疏肝健脾益腸方對肝郁脾虛型銀屑病小鼠相關(guān)炎性細胞因子釋放的影響

張 華,鄭 露,2,劉 歡,周奕敏,涂 星*

1.湖北民族大學醫(yī)學部(湖北 恩施 445000) 2.武漢鋼鐵(集團)公司第二職工醫(yī)院康復科(湖北 武漢 430085)

銀屑病(psoriasis,PS)是一種病程較長,易反復發(fā)作,以紅斑、鱗屑等為主要臨床表現(xiàn)的慢性免疫介導型皮膚病,其主要癥狀為瘙癢和疼痛,常夜間加重,嚴重影響患者的睡眠質(zhì)量,從而給患者的身心健康和日常生活帶來極大影響[1-3]。促炎性細胞因子是血管內(nèi)皮細胞合成和釋放的可以激活炎癥反應的因子,如干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-23(IL-23)、白介素-17(IL-17)等,它們在細胞毒和局部炎癥相關(guān)免疫應答過程中起主要介導參與作用,能引起細胞免疫和遲發(fā)型超敏性炎癥,是PS發(fā)生的重要因素[4]。

古代醫(yī)家早期針對PS的致病因素和發(fā)病機制多從“外感風寒濕熱等邪氣所致”來認識,進一步發(fā)展成“臟腑病變、氣血失調(diào)等內(nèi)在病理機制與外感諸邪氣合而致病”,整體上緊密圍繞“血”與“風”兩大特點,如《醫(yī)宗金鑒》有云:“固有風邪客肌膚,亦有血燥難榮外”。近現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)長期科學研究以及豐富的臨床實踐經(jīng)驗,對PS病因病機有了進一步的深化拓展,其中“血分論治”PS最為常見,然而PS作為一個發(fā)病機制復雜的頑固性皮膚病,其中醫(yī)的辨證論治并非一成不變,需要結(jié)合患者具體病情辨證施治。針對部分患者由于體質(zhì)差異、病情階段、藥食影響等因素從血分論治效果不佳的情況,部分醫(yī)家提出以臟腑辨證為核心。如艾儒棣教授從脾胃論治,認為其病機是脾虛為本,濕毒為標[5]。在古今醫(yī)家理論研究基礎(chǔ)上,結(jié)合當今社會生活節(jié)奏的加快、現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)改變以及心理壓力等不良情緒增加等因素,本研究提出“肝郁脾虛”所引起的腸燥、腸虛、濕熱蘊藏等可能是PS發(fā)生的主要病機之一,而對于其治療,可相應采取疏肝健脾法以治其本,潤腸通便、補虛潤腸、清熱解毒等以治其標;通過探究疏肝健脾益腸方對調(diào)節(jié)肝郁脾虛型PS小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-23和IL-17水平變化,研究疏肝健脾益腸方對PS小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物40只雄性無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級昆明小鼠(kunming mice,KM小鼠),5～7周齡,體質(zhì)量18～22g,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2020-0001,質(zhì)量合格證編號:NO.210726210101125034。湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心,實驗室提供清潔級動物房,溫度20±2℃,相對濕度50%～70%。

1.2動物分組將KM小鼠適應性喂養(yǎng)1周后稱重,采用隨機數(shù)字表法將40只小鼠分為正常組、模型組、疏肝健脾益腸方高、中、低劑量組5組,每組8只。

1.3實驗藥品與試劑凡士林軟膏(南昌白云藥業(yè)有限公司,贛食藥準字F20050006);咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責任公司,國藥準字H20030129);脫毛膏[利潔時家化(中國)有限公司,國妝特字G20161330];冰醋酸(分析純,天津市福晨化學試劑廠,批號20160220);4%多聚甲醛(Biosharp Life sciences,批號1807231);二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司,批號20180607);石蠟(Leica Biosystems,批號1805139);蘇木素-伊紅(蘇州澤科生物技術(shù)有限公司,批號ZKP-E15006-1);ELISA試劑盒(武漢博士德有限公司);PBS(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);其他試劑均為分析純。

疏肝健脾益腸方煎液:由柴胡、當歸、白芍、白術(shù)(麩炒)、茯苓、防風、砂仁、木香、甘草(蜜炙)、黨參、黃芪、生地黃、蟬蛻、地膚子組成,均購于湖北強康中藥飲片有限公司,生藥140g。首次煎熬1.5h,加1100mL水,第二次煎熬0.5h加420mL,將兩次煎液混合,濾過后,經(jīng)減壓濃縮,最終濃縮至含有生藥2.8g/mL的藥液。

1.4主要實驗儀器XSR105/AC電子分析天平(梅特勒公司),Mili-Q Direct-Q5UV超純水機(美國密理博公司),KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);S1200 Smartpipette型全自動移液器(量程50～1200μL,Ronlabs公司),制冰機(上?；蕛x器有限公司);TC-120型智能程控生物組織自動脫水機(泰維科技實業(yè)股份有限公司);TB-718E型生物組織自動包埋機(泰維科技實業(yè)股份有限公司);R139型輪轉(zhuǎn)式切片機(泰維科技實業(yè)股份有限公司);TK-218Ⅱ型攤片機(泰維科技實業(yè)股份有限公司);BX53型偏光顯微鏡(奧林巴斯);5810R高速冷凍離心機(Eppendorf公司);酶標定量測定儀(Thermo Scientific公司);海爾立式超低溫冰箱等。

1.5肝郁脾虛型PS小鼠模型的建立與評價根據(jù)文獻[6]采用5%咪喹莫特乳膏涂抹誘導PS。正常組小鼠每日口服蒸餾水,模型組及疏肝健脾益腸方組小鼠每日口服醋酸(0.03mol/L冰醋酸),同時使用膠帶進行束縛應激操作;7d后,用脫毛膏在各組小鼠背部脫毛,暴露2cm×2cm的無毛區(qū),脫毛后正常組小鼠每日繼續(xù)口服蒸餾水,并配合背部無毛區(qū)均勻涂抹凡士林軟膏62.5mg,1次/d,模型組及疏肝健脾益腸方組小鼠每日繼續(xù)醋酸口服刺激(0.03mol/L冰醋酸)及膠帶束縛應激,同時背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg,1次/d,連續(xù)14d,共21d,進行束縛應激和口服醋酸刺激操作開始,進行小鼠中醫(yī)證候特征評價,分值越低表明肝郁脾虛證候特征越明顯(表1)。自抹藥開始,采用PASI評分[7]進行評估,以小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、浸潤改變表明PS造模成功。觀察指標及評分細則見表2。

表1 小鼠的行為觀察指標

表2 PASI評分

1.6實驗動物治療造模結(jié)束后,正常組、模型組各自用蒸餾水0.1mL/10g灌胃,疏肝健脾益腸方高、中、低劑量組則依次按照17.6、8.8、4.4mL/kg的劑量給予疏肝健脾益腸方煎液灌胃,1次/d,連用21d,小鼠給藥劑量根據(jù)《中藥藥理研究方法學》[8]中人與小鼠體表面積比例進行換算。

1.7各組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17含量末次給藥24h后,對各組小鼠進行眼球取血,將血液放入抗凝管中,經(jīng)離心分離后,將上清液裝入-80℃冰箱中備用,采用ELISA法檢測IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-23、IL-17在血清中的含量,詳細操作參考ELISA試劑盒。

1.8皮膚組織病理切片觀察末次給藥24h后,采取頸椎脫臼法處死小鼠后取小鼠無毛區(qū)皮膚組織浸泡于4%多聚甲醛固定,脫水,用石蠟加以包埋,切片,使用常規(guī)HE染色,最后在光學顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚組織的病理學特征。

2 結(jié)果

2.1肝郁脾虛型PS小鼠皮損的形態(tài)學變化造模前,觀察各組小鼠的皮膚損傷情況,其PASI評分都為0。由表3可知,除了正常組之外,使用5%咪喹莫特涂抹小鼠背部表皮后,會導致不同程度的紅斑、鱗屑和浸潤等現(xiàn)象,小鼠PASI評分提高(P<0.05);疏肝健脾益腸組給藥后小鼠背部的紅斑、鱗屑、浸潤等皮損情況好轉(zhuǎn),PASI評分下降,但同時模型組的小鼠皮損情況好轉(zhuǎn),考慮為小鼠的自愈性所致;小鼠PASI評分情況來看,無法判斷疏肝健脾益腸方的劑量是否與PS的治療有劑量依賴,見表3。

表3 疏肝健脾益腸方對各組小鼠皮膚PASI評分的影響分)

2.2皮損組織病理變化正常組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完好,表皮和真皮分界清晰,角質(zhì)層較薄,顆粒層清晰;模型組小鼠表皮顯著增厚,可見不同程度的角質(zhì)層增生伴有角化不完全,表皮突起明顯下延,棘層增厚,顆粒層變薄;高、中、低劑量組小鼠皮膚病理變化和模型組類似,但是表皮增厚、角化不全、棘層增厚、顆粒層變薄等都比模型組要輕,特別是高劑量組的皮膚病理改善最為顯著,見圖1。

A:正常組;B:模型組;C:高劑量組;D:中劑量組;E:低劑量組。圖1 小鼠皮膚組織病理切片圖(HE,×200)

2.3血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17含量的變化與正常組比較,PS模型小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17的含量均顯著上升(P<0.05);與模型組相比,疏肝健脾益腸方高、中、低劑量組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17含量均顯著下降(P<0.05);與疏肝健脾益腸方高劑量組相比,中、低劑量組IFN-γ的含量明顯升高,且中劑量組降低IFN-γ的含量較低劑量組更為顯著(P<0.05);與疏肝健脾益腸方低劑量組相比,高、中劑量組的IL-23及IL-17含量下降效果優(yōu)于低劑量組(P<0.05),見表4。

表4 各組小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17檢測結(jié)果的影響

3 討論

PS是一種典型的皮膚病癥,其特點是過度增殖的角質(zhì)形成細胞,這些細胞是在表皮占比最多的細胞類型,可以感知病原體并介導免疫反應,在皮膚暴露于抗原后,角質(zhì)形成細胞中炎癥小體復合物中所含的細胞內(nèi)傳感器被激活,促進炎癥因子的產(chǎn)生,進而活化免疫細胞,從而誘導和維持炎癥反應[9]。目前已知,TNF-α、IFN-γ和IL-23/Th17細胞等相關(guān)的細胞因子和通路在PS發(fā)病機制中扮演著至關(guān)重要的角色[10]。TNF-α是一種擁有廣泛生物活性的細胞因子,它參與了人體的免疫反應,并能加速PS的炎癥反應以及表皮細胞的增殖[11]。IFN-γ主要來源于T細胞和NK細胞,它參與并維持PS的炎性浸潤,是引起角質(zhì)形成細胞異常增殖的主要因素,并參與了T細胞向表皮的增殖[12]。Th17及與之有關(guān)的細胞因子在PS的發(fā)病中起著重要作用,在PS患者的血液中,Th17及它的下游效應因子IL-17A、IL-17F和TNF-α等均有明顯升高[13]。IL-23能促進Th17細胞產(chǎn)生大量的炎性因子IL-17,IL-17能誘導促炎細胞因子(IL-6、TNF-α等)以及相關(guān)細胞因子的表達,導致炎性細胞的浸潤,促進皮損的形成和發(fā)展,從而導致PS[14]。

在記載了中國傳統(tǒng)醫(yī)學的相關(guān)古代典籍中,關(guān)于PS病名,目前尚沒有具體的描述,因其“膚如疹疥,色白而癢,搔起白皮”,多稱其為“白疕”。而關(guān)于PS的病因病機,部分醫(yī)家認為“肝郁脾虛”是PS的主要病機之一,其發(fā)生可能與腸燥、腸虛、腸道濕熱等有關(guān)。肝和脾在生理上相互為用,在病理上相互影響。肝主藏血,其藏血功能失?？赡軐е職庋Ш?肌膚失養(yǎng);肝主疏泄,情志所傷導致肝氣郁結(jié),日久肝郁化火橫逆犯胃,陰津受損,易致腸道干燥,故PS皮膚多干燥、瘙癢。脾為后天之本、氣血生化之源,脾主升清,盛津液,行水濕。肝氣郁結(jié)易致脾虛,脾虛易致小腸受盛化物能力下降,導致腸道虛弱,脾虛生痰,故臨床上患者皮損多見白色鱗屑肥厚等痰濕之象;痰濕郁久化熱,易致大腸濕熱,濕熱蘊阻肌膚,郁滯氣血,故PS多表現(xiàn)紅斑癥狀。疏肝健脾益腸方對于PS,尤其是肝郁脾虛腸燥型有良好的療效,可緩解瘙癢、減輕患者的皮膚損傷程度,對于脾虛、腸燥、便秘等臨床癥狀有一定的改善作用。因此,采用疏肝健脾益腸方對PS加以治療,其療效是肯定的。

在本研究中,肝郁脾虛型PS模型小鼠血清中促炎性細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17的含量顯著增加(P<0.05),給予疏肝健脾益腸方后,血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17含量均顯著下降(P<0.05),表明疏肝健脾益腸方可以抑制血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17的表達,并且可能與疏肝健脾益腸方的給藥濃度有關(guān)。病理結(jié)果顯示相同結(jié)果,表明疏肝健脾益腸方能夠有效地抑制PS角質(zhì)形成細胞過度的增殖、分化及炎癥細胞浸潤,從而減輕皮膚的炎癥反應,進而達到治療PS的目的。在未來的臨床研究中,將會不斷地探索疏肝健脾益腸方治療肝郁脾虛型PS的作用機制,以期為臨床提供安全、可靠、療效確切、經(jīng)濟的治療PS的藥物。