翅果油樹葉綠體基因組密碼子偏好性分析

郭媛婷 張敏 楊玉潔 胡曉艷 杜淑輝

摘要：為明確翅果油樹葉綠體基因組密碼子使用偏好性，從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載翅果油樹葉綠體基因組序列，篩選出合適長度的序列并進行密碼子使用偏好及其影響因素分析；使用Codon W 軟件分析序列得出A3、T3、C3、G3、GC3、有效密碼子數(shù)（ENC）、相對同義密碼子使用度（RSCU）等重要參數(shù)，并進行相關(guān)指數(shù)分析、中性繪圖分析、ENC-plot 繪圖分析、PR2-plot 分析及最優(yōu)密碼子的確定。結(jié)果表明，翅果油樹葉綠體基因組密碼子不同位點上GC 含量分布差異較大，其大小表現(xiàn)為GC1（41.08%）>GC2（38.17%）>GC3（36.55%）；ENC 平均值為50.95，表明密碼子使用偏好性較弱；密碼子偏好使用A 或U 結(jié)尾，最終選出的20 個最優(yōu)密碼子也均以A 或U 結(jié)尾。中性繪圖和ENC-plot 繪圖分析發(fā)現(xiàn)，翅果油樹葉綠體基因組密碼子內(nèi)部堿基組成之間不具有顯著相關(guān)性，選擇壓力遠勝于突變壓力；PR2-plot 繪圖分析表明，在突變壓力之外翅果油樹葉綠體基因組密碼子使用還受到了強烈外界壓力的影響，自然選擇是影響翅果油樹葉綠體基因組密碼子使用模式的最主要因素。

關(guān)鍵詞：翅果油樹；葉綠體基因組；密碼子使用偏性；最優(yōu)密碼子

中圖分類號：S565.9 文獻標識碼：A文章編號：1002?2481（2023）03?0233?08

自然界中，氨基酸的種類只有20 種，而密碼子的編碼方式多達64 種，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)表明密碼子簡并性的存在，然而同義密碼子在編碼同一種氨基酸時，并未得到平等的使用概率，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于存在密碼子使用偏好[1]。密碼子偏好性是生物在漫長的進化中不斷平衡自然環(huán)境和自身生存的結(jié)果。吳彥慶等[2]對幾種花同一基因進行密碼子使用模式進行分析發(fā)現(xiàn)，一定程度上密碼子使用模式的相似度能夠反映出物種間親緣關(guān)系的遠近，而不同物種間密碼子的使用模式差別明顯。另外，在大量基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)，由于宿主基因密碼子偏好的制約，外源基因的表達量受到極大影響。因此，分析密碼子使用規(guī)律是進行基因工程和物種進化研究的前提[3]。

葉綠體是植物光合作用中心，葉綠體基因組是細胞核外另一個較為獨立的遺傳體系，其基因組規(guī)模小、拷貝數(shù)多，進化速率適中，遺傳性狀穩(wěn)定，較少發(fā)生基因重組，方便測序[4]，已被廣泛用于植物物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳分析、基因工程等研究中[5-8]，其中對葉綠體基因組密碼子使用偏好性的研究則是探索葉綠體功能最基礎的一步。目前，胡曉艷等[9]已對酸棗葉綠體基因組密碼子使用模式進行了深入探索，發(fā)現(xiàn)其密碼子偏好性存在并非由單一因素造成。李薇等[10]對銀杏葉綠體基因組密碼子進行篩選，得到11 個最優(yōu)密碼子。類似的研究在秋茄[11]、巨桉[12]、白毛銀露梅[13]、金蓮花[14]等多種植物中都已進行，結(jié)果表明，不同植物葉綠體基因組密碼子偏好性差異較大且影響因素也不盡相同。

翅果油樹（Elaeagnus mollis）是胡頹子科（Elaeagnaceae）胡頹子屬（Elaeagnus）的小喬木或落葉灌木，種仁出油率較高（約30%），富含維生素E。因翅果油樹是我國一種珍貴的特有古生物種且野生群落分布較少，1999 年被列為國家二級瀕危樹種，目前，其僅出現(xiàn)在晉、陜、豫三省[15]。當前，翅果油樹的相關(guān)研究多集中在生物學特性[16]、栽培育苗[17]及開發(fā)利用[18]等方面，關(guān)于葉綠體的研究卻少之又少。

本研究通過分析翅果油樹葉綠體基因組密碼子的堿基使用模式及其成因，探索翅果油樹葉綠體基因組的內(nèi)在表達與遺傳規(guī)律，旨在為后續(xù)翅果油樹基因改造和選育優(yōu)良品系提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從NCBI 公共數(shù)據(jù)庫中下載翅果油樹葉綠體基因組序列（NC_036932），共包括85 條蛋白質(zhì)編碼序列（Coding sequence，CDS）[9]。為避免偶然性編碼的概率增大，去除長度過短（小于300 bp）和重復的編碼序列以降低分析誤差，最終得到50 條滿足要求的翅果油樹葉綠體基因序列用于后續(xù)密碼子使用偏好性分析。

1.2 研究方法

1.2.1 密碼子相關(guān)偏性指數(shù)分析 使用Codon W軟件對已篩選出的合適長度的50 條翅果油樹葉綠體CDS 序列進行計算分析，得出密碼子末位堿基的A、T、G、C 含量（A3、T3、G3、C3）、有效密碼子數(shù)（ENC，Effective number of codon）、相對同義密碼子使用度（RSCU，Relative synonymous codon usage）。

其中，ENC 的取值范圍為20～61，通常將中間值45作為衡量其密碼子偏好性強弱的標準，數(shù)值越低偏性則越強，即ENC=20 表示該基因的每個氨基酸都只使用了唯一一個密碼子進行編碼；當ENC=61 時，每個氨基酸平均使用其每一個同義密碼子[19]。RSCU 的取值以1 為臨界值，此時該密碼子在同義密碼子中不具使用偏性，通常此時其同義密碼子的RSCU 值也為1，它們被自己所編碼的氨基酸平均使用；而RSCU>1 表示在同義密碼子中該密碼子使用頻次相對較多，偏好性更強；RSCU<1則與之相反[20]。

分別計算50 條CDS 序列中密碼子3 個位點堿基GC 的含量，分別記為GC1、GC2、GC3，求得GC1、GC2 的均值記為GC12，計算GC1、GC2、GC3 的平均值記為GCall。

1.2.2 中性繪圖分析 以GC3為橫坐標、GC12為縱坐標繪制散點圖，并添加回歸線（趨勢線）。通過回歸系數(shù)的值來判斷突變及選擇壓力對密碼子使用偏好形成的影響程度。若回歸系數(shù)趨近1，密碼子不同位置堿基組成具有顯著相關(guān)性，它們之間相互影響作用極大，突變是造成翅果油樹葉綠體基因組密碼子使用偏好的首要因素；反之，則說明密碼子末位堿基種類與前2 位不具明顯相關(guān)性，密碼子內(nèi)部各堿基具備獨立性，某一位點堿基的突變并不會關(guān)聯(lián)影響到其他位點的堿基，外界選擇壓力對翅果油樹葉綠體基因組密碼子偏好性的影響更為突出[21]。

1.2.3 ENC-plot 繪圖分析 以ENC 值為縱坐標、GC3 為橫坐標在平面內(nèi)繪出基因散點圖進行有效密碼子數(shù)分析，并在圖中添加ENC 期望曲線：ENC 期望=2+GC3+29/（GC32+（1－GC3）2）[22]。通過比較各基因的實際散點分布與期望曲線的相對距離，推斷翅果油樹葉綠體基因組密碼子偏好性的成因，若散點落在期望曲線上或附近，則認為密碼子使用偏好性僅受到或主要受到堿基突變引起，而自然選擇對其影響微乎其微；若散點嚴重偏離曲線，則表明自然選擇對其影響更加深遠[23-24]。依據(jù)公式ENC 比值=（ENC 期望-ENC 實際）/ENC 期望[25]列出ENC 比值頻數(shù)分布表，通過比較ENC 比值的大小以及出現(xiàn)頻率可進一步確定影響密碼子使用偏性的主要因素，若ENC 比值較小且出現(xiàn)頻率高，表明密碼子使用偏性主要受突變影響，反之，則自然選擇效應是主要作用。

1.2.4 PR2-plot 繪圖分析 以G3/（G3+C3）為橫坐標、A3/（A3+T3）為縱坐標在平面內(nèi)繪制散點圖，并添加網(wǎng)格線，中心位置代表密碼子末位堿基使用頻率U=A、G=C。如果只受到唯一因素（堿基突變）影響，4 種堿基的使用頻率相同，散點會均勻分布在坐標平面內(nèi)，反之，則說明密碼子的使用偏好性同時受到自然選擇和突變等多種因素的影響；若散點分布于網(wǎng)格上半部分，該基因密碼子末位堿基使用頻率為A>T，若分布在網(wǎng)格的左半部分，則C>G[3]。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定 以有效密碼子數(shù)值為依據(jù)，對50 條翅果油樹編碼序列進行排序，從ENC值較大和較小的一端各取5 條基因序列，ENC 值較小的一組則密碼子偏好性強，定義為高表達基因庫；ENC 值較大的一組密碼子偏好性弱，定義為低表達基因庫，取二者RSCU 值差值，記為△RSCU，滿足△RSCU≥0.08 則視其為高表達密碼子，滿足RSCU>1 則視其為高頻密碼子，篩選出同時符合上述2 個條件的密碼子，定義為最優(yōu)密碼子[9]。由于色氨酸（Trp）和蛋氨酸（Met）都僅有一個編碼密碼子，分別為UGG、AUG，而3 個終止密碼子UAG、UAA、UGA 不編碼蛋白，因此在進行RSCU 分析時排除這5 個不具偏好性的密碼子[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excle 軟件和SPSS 26.0 軟件對Codon W得出的相關(guān)數(shù)據(jù)進行表格匯總和繪圖分析。

2結(jié)果與分析

2.1 翅果油樹密碼子相關(guān)偏性指數(shù)分析

翅果油樹葉綠體基因組密碼子相關(guān)偏性指數(shù)分析結(jié)果如表1 所示，統(tǒng)計篩選得到的50 條基因序列，GC1 平均值為41.08%，GC2 平均值為38.17%，GC3 平均值為36.55%，發(fā)現(xiàn)密碼子不同位置堿基組成的GC 含量有較大差異，末位堿基的GC 含量少于前2 位堿基的GC 含量，但3 個堿基位點上C、G 均不是優(yōu)勢堿基，且平均GC 含量（GCall）為38.60%，說明翅果油樹葉綠體基因編碼更偏愛使用A、U 堿基；ENC 值的范圍為39.54～61.00，平均值為50.95，50 條翅果油樹葉綠體基因序列中，ENC>45 的有41 條，說明其密碼子偏好性較弱。

從表2 可以看出，GC1、GC2、GC3 三者之間均未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，相互獨立存在，且ENC 只與GC3 存在極顯著相關(guān)（P<0.01），因此，判定密碼子末位上的堿基組成（GC3）可用于代表整個密碼子的使用偏好。圖1 通過分析比較各密碼子相對同義密碼子使用度，得到28 個RSCU>1 的密碼子，其中，多達25 個密碼子以A 或U 結(jié)尾，僅有3 個密碼子以G 或C 結(jié)尾，表明翅果油樹葉綠體基因組密碼子更喜好以A 或U 結(jié)尾。分別篩選出每種氨基酸編碼使用頻率最高的優(yōu)勢密碼子，共18 個，它們之中僅有1 個以C 結(jié)尾，其余皆以A 或U 結(jié)尾，再次證明翅果油樹葉綠體基因組密碼子存在以A 或U 為末位堿基的使用偏好。

2.2 最優(yōu)密碼子分析

通過最優(yōu)密碼子分析得出（表3），有28 個密碼子RSCU>1，24 個密碼子△ RSCU≥0.08，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)，同時滿足這2 個條件的最優(yōu)密碼子多達20 個，分別為UUU、UUA、CUU、AUU、GUU、AGU、CCU、CCA、ACU、GCU、GCA、UAU、CAU、CAA、AAU、AAA、GAU、GAA、AGA、GGA，其中以U結(jié)尾的有12 個，以A 結(jié)尾的有8 個。

2.3 中性繪圖分析

中性繪圖分析結(jié)果如圖2 所示，GC12 與GC3 的回歸系數(shù)為-0.144 8，相關(guān)系數(shù)為-0.288 0，結(jié)合表2 結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)密碼子第1、2 位堿基和第3 位堿基的組成規(guī)律不具明顯相關(guān)性，可見，其密碼子內(nèi)部某一位點堿基的突變并不會對其他位點造成顯著影響，翅果油樹葉綠體基因組密碼子偏好性的形成更多考慮為自然選擇效應的影響作用。

2.4 ENC-plot 繪圖分析

ENC-plot 繪圖分析結(jié)果顯示（圖3），基因散點分布趨于分散，且大部分距離標準ENC 曲線的位置較遠，表明ENC 實際值和ENC 期望值有較大差異。ENC 比值頻數(shù)分布如表4 所示，有15 個基因ENC 比值在-0.05～0.05 范圍內(nèi)，占比30%，距ENC期望值較近或與期望值一致；其余35 個基因位于此區(qū)間外，占比70%，距離期望值較遠，這與ENCplot繪圖分析結(jié)果相符。絕大多數(shù)散點的偏離，依然說明翅果油樹葉綠體基因組密碼子使用偏性主要受到自然選擇效應的作用。

2.5 PR2-plot 繪圖分析

PR2-plot 分析結(jié)果如圖4 所示，散點在坐標軸平面內(nèi)的4 個區(qū)域中均有分布，相對而言分布于右上方的散點數(shù)量最多，表明翅果油樹葉綠體基因組密碼子末位堿基使用頻次A 大于T、G 大于C。已知若堿基突變影響是密碼子偏好形成的唯一因素，則A、T、C、G 這4 種堿基的使用概率應是一致的，散點分布的不均勻再次說明除了突變影響之外，翅果油樹葉綠體基因組密碼子還受到了較強的外界選擇影響。

3結(jié)論與討論

本研究通過分析ENC 值和RASU 值確定了翅果油樹葉綠體密碼子的20 種最優(yōu)密碼子。ENC 平均值為50.95，不僅說明翅果油樹葉綠體基因組密碼子使用偏好性較弱，也解釋了為何最優(yōu)密碼子會多達20 個，這與白毛銀露梅[13]、酸棗[9]等的研究結(jié)果一致。同時翅果油樹葉綠體基因組中密碼子末位堿基存在明顯的偏好現(xiàn)象，符合前人得出的雙子葉植物密碼子末位堿基偏好使用A/U 的規(guī)律[26]。

此外研究發(fā)現(xiàn)，自然選擇和突變是密碼子使用偏好性形成的2 個重要因素[9]。本研究通過中性繪圖、ENC-plot 和PR2-plot 說明翅果油樹葉綠體基因組密碼子主要受自然選擇的影響，這與白毛銀露梅[13]及灰毛漿果楝[27]相似，而秋茄[11]和籽粒莧[28]主要受突變影響，這可能是由于成熟周期較短使得植物體內(nèi)基因累積變異程度較大，從而增加突變的影響程度。翅果油樹由于野生種群分布極少，引得全國各地都在積極地進行人工引種栽培，試圖選育優(yōu)良品種，這也間接加劇了選擇壓力的影響。野生翅果油樹表型豐富，而本研究試驗材料單一，并未證實不同表型翅果油樹密碼子的使用模式是否一致，也未有線索顯示翅果油葉綠體中較高的維生素E 含量是否與其密碼子的使用模式有關(guān)。

本研究通過對葉綠體基因組序列進行分類統(tǒng)計和繪圖分析，探索其內(nèi)部的密碼子偏好性與堿基使用規(guī)律，旨在為后續(xù)提高外源基因的表達效率、系統(tǒng)進化等研究提供重要依據(jù)。進一步研究將有望利用基因改造突破翅果油樹遺傳與育種上的難點，有效降低其瀕危程度。

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