金銀花花蕾腺毛形態(tài)發(fā)生與生長動態(tài)△

湯慧敏，張珂洋，張國卉，王玲娜，2*，張永清，2*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；

2.山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟南 250355

表皮毛是植物為響應(yīng)和抵御環(huán)境脅迫而由表皮細(xì)胞形成的特化結(jié)構(gòu)，具有多種生物學(xué)功能，根據(jù)其是否具有分泌能力分為腺毛和非腺毛[1]。腺毛可合成、儲存或分泌大量次生物質(zhì)，被譽為“生物合成工廠”[2]。藥用植物活性成分大多為植物次生物質(zhì)，因此，藥用植物腺毛的發(fā)生發(fā)育及其內(nèi)含物與藥材品質(zhì)密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，黃花蒿、薄荷、紫蘇等藥用植物的腺毛起源于葉原基表皮細(xì)胞，經(jīng)多次分裂形成數(shù)目不等的基細(xì)胞、柄細(xì)胞與頭細(xì)胞[5-9]。

金銀花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，屬常用大宗藥材，可清熱解毒、疏散風(fēng)熱，主治溫病發(fā)熱、癰疽疔毒、熱毒血痢等[10-11]。金銀花藥材腺毛是其重要的顯微鑒別特征，可據(jù)此辨別真?zhèn)?、區(qū)分產(chǎn)地和評價品質(zhì)[12-14]。前期有關(guān)金銀花腺毛的研究多集中在密度、形態(tài)等方面，有報道早在花蕾三青期腺毛就已完成分化，后期只是腺頭、腺柄體積增大[12-15]，均未涉及腺毛的起源與形態(tài)發(fā)生。本研究采集不同發(fā)育時期金銀花花蕾，采用石蠟切片技術(shù)，觀察確定腺毛的形態(tài)發(fā)生過程；通過制作臨時裝片，觀察確定腺毛的生長動態(tài)，為金銀花花蕾腺毛的深入研究，以及基于腺毛的藥材質(zhì)量評價和品種選育等提供參考。

1 材料

1.1 樣品

金銀花花蕾取自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.，于花期選定植株隨機摘取長度為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mm的幼蕾，備用。

1.2 儀器

ICC50W 型數(shù)碼相機、DM500 型光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司）；KD-2508 型石蠟切片機（上海珂淮儀器有限公司）；NanoZoomer S60型數(shù)字切片掃描儀（北京綠綿科技有限公司）；GFL-230 型恒溫箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；TB-718X 型生物組織自動包埋機（湖北泰維科技有限公司）。

1.3 試藥

50%甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液（北京蘭杰柯生物技術(shù)有限公司）；水合氯醛、甘油、石蠟、中性樹膠（上海源葉生物科技有限公司）；1%番紅水溶液、1%固綠酒精溶液（南京信帆生物有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 花蕾保存

參考文獻[16]方法，將采摘的新鮮花蕾剖開，去除雌蕊、雄蕊，置于50% FAA 固定液中固定24 h，然后放入50%乙醇中脫水2 h，最后置70%乙醇中保存。

2.2 臨時裝片與顯微觀察

采用花蕾表面制片。將保存在70%乙醇中的花蕾取出，置于載玻片上，滴加水合氯醛溶液[水合氯醛-水-甘油（10∶3∶2）]，微加熱至有氣泡產(chǎn)生，在樣品呈半透明狀態(tài)后，滴加1～2滴稀甘油[甘油-水（33∶100）]，制成臨時裝片。光學(xué)顯微鏡下觀察花蕾中部不同視野內(nèi)的腺毛細(xì)胞：10×4 倍鏡下，隨機取30 個視野，觀察統(tǒng)計腺毛分布密度；10×10 倍鏡下，在每個視野中隨機選取3 個腺毛，觀察統(tǒng)計完整腺毛腺頭、腺柄大小；在10×40 倍鏡下，觀察腺毛腺頭顏色。

2.3 石蠟切片

2.3.1 脫水與透明 將保存在70%乙醇中的花蕾取出，按照程序置入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中脫水：1）80%乙醇2 h→90%乙醇2 h→95%乙醇2 h→95%乙醇2 h→無水乙醇1.5 h→無水乙醇1.5 h；2）將材料依次放入1/2 無水乙醇+1/2 二甲苯2 h、100%二甲苯1.5 h、100%二甲苯1.5 h進行透明處理。

2.3.2 浸蠟與包埋 在65 ℃恒溫條件下，將透明后的材料依次放入1/2 二甲苯+1/2 石蠟中1 h、100%石蠟液1 h、100%石蠟液1 h 進行浸蠟處理，最后用包埋機包埋。

2.3.3 修片與切片 對包埋的材料進行修塊、黏塊、整修，保證材料四周都有適量石蠟，調(diào)整切片機進行切片。

2.3.4 黏片 用毛筆把切好的蠟帶輕放在干凈紙上，光面朝下。黏片前，在載玻片上用滴管將純水滴成凸起的水條，選取合適蠟片輕放在水條上，用濾紙吸取多余水分，置40 ℃烘箱內(nèi)烤片24 h。

2.3.5 脫蠟 依次將切片按照程序進行脫蠟：100%二甲苯20 min→100%二甲苯20 min→1/2 二甲苯+1/2 無水乙醇10 min→無水乙醇10 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→蒸餾水3 min。

2.3.6 染色與封片 先用1%番紅水溶液染色20 min，蒸餾水洗滌3～5次，再用1%固綠酒精溶液染色30 s，將裝片浸泡于75%乙醇中，1 min后取出，晾干，中性樹膠封片。

2.4 圖片與數(shù)據(jù)處理

采用數(shù)字切片掃描儀掃描制成的金銀花花蕾組織切片，采用Motic DSAssistant Lite 軟件觀察切片掃描結(jié)果；采用Image J軟件進行腺毛計數(shù)，測量腺頭及腺柄的周長、面積；采用SPSS 28.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 金銀花花蕾腺毛形態(tài)發(fā)生

將發(fā)育程度不同的金銀花花蕾制成石蠟切片，觀察其腺毛形態(tài)發(fā)生情況，結(jié)果見圖1。

圖1 金銀花花蕾腺毛形態(tài)發(fā)生（10×40）

《中華人民共和國藥典》2020 年版記載，金銀花腺毛較多，頭部倒圓錐形、類圓形或略扁圓形，4～33 個細(xì)胞，排成2～4 層，直徑30～108 μm，柄部1～5 個細(xì)胞，長可達700 μm[8]。金銀花花蕾腺毛起源于幼小花蕾的表皮細(xì)胞，該腺毛原始細(xì)胞經(jīng)伸長生長而凸出花蕾表面，逐漸成長為長橢圓形細(xì)胞，其細(xì)胞核不斷向上移動，細(xì)胞核集中于細(xì)胞頂端（圖1A）。此后該腺毛原始細(xì)胞進行第1 次不均等平周分裂，形成大小不等的2 個子細(xì)胞，下方的子細(xì)胞體積小，細(xì)胞核向下移動，以后發(fā)育成腺毛基部。上方的子細(xì)胞體積大，以后發(fā)育成腺毛柄部和頭部（圖1B）。上方子細(xì)胞體積迅速增大后，再次進行不均等平周分裂，形成大小不等的2 個子細(xì)胞，下方子細(xì)胞與基部相連（圖1C），上方子細(xì)胞不進行或進行多次平周分裂，形成與基細(xì)胞相連的單列3～5個細(xì)胞。最上面的細(xì)胞形成腺毛分泌細(xì)胞的原始細(xì)胞，經(jīng)平周分裂使腺毛頭部細(xì)胞層數(shù)增加，形成單列的4～6 個細(xì)胞（圖1D、圖1E），每層的分泌細(xì)胞還可進行多次連續(xù)的均等和不均等的垂周分裂，使頭部細(xì)胞數(shù)目不斷增加（圖1F～圖1H），最終發(fā)育形成多細(xì)胞腺毛頭部（圖1I）。每層分泌細(xì)胞進行垂周分裂的時間常存在差異，有的第1 層分泌細(xì)胞先進行垂周分裂（圖1F），有的第2層分泌細(xì)胞先進行垂周分裂（圖1G）。在腺毛頭部細(xì)胞垂周分裂使頭部細(xì)胞不斷增加的過程中伴隨著基細(xì)胞及其上方的1～3 個細(xì)胞迅速增大、伸長，發(fā)育形成柄細(xì)胞的過程（圖1H）。最終發(fā)育形成的腺毛柄部如圖1J所示。腺毛頭部細(xì)胞剛結(jié)束分裂形成完整腺毛時，頭部細(xì)胞排列緊密（圖1I），之后細(xì)胞繼續(xù)分化，細(xì)胞體積增大，頭部細(xì)胞間出現(xiàn)細(xì)胞間隙（圖1J），標(biāo)志腺毛發(fā)育成熟。

3.2 金銀花花蕾腺毛生長動態(tài)

3.2.1 腺毛密度變化 為了解花蕾發(fā)育過程中腺毛密度的變化，分別在花蕾長1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mm 時，統(tǒng)計顯微鏡下每個視野中的腺毛個數(shù)，結(jié)果見表1、圖2。

表1 不同發(fā)育程度金銀花花蕾外表面腺毛密度（,n=30）

表1 不同發(fā)育程度金銀花花蕾外表面腺毛密度（,n=30）

注：采用Duncan′s multiple range test方法分析，同列不同字母表示P<0.05；表2同。

圖2 不同發(fā)育程度金銀花花蕾外表面腺毛（10×4）

由表1、圖2 可知，在花蕾幼小時期，隨著花蕾發(fā)育，腺毛密度是不斷增加的。1.0 mm 與2.5 mm、2.5 mm 與5.0 mm、5.0 mm 與7.5 mm 花蕾之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），花蕾長1.0～5.0 mm時是腺毛“迅速涌現(xiàn)”期；在花蕾長7.5～10.0 mm時，雖然腺毛密度仍然有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示腺毛分化基本完成，腺毛密度趨于穩(wěn)定。

3.2.2 腺毛大小變化 在幼小花蕾逐漸發(fā)育過程中，腺毛大小的變化情況見表2。由表2 可知，在幼小花蕾不斷發(fā)育長大的過程中，腺毛也在不斷長大，表現(xiàn)為腺頭面積、腺頭周長、腺柄面積、腺柄周長均在不斷增加。其中，花蕾長5.0～7.5 mm時期是腺毛“迅速膨大”期，腺頭面積、腺頭周長在花蕾長10.0 mm 時仍在呈明顯增長趨勢，而腺柄面積、腺柄周長在花蕾長7.5 mm 時雖然仍有增加，但與長10.0 mm 的花蕾差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示在金銀花幼蕾長度為7.5 mm時，腺毛腺頭可以進一步明顯增大，但腺柄面積與周長不再明顯增加，表明腺柄生長趨于穩(wěn)定。

表2 不同發(fā)育程度金銀花花蕾外表面腺毛大?。?n=90）

表2 不同發(fā)育程度金銀花花蕾外表面腺毛大?。?n=90）

3.2.3 腺毛腺頭顏色變化 腺頭是腺毛進行次生代謝、合成積累次生物質(zhì)的主要場所，其面積與周長隨著花蕾發(fā)育不斷增加，同時其顏色也在不斷發(fā)生變化（圖3）。

圖3 不同發(fā)育程度金銀花花蕾外表面腺毛顏色（10×40）

由圖3 可知，1.0、2.5 mm 長花蕾腺毛腺頭多呈淺黃色和橘黃色，5.0 mm 長花蕾多呈橘黃色和深橘黃色，7.5 mm 長花蕾多呈黃棕色，10.0 mm 長花蕾多呈棕褐色，即隨著幼蕾長度增加，腺毛腺頭顏色逐漸加深。這提示在花蕾長約1.0 mm時就已經(jīng)開始合成積累有色的次生物質(zhì)，隨著花蕾發(fā)育，腺頭中合成積累的有色次生物質(zhì)數(shù)量不斷增加。

4 討論

腺毛是植物次生物質(zhì)合成積累的主要場所，也是藥材鑒別的重要特征[12]，如根據(jù)腺毛和非腺毛的形態(tài)可以區(qū)分金銀花和其近源植物金銀忍冬[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，金銀花花蕾腺毛起源于幼嫩花蕾表皮細(xì)胞，原表皮細(xì)胞凸出花表，形成腺毛原始細(xì)胞，腺毛原始細(xì)胞經(jīng)一系列平周與垂周分裂發(fā)育形成完整腺毛。觀察金銀花花蕾腺毛的生長動態(tài)發(fā)現(xiàn)，金銀花花蕾腺毛發(fā)生在花蕾形態(tài)建成之后，在幼蕾長約1.0 mm 時才開始出現(xiàn)腺毛。在花蕾短于1.0 mm 時就有非腺毛存在，表明金銀花花蕾非腺毛的發(fā)生要早于腺毛，這可能與非腺毛能夠抵御紫外線損傷有關(guān)[17]。

花蕾長1.0～5.0 mm 時是腺毛的“迅速涌現(xiàn)”期。在花蕾增長發(fā)育過程中，表皮細(xì)胞增多，會有新的表皮細(xì)胞分化，從而部分新的表皮細(xì)胞形成新的腺毛。在花蕾從短變長的發(fā)育過程中，同時存在不同大小的腺毛。筆者分別在每個時期的樣品中隨機選取了30 個視野統(tǒng)計腺毛數(shù)量，每個視野中又隨機選取了3 個腺毛統(tǒng)計其大小，通過計算得出每個視野下腺毛的平均密度及每個腺毛的平均大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然腺毛密度不斷增加，但腺毛大小總體也在增大，這意味著腺毛體積增大的幅度遠大于腺毛密度增加的幅度。筆者觀察到花蕾長7.5～10.0 mm時，腺毛分化基本完成，密度趨于穩(wěn)定，但腺毛大小總體還在不斷增大。腺毛形成后，腺頭顏色逐步加深，提示合成積累的有色次生物質(zhì)不斷增多。觀察發(fā)現(xiàn)，金銀花花蕾腺毛發(fā)育趨勢與腺頭顏色變化趨勢基本一致，表明腺毛發(fā)育與某些次生物質(zhì)的合成積累密切相關(guān)，通過調(diào)控腺毛發(fā)生和發(fā)育可以調(diào)控金銀花藥材質(zhì)量。因此，深入研究金銀花花蕾腺毛發(fā)生機制及其次生物質(zhì)合成積累規(guī)律，可為提高和穩(wěn)定金銀花藥材質(zhì)量提供新的方法和思路。