80 ℃保存待測。采用TRIzol法提取血清總RNA，Multiskan SkyHigh微孔板分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按PrimeScript RT試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物序列設(shè)計由美國Thermo Fisher Scientific公司完成。引物序列：miR-125b-5p上游引物5′-TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3′、下游引物5′-AGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；miR-17-5p上游引物5′-TCTAGATCCCGAGGACTG-3′、下游引物5′-ATCGTGACCTGAACC-3′；β-actin上游引物5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′、下游引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。PCR反應(yīng)體系共50 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，獲取循環(huán)閾值（CT）。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.3 隨訪 MDS患者均接受化療（小劑量阿糖胞苷基礎(chǔ)上聯(lián)合阿克拉霉素或高三尖杉酯堿或去甲氧柔紅霉素）、支持對癥治療（輸血、血小板，粒細(xì)胞集落刺激因子升白細(xì)胞治療）等，完成足夠療程化療且無嚴(yán)重并發(fā)癥，病情平穩(wěn)后出院。出院后通過電話和門診復(fù)查形式定期隨訪3年，第1、2年每3個月隨訪一次，第3年每6個月隨訪一次。隨訪截至2023年1月。統(tǒng)計3年無進(jìn)展生存率和總體生存率。無進(jìn)展生存期定義為從開始治療至觀察到疾病進(jìn)展或因任何原因死亡的時間，總體生存期定義為從開始治療至因任何原因死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，結(jié)果比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)比較 觀察組血清miR-125b-5p、miR-17-5p相對表達(dá)量分別為1.02 ± 0.24、3.65 ± 1.24，對照組分別為2.97 ±0.75、1.52 ± 0.33。觀察組血清miR-125b-5p相對表達(dá)量低于對照組，血清miR-17-5p相對表達(dá)量高于對照組（t分別為20.425、9.552，P均<0.05）。

2.2 血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)與MDS患者臨床特征的關(guān)系 見表1。

表1 血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)與MDS患者臨床特征的關(guān)系（）

表1 血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)與MDS患者臨床特征的關(guān)系（）

臨床特征性別男女年齡≥65歲<65歲WHO分型SLD MLD RA EB U IPSS-R分級低危+中危高危+極高危n miR-125b-5p相對表達(dá)量P miR-17-5p相對表達(dá)量P F/t 1.0860.281 F/t 0.3260.746 52 24 1.00 ± 0.23 1.06 ± 0.21 3.69 ± 1.05 3.60 ± 1.26 1.3250.1890.4060.686 42 34 0.99 ± 0.25 1.06 ± 0.20 3.70 ± 1.09 3.59 ± 1.27 0.0540.9940.0040.996 13 14 18 21 10 1.02 ± 0.21 1.03 ± 0.22 1.01 ± 0.20 1.03 ± 0.19 1.00 ± 0.23 3.67 ± 1.21 3.66 ± 1.20 3.62 ± 1.20 3.65 ± 1.19 3.66 ± 1.18 13.862<0.0514.493<0.05 43 33 1.17 ± 0.10 0.82 ± 0.12 3.02 ± 0.53 4.43 ± 0.20

2.3 血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)與MDS患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪截至2023年1月，失訪3例，死亡33例，復(fù)發(fā)16例。以血清miR-125b-5p、miR-17-5p表達(dá)的均數(shù)為臨界值，將MDS患者分為血清miR-125b-5p低表達(dá)者（<1.02，39例）與血清miR-125b-5p高表達(dá)者（≥1.02，34例）、血清miR-17-5p低表達(dá)者（<3.65，35例）與血清miR-17-5p高表達(dá)者（≥3.65，38例）。血清miR-125b-5p低表達(dá)者與血清miR-125b-5p高表達(dá)者3年總體生存率分別為41.03%（16/39）、70.59%（24/34），3年無進(jìn)展生存率分別為17.95%（7/39）、50.00%（17/34）；血清miR-17-5p低表達(dá)者與血清miR-17-5p高表達(dá)者3年總體生存率分別為62.86%（22/35）、47.37%（18/38），3年無進(jìn)展生存率分別為42.86%（15/35）、23.68%（9/38）。血清miR-125b-5p低表達(dá)者3年總體生存率和3年無進(jìn)展生存率均低于血清miR-125b-5p高表達(dá)者（Log-rankχ2分別為5.815、12.030，P均<0.05），血清miR-17-5p低表達(dá)者3年總體生存率和3年無進(jìn)展生存率均高于血清miR-17-5p高表達(dá)者（Log-rankχ2分別為4.557、6.237，P均<0.05）。

3 討論

作為一種抑癌基因，miR-125b-5p在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療耐藥中發(fā)揮重要作用。在胰腺癌中，miR-125b-5p可通過抑制己糖激酶2、丙酮酸激酶肌肉同工酶2表達(dá)，阻止有氧糖酵解，降低葡萄糖發(fā)酵速率，進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖［8］。miR-125b-5p過表達(dá)可通過靶向黏附連接蛋白KIAA1522抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［9］。miR-125b-5p還可靶向己糖激酶2抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路，繼而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲［10］。miR-125b-5p與血液系統(tǒng)惡性腫瘤也存在一定關(guān)聯(lián)。有研究報道，miR-125b-5p在白血病細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-125b-5p表達(dá)可通過靶向抑制其下游靶標(biāo)人髓細(xì)胞白血病基因1，抑制白血病細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDS組血清miR-125b-5p相對表達(dá)量低于對照組；IPSS-R分級高危+極高危MDS患者血清miR-125b-5p表達(dá)低于IPSS-R分級低危+中危MDS患者；血清miR-125b-5p低表達(dá)者3年總體生存率和3年無進(jìn)展生存率均低于血清miR-125b-5p高表達(dá)者。提示miR-125b-5p能夠參與MDS的發(fā)生、發(fā)展。目前，miR-125b-5p參與MDS的分子機(jī)制尚不清楚。有研究認(rèn)為，Janus激活激酶2（JAK2）和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路激活促使細(xì)胞周期G0/G1期進(jìn)展，下調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)，增強(qiáng)MDS細(xì)胞的增殖活性［12］，而STAT3的3′-UTR區(qū)域存在miR-125b-5p的結(jié)合位點(diǎn)［13］，miR-125b-5p可通過抑制JAK2/STAT3信號通路，從而抑制MDS的發(fā)生、發(fā)展。因此，miR-125b-5p表達(dá)缺失可能促進(jìn)MDS的發(fā)生、發(fā)展并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

miR-17-5p可通過靶向抑制基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2促使基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［14］。miR-17-5p還可靶向抑制CADM2表達(dá)激活促腫瘤表型，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［15］。近年發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p還能參與血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究報道，miR-17-5p可通過調(diào)控BCL11B過表達(dá)誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDS組血清miR-17-5p相對表達(dá)量高于對照組；IPSS-R分級高危+極高危MDS患者血清miR-17-5p表達(dá)高于IPSS-R分級低危+中危MDS患者；血清miR-17-5p低表達(dá)者3年總體生存率和3年無進(jìn)展生存率均高于血清miR-17-5p高表達(dá)者。提示miR-17-5p能夠參與MDS的發(fā)生、發(fā)展。究其原因，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2表達(dá)缺失可激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促使S100鈣結(jié)合蛋白A9表達(dá)，誘導(dǎo)MDS向急性髓系白血病進(jìn)展，從而導(dǎo)致MDS患者預(yù)后不良［17］。SETD2是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p可負(fù)向調(diào)控SETD2表達(dá)，促使MDS細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［18］，最終導(dǎo)致MDS惡性進(jìn)展和預(yù)后不良。

綜上所述，MDS患者血清miR-125b-5p表達(dá)下調(diào)、血清miR-17-5p表達(dá)上調(diào)，二者表達(dá)變化與IPSS-R分級高危、極高危以及預(yù)后不良有關(guān)。