紫外光/核黃素-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯交聯(lián)方案對(duì)兔眼角膜基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維的影響△

魏升升 李 晶 張耀花 蔡 艷 杜 婧 高金榮 劉建國(guó) 李 娟 李 勇

角膜膠原交聯(lián)手術(shù)是利用核黃素在紫外光的作用下,被激發(fā)到三線態(tài),從而產(chǎn)生以單線態(tài)氧為主的活性氧族,活性氧族可以誘導(dǎo)相鄰膠原纖維的氨基間發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng),形成新的共價(jià)鍵,從而增加了膠原纖維的機(jī)械強(qiáng)度和抵抗角膜擴(kuò)張的能力,使角膜形態(tài)更加穩(wěn)固。目前,角膜膠原交聯(lián)手術(shù)已成為擴(kuò)張性角膜疾病的主要治療方法。標(biāo)準(zhǔn)的“Dresden”交聯(lián)方案是在去除患者角膜上皮后用1g·L-1的核黃素溶液浸泡角膜組織 30 min[1];然后用光照度為3 mW·cm-2、光束直徑為9 mm 、波長(zhǎng)為370 nm 的紫外光照射角膜30 min;照射總能量為 5.4J·cm-2。由于“Dresden”交聯(lián)方案手術(shù)時(shí)間長(zhǎng),對(duì)患者角膜厚度要求較高,所以Rubinfeld等[2]采用核黃素-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(Ribocross?IROMED Group,意大利)進(jìn)行交聯(lián),該方案可以對(duì)保留上皮的薄角膜進(jìn)行個(gè)性化的交聯(lián),也稱為個(gè)性化快速角膜膠原交聯(lián)手術(shù)(Custom Fast-Corneal Cross-Linking,CF-CXL),該方案在臨床試驗(yàn)方面取得了較好的療效[3-4]。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)于CF-CXL手術(shù)療效及術(shù)后個(gè)體角膜變化的基礎(chǔ)研究較少。本研究通過(guò)對(duì)活體兔眼角膜進(jìn)行CF-CXL,觀察術(shù)后不同時(shí)間兔眼角膜透明度、超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維的變化,分析CF-CXL 對(duì)兔眼角膜基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取15只10～15周齡SPF級(jí)新西蘭大白兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),體重 2.5～3.0 kg,雌雄不限。所有動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng),并保持健康,無(wú)臨床可觀察到的眼病。所有動(dòng)物右眼作為實(shí)驗(yàn)眼,均行CF-CXL,左眼作為對(duì)照眼。手術(shù)過(guò)程中均肌肉注射5 mg·kg-1鹽酸噻嗪(Sigma Chemicals.,澳大利亞)和 50 mg·kg-1鹽酸氯胺酮(Sigma-Aldrich.,美國(guó))進(jìn)行麻醉。術(shù)后,局部使用 3 g·L-1左氧氟沙星滴眼液(Santen,Inc.,日本)控制感染。術(shù)后 1 周、1 個(gè)月和 3個(gè)月,分別隨機(jī)選取5只兔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(Pure Chemistry Scientific Inc.,美國(guó))處死,取中央?yún)^(qū)角膜進(jìn)行透射電鏡檢查。該研究經(jīng)西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)倫理委員會(huì)論證,符合視覺(jué)和眼科研究協(xié)會(huì)聲明中關(guān)于在眼科研究中使用動(dòng)物的指導(dǎo)方針,遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例。

1.1.2 儀器與設(shè)備

顯微手術(shù)器械、裂隙燈顯微鏡(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司),眼前節(jié)OCT(德國(guó) Carl Zeiss 公司),透射電鏡(日本日立HITACHI公司)。

1.2 方法

1.2.1 CF-CXL方法

使用CF-CXL手術(shù)設(shè)備CF-X Linker(IROMED Group S.R.L.,意大利)對(duì)兔右眼行CF-CXL。手術(shù)前使用奧布卡因滴眼液(Benoxil,Santen,Inc.,日本)進(jìn)行表面麻醉。采用低負(fù)壓核黃素浸泡槽吸附到兔角膜表面,將含有 1 g·L-1核黃素、5 g·L-1維生素E聚乙二醇琥珀酸酯和100 g·L-1葡聚糖的等滲溶液(Ribocross?IROMED Group,意大利)注射入核黃素浸泡槽內(nèi),持續(xù)浸泡15 min。然后,用平衡鹽溶液反復(fù)沖洗手術(shù)眼以去除角膜表面核黃素薄膜。采用 CF-X Linker設(shè)備進(jìn)行紫外光照射,照射區(qū)域直徑為7 mm,紫外光照度為(1.8±0.9)mW·cm-2,持續(xù)照射時(shí)間為 10 min,總能量密度為(1.08±0.6)J·cm-2,照射模式為脈沖式,照射期間于角膜表面每 20 s滴平衡鹽溶液1次。照射結(jié)束后,局部使用 3 g·L-1左氧氟沙星滴眼液(Santen,Inc.,日本)和1 g·L-1氟米龍滴眼液(Santen,Inc.,日本)1周,控制角膜感染和炎癥反應(yīng)。

1.2.2 裂隙燈及眼前節(jié)OCT檢查

在術(shù)前和術(shù)后 1 周、1個(gè)月 和 3個(gè)月對(duì)實(shí)驗(yàn)眼和對(duì)照眼角膜組織進(jìn)行裂隙燈顯微鏡和眼前節(jié)OCT檢查,觀察角膜的透明度、角膜厚度以及角膜膠原交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的深度。

1.2.3 透射電鏡檢查

在術(shù)后不同時(shí)間,取角膜中央3 mm區(qū)域組織,浸泡在體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中固定。再放入 4 ℃ 0.1 mmol·L-1二甲基胂酸鹽(pH 7.3)中,經(jīng)過(guò)幾次緩沖液沖洗后,用 1 g·L-1四氧化鋨固定,在梯度乙醇系列(體積分?jǐn)?shù)50%到100%)和體積分?jǐn)?shù)100%丙酮中進(jìn)行組織脫水。在丙酮和TAAB 031樹(shù)脂的混合物中浸泡8 h,在純TAAB 031樹(shù)脂中浸泡8 h(3次),在60 ℃的純TAAB 031樹(shù)脂中聚合12 h。隨后使用超薄切片機(jī)獲得50～80 nm 厚度的半薄和超薄切片,把這些切片收集在銅網(wǎng)格上。 將切片用20 g·L-1乙酸雙氧鈾和20 g·L-1檸檬酸鉛溶液染色,并用透射電鏡進(jìn)行觀察。圖像的數(shù)字記錄使用Mega 視圖數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)處理。每個(gè)組織切片使用3張圖像進(jìn)行定量分析。采用角膜膠原纖維橫截面面積來(lái)評(píng)估膠原纖維的變化,避免因?yàn)槟z原纖維的不規(guī)則引起的直徑測(cè)量誤差。使用ImageJ圖像處理軟件測(cè)量膠原纖維橫截面面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)眼角膜術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察結(jié)果

裂隙燈顯微鏡下觀察可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后1周組、1個(gè)月組和3個(gè)月組角膜均保持透明,無(wú)角膜上皮損傷、角膜上皮下霧狀混濁以及角膜瘢痕發(fā)生。

2.2 實(shí)驗(yàn)眼OCT檢測(cè)結(jié)果

眼前節(jié)OCT檢測(cè)結(jié)果顯示,與術(shù)前相比,實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后1周組中央角膜厚度變薄,術(shù)后1個(gè)月組和3個(gè)月組變化不大。實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后1個(gè)月組和3個(gè)月組可見(jiàn)角膜基質(zhì)纖維板層有高反光表現(xiàn),這可能與膠原纖維交聯(lián)發(fā)生后纖維板層排列不規(guī)則有關(guān)(圖1)。

A:術(shù)前;B:術(shù)后1周組;C:術(shù)后1個(gè)月組;D:術(shù)后3個(gè)月組。圖1 實(shí)驗(yàn)眼角膜OCT檢測(cè)結(jié)果

2.3 實(shí)驗(yàn)眼透射電鏡檢查結(jié)果

透射電鏡檢查結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后不同時(shí)間組均可見(jiàn)角膜基質(zhì)中橫行、縱行、斜行的膠原纖維板層分布,膠原纖維板層之間角膜基質(zhì)細(xì)胞填充(圖2A);角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)散在分布的膠原原纖維(圖2B);在膠原纖維的縱切面中,纖維周邊可見(jiàn)錯(cuò)綜分布的蛋白多糖裝飾(圖2C);膠原纖維的橫切面可用于計(jì)算纖維的橫截面面積(圖2D)。

A:平行和垂直交錯(cuò)的膠原纖維板層;B:角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)到膠原原纖維;C:纖維周邊可見(jiàn)錯(cuò)綜分布的蛋白多糖裝飾;D:膠原纖維的橫切面。圖中L示膠原纖維板層,CF示膠原纖維,PG示蛋白多糖。圖2 實(shí)驗(yàn)眼角膜透射電鏡檢查結(jié)果

2.4 各組膠原纖維橫截面面積

與對(duì)照眼相比,實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后1周組、1個(gè)月組和3個(gè)月組兔眼角膜膠原纖維橫截面面積均明顯增大,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001),并且術(shù)后1個(gè)月組兔眼角膜膠原纖維橫截面面積大于術(shù)后1周組和3個(gè)月組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。與對(duì)照眼相比,實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后1個(gè)月組膠原纖維橫截面面積增加21.37%,表明兔眼角膜經(jīng)CF-CXL手術(shù)處理后增加了角膜的膠原纖維直徑(表1)。

表1 各組膠原纖維橫截面面積比較

3 討論

角膜膠原交聯(lián)手術(shù)是一種加固角膜、控制擴(kuò)張性角膜疾病進(jìn)展的治療方法。采用光敏劑(核黃素)和紫外光在角膜基質(zhì)中可產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng),在膠原原纖維和基質(zhì)纖維之間形成共價(jià)鍵[5],可以增加角膜的生物力學(xué)穩(wěn)定性以及抵抗蛋白水解酶消化的能力[6-7]。

快速跨上皮角膜膠原交聯(lián)手術(shù)保留了角膜上皮層,可減少去除角膜上皮后帶來(lái)的角膜感染、角膜融解、疼痛、上皮下霧狀混濁等并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8]。另一方面,由于角膜上皮的存在,上皮細(xì)胞層的親脂疏水性、表面的跨細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白可構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接,形成了對(duì)水溶性藥物經(jīng)細(xì)胞間旁路滲透的屏障。親水性的核黃素溶液很難通過(guò)細(xì)胞間隙途徑進(jìn)入角膜基質(zhì)內(nèi)。有研究者嘗試用其他促滲劑幫助核黃素更好地滲透入角膜基質(zhì),Caruso等[9]嘗試用維生素E聚乙二醇琥珀酸酯增強(qiáng)核黃素溶液和低通量紫外光進(jìn)行跨上皮角膜膠原交聯(lián),局部應(yīng)用該增強(qiáng)型核黃素溶液浸泡角膜15 min,然后使用CF-X Linker交聯(lián)儀進(jìn)行紫外光照射。目前,對(duì)于該增強(qiáng)型核黃素溶液的跨上皮交聯(lián)手術(shù)報(bào)道較少。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,角膜膠原交聯(lián)的發(fā)生主要在膠原原纖維表面之間或膠原原纖維與蛋白多糖的基質(zhì)之間[10-11],而膠原分子內(nèi)部或膠原分子之間是否產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng),目前報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)兔眼角膜進(jìn)行Ribocross?增強(qiáng)型核黃素交聯(lián)手術(shù)治療,觀察交聯(lián)術(shù)后角膜基質(zhì)膠原纖維的變化情況。

在本實(shí)驗(yàn)中,交聯(lián)術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月所有兔眼均保持透明,無(wú)角膜上皮損傷、角膜上皮下霧狀混濁以及角膜瘢痕發(fā)生。這表明CF-CXL方案對(duì)于角膜是安全的,包括角膜上皮細(xì)胞以及角膜內(nèi)皮細(xì)胞。由于角膜上皮的存在,浸泡 Ribocross?核黃素溶液15 min后,沖洗角膜表面核黃素溶液,角膜上皮細(xì)胞中仍存在Ribocross?核黃素溶液,在紫外光照射過(guò)程中該溶液也會(huì)擴(kuò)散到角膜基質(zhì)中,保護(hù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后角膜基質(zhì)膠原纖維板層排列整齊,局部可見(jiàn)纖維板層收縮,這可能與膠原纖維之間的蛋白多糖發(fā)生交聯(lián)導(dǎo)致膠原纖維之間間距縮小,組織變緊實(shí)有關(guān)。這種改變與臨床中交聯(lián)術(shù)后早期患者角膜厚度會(huì)出現(xiàn)輕度的變薄相一致[12]。在角膜基質(zhì)細(xì)胞中,可見(jiàn)散在分布的細(xì)小的膠原原纖維。以往的研究[13]認(rèn)為,交聯(lián)術(shù)后角膜基質(zhì)中產(chǎn)生的膠原原纖維可能與角膜基質(zhì)細(xì)胞的再生和增殖等有關(guān)。這種細(xì)胞的應(yīng)激性反應(yīng)也可能會(huì)導(dǎo)致角膜基質(zhì)中膠原纖維量的增加,但膠原原纖維在基質(zhì)中的排列是否規(guī)則,是否對(duì)角膜的透光度產(chǎn)生影響導(dǎo)致散射增加,產(chǎn)生暫時(shí)性的視覺(jué)質(zhì)量下降,需要做進(jìn)一步研究。

根據(jù)以往的研究,角膜膠原纖維隨著年齡的增長(zhǎng)所發(fā)生的自然交聯(lián)可以導(dǎo)致膠原纖維橫截面面積亦增加[14]。而額外的糖基化,如糖尿病患者,可以導(dǎo)致膠原纖維橫截面面積增加約50%[15]。Fullwood等[16]研究顯示,戊二醛交聯(lián)可以增加膠原蛋白分子相關(guān)的面積約11%[17]。Wollensak等[18]用掃描電子顯微鏡觀察兔眼角膜“Dresden”交聯(lián)術(shù)后角膜上皮、基質(zhì)和角膜內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)前部基質(zhì)膠原纖維收縮且膠原纖維直徑增大。在我們的研究中,交聯(lián)術(shù)后1周、1個(gè)月和3個(gè)月角膜組織中膠原纖維增粗,膠原纖維橫截面面積增加,1個(gè)月時(shí)橫截面面積增加約21.37%。這表明CF-CXL術(shù)后可以起到有效增加膠原纖維直徑的作用,其機(jī)制可能是手術(shù)增加了膠原蛋白分子內(nèi)部或者膠原蛋白分子之間的交聯(lián)作用。

本研究從裂隙燈下觀察角膜透明度、眼前節(jié)OCT測(cè)量角膜前部基質(zhì)的致密性到采用透射電鏡觀察角膜基質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)和膠原纖維橫截面面積,對(duì)CF-CXL治療的安全性和有效性進(jìn)行分析。不足之處在于CF-CXL交聯(lián)術(shù)后角膜基質(zhì)反應(yīng)的深度(即交聯(lián)線的深度)未能從眼前節(jié)OCT中反映出來(lái)。另外,本研究對(duì)膠原纖維之間的蛋白多糖修飾的變化未能進(jìn)行定量化的分析。

4 結(jié)論

CF-CXL可以有效增加兔眼角膜基質(zhì)膠原纖維的直徑,對(duì)厚度較薄的圓錐角膜是一種安全、有效的交聯(lián)方式。