α-硫辛酸對藍(lán)光誘導(dǎo)損傷的ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用△

余洋洋 周文杰 俞永珍 章夢一 程天豪 鄒秀蘭 鄒玉平

藍(lán)光為400～500 nm的短波長可見光[1]。已有證據(jù)證明短波長藍(lán)光對視網(wǎng)膜具有更大的光毒性[2]。年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種由于黃斑退化而導(dǎo)致視力喪失的眼科疾病,它最常發(fā)生在50歲以上的人群中。在早期階段,視力障礙程度并不嚴(yán)重,但中心視力逐漸喪失,影響日常生活[3]。有研究表明,暴露在藍(lán)光下可能會導(dǎo)致 AMD 或其他視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[4]。α-硫辛酸(ALA)是一種作用強(qiáng)大而廣泛的抗氧化劑[5],它除了直接的抗氧化作用以外,對于其他抗氧化劑如維生素C、D及輔酶Q10的抗氧化效應(yīng)也具有加強(qiáng)作用,臨床已廣泛用于治療和預(yù)防心臟病、糖尿病等多種疾病。本研究擬通過觀察ALA對藍(lán)光誘導(dǎo)損傷的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)的保護(hù)作用,為藍(lán)光所致視網(wǎng)膜光損傷的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

ARPE-19細(xì)胞(廣州萊賽生物科技有限公司);胎牛血清(FBS,以色列Bioind公司)、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、CCK-8試劑盒(上海東仁化學(xué)科技有限公司),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(愛必信上海生物科技有限公司),活性氧(ROS)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。低溫高速離心機(jī)(廣州火元醫(yī)療器械有限公司),酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技有限公司),FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞檢測儀(美國BD公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(澳大利亞Corbett Life Science公司),微量核酸定量儀(北京天根生化科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制

ALA溶解于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的培養(yǎng)基中,使溶解于培養(yǎng)基后的ALA終濃度為150 μmol·L-1,保存在4 ℃冰箱中。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ARPE-19細(xì)胞放置在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中,用已配制的新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%FBS及10 g·L-1雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別按每孔約4 000個和5×106個的細(xì)胞密度接種于96孔板和6孔板中,接種體積分別為0.2 mL和2.0 mL;置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。在培養(yǎng)過程中,倒置顯微鏡下觀察,選生長狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行分組處理。

1.2.3 細(xì)胞分組

藍(lán)光(456 nm)照射ARPE-19細(xì)胞損傷模型造模方法參考課題組前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)[6-8],選定藍(lán)光照射ARPE-19細(xì)胞時(shí)間為12 h。實(shí)驗(yàn)分為4組,正常組(N組): 體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞;藥物組(D組):含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、10 g·L-1雙抗、ALA(藥物終濃度為150 μmol·L-1)的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞36 h;光照組(L組):含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、10 g·L-1雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞,并使用光照強(qiáng)度為1×104lx的LED燈藍(lán)光照射12 h;藥物+光照組(D+L組):先將體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行D組處理后,再使用光照強(qiáng)度為1×104lx的LED燈藍(lán)光照射12 h。

1.2.4 構(gòu)建ARPE-19細(xì)胞光損傷模型

將3～6代ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞板,光照在培養(yǎng)箱內(nèi)密閉進(jìn)行,無自然光干擾。以自制藍(lán)光LED作為光源,懸空于細(xì)胞之上10 cm處,采取直落式照射。用多光源照度計(jì)(中國德力西公司)測量細(xì)胞生長平面光照強(qiáng)度。已有研究證實(shí),光照強(qiáng)度為1×104lx,照射細(xì)胞12 h即可產(chǎn)生細(xì)胞光損傷[9]。光照時(shí),細(xì)胞平面的溫度變化控制在 36.5～37.5 ℃,排除溫度升高引起細(xì)胞光熱損傷的可能。

1.2.5 倒置顯微鏡下觀察ARPE-19細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

取對數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞,胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液,于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。造模結(jié)束后,倒置顯微鏡下觀察N組、D組、L組及D+L組細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

取ARPE-19細(xì)胞消化、離心,以每孔4×103個細(xì)胞接種于96孔板上,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。在細(xì)胞貼壁生長后棄上清,換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中孵育過夜,使細(xì)胞同步化。各組造模結(jié)束后終止培養(yǎng),每孔加入10 μL CCK-8溶液+90 μL DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中孵育2 h。96孔板,每組5個復(fù)孔,同時(shí)設(shè)立空白組(即96孔板中的無細(xì)胞的孔),酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度(OD),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。計(jì)算數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞存活率圖,細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD正常對照組-OD空白組)×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

Annexin V-FITC/PI雙染色法測定細(xì)胞凋亡率。ARPE-19細(xì)胞經(jīng)PBS清洗,胰蛋白酶消化液消化后,按每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板上,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清,PBS洗滌,加入適量胰蛋白酶消化液消化,2 min后加入相同體積培養(yǎng)基終止消化,將細(xì)胞懸液移入相應(yīng)離心管中,1 200 r·min-1離心5 min,棄上清,用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取8×104個細(xì)胞,1 200 r·min-1離心5 min后,棄上清,此步驟重復(fù)2次;將細(xì)胞懸浮于400 μL Annexin V結(jié)合液中,避光加入5 μL FITC,4 ℃ 放置15 min;上機(jī)前5 min避光加10 μL PI,在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.8 倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞ROS水平

取對數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞,按每孔5×103個細(xì)胞接種于48孔板上,待細(xì)胞貼壁后分組造模。按ROS檢測試劑盒操作說明檢測各組細(xì)胞ROS水平。造模完成后,棄上清,每孔加入120 μL 2 μmol·L-1DCFH-DA,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,棄DCFH-DA,無血清培養(yǎng)基洗滌2遍,加入100 μL PBS,倒置熒光顯微鏡下檢測ROS水平。設(shè)置倒置熒光顯微鏡激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。

1.2.9 RT-qPCR檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)

應(yīng)用Trizol試劑提取經(jīng)過不同處理后各組 ARPE-19細(xì)胞總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒行RT-qPCR檢測,所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。設(shè)定PCR程序:95 ℃ 預(yù)變性10 min,95 ℃ 10 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 35 s,擴(kuò)增40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)水平。用β-actin作為內(nèi)源對照,檢測ARPE-19細(xì)胞核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、NAD(P)H：醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素氧合酶-1(HO-1) mRNA轉(zhuǎn)錄水平;Nrf2上下游引物序列分別為:5’-TTCTGTTGCTCAGGTAGCCCC-3’,5’-TCAGTTTGGCTTCTGGACTTGG-3’;GST上下游引物序列分別為:5’-ACTTCATCTCCCGCTTTGTG-3’,5’-AGGTCTTGCCTCCCTGGT-3’;NQO1上下游引物序列分別為:5’-TATCCTGCCGAGTCTGTTCTG-3’,5’-ACTGGAATATCACAAGGTCTGC-3’;HO-1上下游引物序列分別為:5’-CCAGCGGGCCAGCAACAAAGTGC-3’,5’-AAGCCTTCAGTGCCCACGGTAAGG- 3’;β-actin上下游引物序列分別為:5’-CCACACCTTCTACAATGAGC-3’,5’-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3’。

1.2.10 Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞造模完成后,向各組細(xì)胞加入適量的蛋白裂解液(含PMSF),冰上裂解30 min,將細(xì)胞裂解液移入EP管中,4 ℃離心15 min,采用BCA法對樣品進(jìn)行蛋白定量檢測。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5 g·L-1脫脂奶粉室溫下封閉1 h,加入兔抗細(xì)胞天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)或兔抗Nrf2或兔抗NQO-1一抗于4 ℃過夜,二抗室溫孵育2 h,以β-actin作為內(nèi)參。暗室下加發(fā)光液并進(jìn)行曝光。采用ImageJ軟件測定ARPE-19、Caspase-3、Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組ARPE-19細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

N組及D組細(xì)胞均呈貼壁生長,分布均勻,形態(tài)清晰;與N組相比,L組細(xì)胞皺縮、變小、變圓,失去正常形態(tài),部分細(xì)胞不能貼壁生長;與L組相比,D+L組細(xì)胞形態(tài)改善,大部分細(xì)胞呈梭形貼壁生長,細(xì)胞輪廓較清晰,小部分細(xì)胞失去正常形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

N組、D組、L組、D+L組細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與N組相比,D組細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05);與N組相比,L組細(xì)胞存活率降低(P<0.05);與L組相比,D+L組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組APRE-19細(xì)胞存活率、凋亡率、ROS水平

2.3 ALA對藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡率的影響

D組與N組ARPE-19細(xì)胞形態(tài)無差異,細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),證明藥物ALA對ARPE-19細(xì)胞無損傷作用。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中僅設(shè)立N組、L組和D+L組。N組、L組和D+L組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與N組相比,L組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與L組相比,D+L組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)(表1、圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

2.4 倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞ROS水平

N組、L組和D+L組細(xì)胞ROS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與N組相比,L組細(xì)胞ROS水平升高(P<0.05);與L組相比,D+L組細(xì)胞ROS水平降低(P<0.05)(表1、圖3)。

圖3 倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞ROS水平

2.5 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞mRNA表達(dá)

N組、L組和D+L組3組細(xì)胞間Nrf2、GST、NQO-1、HO-1的mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與N組相比,L組細(xì)胞NQO-1、HO-1的mRNA相對表達(dá)量均升高(均為P<0.05),Nrf2、GST的mRNA相對表達(dá)量均有所升高,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05);與L組相比,D+L組細(xì)胞Nrf2、GST、NQO-1、HO-1的mRNA相對表達(dá)量均升高(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組ARPE-19細(xì)胞Nrf2 、GST、NQO-1、HO-1的mRNA相對表達(dá)量

2.6 Western blot檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá)

N組、L組和D+L組3組細(xì)胞間Caspase-3、Nrf2、NQO-1蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與N組相比,L組細(xì)胞Caspase-3、Nrf2蛋白相對表達(dá)量均升高(均為P<0.05);與L組相比,D+L組細(xì)胞Caspase-3蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05), Nrf2、NQO-1蛋白相對表達(dá)量均升高(均為P<0.05) (圖4、表3)。

表3 各組ARPE-19細(xì)胞Caspase-3、Nrf2、NQO-1蛋白相對表達(dá)量

圖4 各組ARPE-19細(xì)胞Caspase-3、Nrf2、NQO-1蛋白表達(dá)情況

3 討論

日常生活中常見的短波長高強(qiáng)度藍(lán)光,可穿透角膜和晶狀體直接到達(dá)視網(wǎng)膜,對視網(wǎng)膜造成光化學(xué)損傷[10]。其中,光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞最受關(guān)注,主要是因?yàn)檫@些細(xì)胞類型能夠表達(dá)吸收藍(lán)光的光敏劑,從而對視網(wǎng)膜造成損傷[11]。因此,本研究中選用ARPE-19細(xì)胞作為研究對象,以藍(lán)光(456 nm)損傷ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行造模研究藥物ALA的保護(hù)作用。

本研究中D組采用150 μmol·L-1ALA孵育ARPE-19細(xì)胞36 h后,其細(xì)胞形態(tài)和存活率與N組相比均未發(fā)生明顯變化,此結(jié)果與Jia等[12]研究結(jié)果一致,證明ALA對ARPE-19細(xì)胞無毒副作用。在此基礎(chǔ)上,后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅檢測N組、L組以及D+L組,進(jìn)一步研究ALA的保護(hù)性作用。我們觀察到與N組相比,L組ARPE-19細(xì)胞在藍(lán)光照射后失去正常形態(tài),細(xì)胞存活率下降,細(xì)胞凋亡率和ROS水平明顯上升,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[13]中藍(lán)光損傷模型指標(biāo),說明我們采取的造模方法效果達(dá)到預(yù)期。與L組相比,D+L組添加了ALA的ARPE-19細(xì)胞再次暴露在藍(lán)光下,細(xì)胞形態(tài)明顯改善,大部分細(xì)胞呈梭形貼壁生長,細(xì)胞輪廓較清晰,僅小部分細(xì)胞失去正常形態(tài)結(jié)構(gòu),細(xì)胞的存活率明顯提高,凋亡率與ROS水平降低。以上結(jié)果表明,ALA能夠有效保護(hù)ARPE-19免受藍(lán)光損傷。

視網(wǎng)膜細(xì)胞中含有吸收接近藍(lán)光(400～500 nm)的發(fā)色團(tuán),其與藍(lán)光相互作用后產(chǎn)生大量的ROS[4]。Pilat等[14]研究結(jié)果表明,藍(lán)光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可上調(diào)抗氧化酶HO-1的表達(dá),表明視網(wǎng)膜細(xì)胞對于藍(lán)光損傷存在保護(hù)應(yīng)答機(jī)制。本研究進(jìn)一步進(jìn)行RT-qPCR檢測和Western blot檢測,結(jié)果顯示,L組細(xì)胞抗氧化酶NQO-1、HO-1 mRNA相對表達(dá)量以及Nrf2蛋白相對表達(dá)量均較N組有所上升,表明ARPE-19細(xì)胞對藍(lán)光照射產(chǎn)生的氧化應(yīng)激起保護(hù)作用,這與上述研究結(jié)果相符。與N組相比,L組ARPE-19細(xì)胞存活率下降、ROS水平升高、凋亡蛋白Caspase-3相對表達(dá)量增多,推測為ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)應(yīng)答機(jī)制不足以應(yīng)對藍(lán)光照射所造成的氧化應(yīng)激損傷;而與L組相比,添加了ALA的D+L組ARPE-19細(xì)胞再次暴露在藍(lán)光下照射時(shí),細(xì)胞存活率得到明顯提高,Nrf2、GST、NQO1、HO-1 mRNA相對表達(dá)量和保護(hù)性蛋白Nrf2、NQO-1相對表達(dá)量均明顯升高,Caspase-3蛋白表達(dá)相對量明顯下降,我們推測ALA通過促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)應(yīng)答機(jī)制進(jìn)而提高ARPE-19細(xì)胞對藍(lán)光照射的防護(hù)能力。

Nrf2作為內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路的信號分子,在氧化應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[15]。靜息狀態(tài)下,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1結(jié)合,經(jīng)泛素化-蛋白酶體降解。氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2被活化,從Keap1中釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)節(jié)多種抗氧化酶及保護(hù)性蛋白如GST、NQO1、HO-1等的表達(dá)水平,提高 SOD 等抗氧化酶表達(dá)水平,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的平衡狀態(tài)的同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡[16]。在其他領(lǐng)域已有研究表明,ALA通過激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化作用,抑制甲氨蝶呤誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞活化[17]。說明ALA可能通過Nrf2相關(guān)的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路發(fā)揮對藍(lán)光損傷ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用,下一步擬行相關(guān)研究。

4 結(jié)論

藍(lán)光會導(dǎo)致ARPEA-19細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,而ALA能夠增強(qiáng)ARPE-19細(xì)胞對藍(lán)光損傷的抗氧化保護(hù)作用。本研究為藍(lán)光所致視網(wǎng)膜光損傷的防護(hù)措施研發(fā)提供了新思路。