M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞參與胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及免疫逃逸的機(jī)制研究

陳華敏,何志軍,涂 偉,吳曉明,黃光鉞

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，海南 海口 571000）

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康[1-3]。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞組成的高度異質(zhì)性生態(tài)系統(tǒng)。其中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumour associated macrophages，TAM）是主要的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之一，通常分為兩種功能相反的亞型，即經(jīng)典激活的M1 型和交替激活的M2 型。M1 型TAM 通常發(fā)揮抗腫瘤作用，包括直接介導(dǎo)細(xì)胞毒性和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞[4]；M2 型TAM 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，加快腫瘤進(jìn)展[5]。M1 型TAM 和M2 型TAM 都具有高度可塑性，因此能夠在腫瘤微環(huán)境變化或治療干預(yù)中相互轉(zhuǎn)化，其中靶向M2型TAM現(xiàn)已成為一種新的癌癥治療策略。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫逃逸對(duì)于腫瘤的生存和發(fā)展至關(guān)重要。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可以募集免疫抑制細(xì)胞（如CD4+T細(xì)胞），從而破壞CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒功能[6]。程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是B7 家族的配體，可與其受體程序性死亡蛋白-1（programmed death protein-1，PD-1）結(jié)合，影響腫瘤特異性T 細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制CD8+T 細(xì)胞的活性，導(dǎo)致腫瘤免疫逃避[7]。臨床上越來(lái)越多的研究表明，用抗PD-1 抗體阻斷PD-1 檢查點(diǎn)是各種癌癥的有效免疫治療方法[8]。有研究揭示，從胃癌組織中分離的TAM 主要為M2 型，該表型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[9]。但M2 型TAM 的這一作用是否涉及調(diào)控PD-L1表達(dá)目前尚未明確。鑒于此，本研究通過(guò)靶向抑制胃癌細(xì)胞PD-L1 表達(dá)后建立其與M2 型TAM 共培養(yǎng)體系，觀察胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及免疫抑制因子分泌的變化，以期為胃癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人單核細(xì)胞株THP-1 和人胃癌細(xì)胞系MKN-45（中國(guó)細(xì)胞系資源庫(kù)），胎牛血清（杭州四季青生物公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和白細(xì)胞介素-4[（interleukin-4，IL-4）美國(guó)Sigma 公司]，Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司），Triton X-100 免疫染色通透液和DAPI 染料（北京索萊寶生物公司），Magic? siRNA 轉(zhuǎn)染試劑（北京安必奇生物公司），TRIzol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量檢測(cè)試劑盒（日本Takara 公司），Matrigel 膠（上海碧云天生物研究所），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）特異性ELISA 檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物公司），兔抗CD206 單克隆抗體、兔抗PD-L1 單克隆抗體及Alexa Fluor 488標(biāo)記熒光二抗（英國(guó)Abcam公司）。

1.2 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo)

在THP-1 細(xì)胞中添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，調(diào)整密度為2×105/mL植入6孔板內(nèi)，更換為含50 ng/mL PMA 的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，換用含20 ng/mL IL-4的新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h，以建立M2型TAM 體系。通過(guò)倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。

1.3 細(xì)胞免疫熒光染色

將誘導(dǎo)前后的THP-1 細(xì)胞或各組MKN-45 細(xì)胞接種于玻片表面，爬片后，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定，浸入0.1%Triton X-100 中室溫通透20 min，再加入蛋白酶處理。山羊血清室溫封閉30 min，誘導(dǎo)前后的THP-1 細(xì)胞滴加兔抗CD206 單克隆抗體（1∶100）進(jìn)行標(biāo)記，各組MKN-45 細(xì)胞滴加兔抗PD-L1 單克隆抗體（1∶200），置于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記熒光二抗（1∶500），置于37 ℃孵育1 h，DAPI避光染核10 min，PBS 洗滌，封片劑封片，晾干。通過(guò)熒光顯微鏡觀察蛋白熒光表達(dá)并拍照，Image J 軟件分析各蛋白染色熒光強(qiáng)度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

將人胃癌細(xì)胞系MKN-45分為對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的MKN-45 細(xì)胞）、siPD-L1 組（將siPD-L1 轉(zhuǎn)染至MKN-45細(xì)胞）、M2 組（在Transwell 小室上室接種M2 型TAM，下室接種MKN-45 細(xì)胞）和siPD-L1+M2 組（在Transwell 小室上室接種M2 型TAM，下室接種轉(zhuǎn)染siPD-L1的MKN-45細(xì)胞）。將以上各組置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h 后，收集MKN-45 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中，siRNA 轉(zhuǎn)染嚴(yán)格根據(jù)Magic? siRNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將siNC 或siPD-L1 轉(zhuǎn)染至MKN-45 細(xì)胞中，分別記為siNC 組、siPD-L1 組，并進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

TRIzol 法提取轉(zhuǎn)染后的MKN-45細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PD-L1 表達(dá)。以GADPH 為內(nèi)參，引物序列：PD-L1 上游引物5'-GCTGCACTAATTGTCTATTGG GA-3'，下游引物5'-AATTCGCTTGTAGTCGGCACC-3'；GADPH上游引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。反應(yīng)體系根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制，在定量檢測(cè)系統(tǒng)上設(shè)置程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算，比較各組MKN-45細(xì)胞PD-L1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

收集各組MKN-45 細(xì)胞，PBS 清洗，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，取100 μL 懸液置于流式管內(nèi)，加入10 μL PE 標(biāo)記PD-L1單克隆抗體，在4 ℃下避光孵育30 min，PBS 洗滌并重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組PD-L1 陽(yáng)性表達(dá)。

1.7 體外劃痕實(shí)驗(yàn)

將各組MKN-45 細(xì)胞接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿板底后，在培養(yǎng)板背后垂直于板底均勻劃痕，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗劃痕下的細(xì)胞碎片。培養(yǎng)24 h后取出，倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照，Image J軟件分析劃痕愈合率，劃痕愈合率=細(xì)胞遷移后的表面積/總表面積×100%。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)

在Transwell 小室上室內(nèi)表面涂稀釋的Matrigel膠，置于37 ℃下使其形成基質(zhì)屏障層。以不含胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液將各組MKN-45 細(xì)胞密度調(diào)整為2×104/mL，吸取200 μL 懸液加入上室，吸取600 μL 含胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液加入下室。將小室孵育24 h后取出，擦去未穿膜細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)各組中穿膜數(shù)目，即為侵襲數(shù)目。遷移數(shù)目檢測(cè)除不涂Matrigel膠外，其余步驟與上述步驟一致。

1.9 ELISA

收集各組MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)液，以4 000 r/min低溫離心5 min，獲取上清，使用ELISA 檢測(cè)試劑盒，分別檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF、TGF-β和IL-6水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8.30 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)后鑒定結(jié)果

誘導(dǎo)前的THP-1細(xì)胞為懸浮狀態(tài)，大小均勻，呈圓形或橢圓形；經(jīng)PMA 與IL-4誘導(dǎo)后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多樣，多數(shù)呈長(zhǎng)梭形或多邊形，且伸出偽足，呈典型的M2型TAM形態(tài)，見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后THP-1細(xì)胞形態(tài)（×200）

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前的THP-1 細(xì)胞比較，經(jīng)PMA與IL-4誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)CD206熒光染色強(qiáng)度明顯增加（圖2）。說(shuō)明成功構(gòu)建M2型TAM模型。

圖2 免疫熒光染色觀察誘導(dǎo)前后THP-1 細(xì)胞CD206 表達(dá)（×200）

2.2 不同處理下MKN-45細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)

MKN-45 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，siPD-L1 組細(xì)胞內(nèi)PD-L1相對(duì)表達(dá)量為（0.29±0.02），顯著低于對(duì)照組的（1.00±0.06）和siNC 組的（1.00±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

免疫熒光染色結(jié)果顯示，各組MKN-45 細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度不一，說(shuō)明PD-L1 表達(dá)不同；與對(duì)照組比較，siPD-L1 組細(xì)胞內(nèi)PD-L1 熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05），M2組則顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與M2組比較，siPD-L1+M2 組細(xì)胞內(nèi)PD-L1 熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 免疫熒光染色觀察MKN-45細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)（×200）

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siPD-L1 組MKN-45 細(xì)胞表面PD-L1 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而M2 組顯著升高（P＜0.05）；與M2 組比較，siPD-L1+M2組MKN-45 細(xì)胞表面PD-L1 表達(dá)則顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MKN-45細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)

2.3 MKN-45細(xì)胞劃痕愈合率比較

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siPD-L1 組MKN-45 細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05），M2 組劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）；與M2 組比較，siPD-L1+M2組劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKN-45細(xì)胞劃痕愈合能力（×100）

2.4 MKN-45細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目比較

Transwell 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siPD-L1 組MKN-45細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均顯著減少（P＜0.05），M2 組遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均顯著增加（P＜0.05）；而siPD-L1+M2組遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均顯著少于M2組（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

2.5 MKN-45細(xì)胞免疫抑制因子表達(dá)水平比較

ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siPD-L1 組VEGF、TGF-β和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），M2組VEGF、TGF-β和IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）；與M2組比較，siPD-L1+M2 組VEGF、TGF-β 和IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 ELISA法檢測(cè)MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF、TGF-β和IL-6水平

3 討論

由于胃癌早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于胃癌晚期，高轉(zhuǎn)移率與復(fù)發(fā)率是影響患者生存的主要原因[2]。此外，青少年胃癌的發(fā)病率也逐年上升[10]。因此，闡明胃癌進(jìn)展的病理機(jī)制以尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于胃癌患者的診療至關(guān)重要。在不同的腫瘤基質(zhì)中TAM 具有高可塑性，主要表現(xiàn)為M2型，這與患者的腫瘤轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后密切相關(guān)[9]。然而，在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生M2型TAM 的潛在機(jī)制目前尚未可知。腫瘤細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞向M2 型極化的影響及兩者之間的相互作用已成為研究的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，與M2型TAM共培養(yǎng)后的MKN-45細(xì)胞，其細(xì)胞劃痕愈合率升高，細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目均增加，這表明M2 型TAM 可能提高了MKN-45 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Yan 等[11]的研究表明，高水平的M2 型TAM 浸潤(rùn)與胃癌侵襲性特征有關(guān)，并且是胃癌中的獨(dú)立預(yù)后因素，可作為胃癌患者預(yù)后的一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo)。Zhou 等[12]研究指出，早期胃癌組織內(nèi)CD163 標(biāo)記的M2 型TAM 數(shù)目與患者的腫瘤復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，且M2 型TAM 可在體外促進(jìn)人胃癌細(xì)胞MKN-45 的增殖和侵襲，并促進(jìn)異種移植模型的腫瘤生長(zhǎng)。Zheng等[13]研究表明，胃癌組織內(nèi)M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Fizz1、Ym1和Arg-1的表達(dá)水平升高，將M2型TAM 與人胃癌細(xì)胞HGC-27 共培養(yǎng)后，HGC-27 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，M2 型TAM 能夠促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移，加速腫瘤進(jìn)程。

免疫療法是近十年來(lái)的一種新型抗癌療法，目前已經(jīng)建立了各種免疫治療方式，包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、疫苗和溶瘤病毒等[14]。其中，PD-1及其配體PD-L1的抗體是主要的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。在正常情況下，PD-L1 是維持自身耐受性和防止T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫刺激所必需的因子，然而腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)PD-L1的表達(dá)獲得免疫逃逸的特性，即PD-L1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[15]。已知TAM是PD-1/PD-L1軸的關(guān)鍵介質(zhì)，能夠抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，目前，關(guān)于腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與TAM 之間的關(guān)系正被逐步揭示。Harada 等[16]研究表明，M2 型TAM 浸潤(rùn)與胃腺癌細(xì)胞中PD-L1 表達(dá)高度相關(guān)；Zhu 等[17]指出PD-L1 的高表達(dá)與M2 型TAM 極化相關(guān)，PD-L1 介導(dǎo)的免疫抑制可能歸因于TAM 浸潤(rùn)及其向M2 型極化。本研究結(jié)果顯示，與M2型TAM 共培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞MKN-45 中，PD-L1 熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞表面PD-L1 表達(dá)升高，說(shuō)明M2 型TAM可能促進(jìn)了MKN-45細(xì)胞中PD-L1表達(dá)。鑒于此，本研究進(jìn)一步通過(guò)siRNA 干擾抑制MKN-45 細(xì)胞中PD-L1表達(dá)，與M2 型TAM 共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，MKN-45 細(xì)胞不僅表現(xiàn)出細(xì)胞劃痕愈合率降低、遷移與侵襲數(shù)目均減少，同時(shí)細(xì)胞PD-L1熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)降低，提示M2 型TAM 促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用可能與調(diào)控PD-L1表達(dá)相關(guān)。

胃癌免疫逃逸現(xiàn)象與多種機(jī)制有關(guān)，其中腫瘤微環(huán)境中分泌的多種細(xì)胞因子與機(jī)體免疫抑制作用密切相關(guān)，該類(lèi)細(xì)胞因子稱為免疫抑制因子，其參與調(diào)節(jié)復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，影響免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[18]。VEGF 作為一種中樞調(diào)節(jié)因子，是調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的重要指標(biāo)，除了參與腫瘤血管生成外，其還與樹(shù)突狀細(xì)胞的功能異常相關(guān)[19]；TGF-β 調(diào)節(jié)許多免疫細(xì)胞類(lèi)型的生成和效應(yīng)功能，控制先天免疫系統(tǒng)，是免疫抑制的核心因子[20]；IL-6 除了促進(jìn)腫瘤進(jìn)展外，還可以將髓源性抑制細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境中，發(fā)揮免疫抑制功能，從而增加腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力[21]。本研究結(jié)果顯示，MKN-45 細(xì)胞與M2 型TAM 共培養(yǎng)后其分泌VEGF、TGF-β 和IL-6 的水平明顯上升，而抑制PD-L1 表達(dá)的MKN-45 細(xì)胞與M2 型TAM 共培養(yǎng)后其分泌VEGF、TGF-β 和IL-6 的水平則明顯下降，因此，推測(cè)M2型TAM 促進(jìn)胃癌細(xì)胞免疫逃逸，該作用可能與調(diào)控PD-L1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，M2 型TAM 促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及免疫抑制因子表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)其免疫逃逸的發(fā)生，該作用可能與促進(jìn)胃癌細(xì)胞PD-L1 表達(dá)有關(guān)，這為明確抑制胃癌轉(zhuǎn)移與免疫逃逸的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，有關(guān)M2 型TAM 激活胃癌細(xì)胞中PD-L1 表達(dá)的機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。