環(huán)境DNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李 苗,陳小勇

1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049 2 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所遺傳資源與進(jìn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 &云南省高黎貢山生物多樣性與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650201 3 中國(guó)科學(xué)院東南亞生物多樣性研究中心,緬甸內(nèi)比都 05282 4 云南省東南亞生物多樣性保護(hù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,勐臘 666303

在全球變化的大背景之下,生物多樣性銳減是21世紀(jì)人類(lèi)面臨的重要挑戰(zhàn)之一[1]。水生生態(tài)系統(tǒng)作為一種重要的生態(tài)系統(tǒng),其不僅能夠?yàn)槿祟?lèi)提供大量食物、工農(nóng)業(yè)以及生活用水,而且其還具有商業(yè)、航運(yùn)交通以及休閑娛樂(lè)等其他諸多功能,是人類(lèi)社會(huì)快速發(fā)展必不可少的條件[2—3]。然而,由于過(guò)度捕撈、生物入侵、水環(huán)境污染以及生態(tài)位的不斷喪失和改變,全球的水生生物多樣性一直在持續(xù)下降[4]。魚(yú)類(lèi)作為水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一,其對(duì)于物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)以及生態(tài)系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)與穩(wěn)定至關(guān)重要[5]。然而,在長(zhǎng)期高強(qiáng)度的人為干擾下,全球魚(yú)類(lèi)的很大一部分正在迅速地走向滅絕[6]。據(jù)《地球生命力報(bào)告2020》的結(jié)果顯示全球的地球生命力指數(shù)、物種生境指數(shù)以及生物多樣性完整指數(shù)均在持續(xù)下降[7],其中處于生物可持續(xù)水平的魚(yú)類(lèi)種群占比已由1974年的90%下降至2017年的65.8%[8]。為了能夠有效的保護(hù)魚(yú)類(lèi)多樣性,對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行長(zhǎng)期持續(xù)的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。然而,由于傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查方法存在一定的局限性而無(wú)法滿足上述要求,因而尋求一種行之有效的魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)方法迫在眉睫。

近年來(lái),科研人員逐漸意識(shí)到環(huán)境DNA(eDNA)技術(shù)可作為傳統(tǒng)生物監(jiān)測(cè)方法的輔助手段之一,在未來(lái)甚至能夠完全取代傳統(tǒng)方法成為一種常規(guī)化的水生生物監(jiān)測(cè)方法。eDNA是指從水體、沉積物、土壤以及空氣等環(huán)境樣本中獲取到的沒(méi)有預(yù)先被分離的所有生物的總DNA[9—13]。對(duì)于魚(yú)類(lèi)等大型生物而言,從環(huán)境中捕獲到的DNA主要來(lái)源于生物體與環(huán)境之間的相互作用,并通過(guò)皮膚細(xì)胞、毛發(fā)或鱗片的脫落以及代謝廢物排泄的方式將遺傳物質(zhì)釋放到環(huán)境中[12,14]?？蒲腥藛T可對(duì)eDNA進(jìn)行采集,并將其作為物種監(jiān)測(cè)的證據(jù)[15]。相較于傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)方法而言,eDNA技術(shù)具有靈敏度高、經(jīng)濟(jì)高效、省時(shí)省力、采樣受限小以及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)無(wú)干擾等諸多優(yōu)點(diǎn)[16],因而倍受廣大生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域科研人員的青睞。目前,eDNA技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)的研究領(lǐng)域之中,且表現(xiàn)出極大的潛力[17—20]。然而,隨著eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究應(yīng)用中的不斷深入,也暴露出其所存在的一些問(wèn)題與缺陷,例如:(1)eDNA技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中操作流程的不規(guī)范導(dǎo)致不同研究之間的結(jié)果無(wú)法進(jìn)行對(duì)比[21];(2)基因參考數(shù)據(jù)庫(kù)的缺乏導(dǎo)致大量生境中實(shí)際存在的物種無(wú)法被進(jìn)行有效的注釋[22];(3)eDNA被釋放后的生態(tài)學(xué)過(guò)程尚未明確,致使研究結(jié)果中產(chǎn)生假陽(yáng)性與假陰性錯(cuò)誤[23]。上述問(wèn)題的存在不僅揭露了eDNA技術(shù)目前在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)的不足之處,同時(shí)也在一定程度指明了eDNA技術(shù)未來(lái)發(fā)展的方向以及科研工作者應(yīng)該關(guān)注的焦點(diǎn)。

本文將系統(tǒng)的對(duì)eDNA技術(shù)的發(fā)展歷程、分析流程、在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中的研究進(jìn)展以及eDNA技術(shù)目前所面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn)進(jìn)行闡述,并對(duì)eDNA技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向與應(yīng)用前景做出了展望。通過(guò)本文,以期能夠?qū)?guó)內(nèi)eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究中的規(guī)范使用具有指導(dǎo)意義,同時(shí)能夠推動(dòng)eDNA技術(shù)在國(guó)內(nèi)的快速發(fā)展。

1 eDNA技術(shù)簡(jiǎn)介

eDNA這一詞匯最早于1987年被提出,其最初被應(yīng)用于沉積物中環(huán)境微生物學(xué)的研究[24],而其真正得到研究人員的認(rèn)可并被正式應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域卻是在2000年之后[25]。自Ficetola等首次應(yīng)用eDNA技術(shù)對(duì)入侵物種美國(guó)牛蛙Ranacatesbeiana進(jìn)行監(jiān)測(cè)之后[26],eDNA技術(shù)開(kāi)始在水生生態(tài)系統(tǒng)這一研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,其研究對(duì)象幾乎囊括了所有水生生物類(lèi)群,包括魚(yú)類(lèi)[27—29]、兩棲類(lèi)[30—31]、哺乳類(lèi)[32—33]、甲殼類(lèi)[34—35]、水生昆蟲(chóng)[36—37]、微生物[38—39]以及浮游動(dòng)植物[40—42]等。同時(shí),隨著測(cè)序技術(shù)與聚合本酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展,eDNA技術(shù)的應(yīng)用由最初的單物種監(jiān)測(cè)[26]發(fā)展到對(duì)整個(gè)生物群落的監(jiān)測(cè)[43],也由定性監(jiān)測(cè)[26](目標(biāo)種有無(wú)的監(jiān)測(cè))發(fā)展到了定量監(jiān)測(cè)(生物量評(píng)估與豐度監(jiān)測(cè))[44]?？偠灾?eDNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用為水生生物資源的生態(tài)調(diào)查開(kāi)辟了一條新的道路。

2 eDNA技術(shù)的分析流程

eDNA技術(shù)的操作流程主要包括eDNA樣品采集、eDNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序以及結(jié)果分析等主要步驟,具體如圖1所示:

圖1 eDNA技術(shù)的操作流程Fig.1 Operation procedure of eDNA technology eDNA:環(huán)境DNA Environmental DNA;PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Reaction;NGS:二代測(cè)序 Next Generation Sequencing

2.1 eDNA樣品采集

在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中eDNA樣品的采集方式分為主動(dòng)采集與被動(dòng)采集兩種,其中主動(dòng)采集方式包括水樣采集與沉積物樣品采集,而被動(dòng)采集則是在自然水域中尋找那些能夠富集eDNA的生物作為天然的eDNA采樣器。

2.1.1水樣采集與eDNA富集

據(jù)現(xiàn)有的研究表明,eDNA水樣的采集量一般集中在15 ml—10 L,以1 L與2 L最為常見(jiàn)[45],而在具體研究中水樣的采集量通常會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求有所差異。與組織DNA相比,水環(huán)境中的DNA屬于微量,甚至是痕量,所以在水樣采集之后首先要對(duì)水體中的DNA進(jìn)行富集以提高物種的檢出率。關(guān)于eDNA的富集方式,當(dāng)前主要的方法有酒精沉淀法和過(guò)濾法[46],前者主要用于小體積水樣的DNA富集,對(duì)于人造生態(tài)系統(tǒng)的水樣采集較為適合,而后者則主要用于大體積水樣的DNA富集,適合用來(lái)對(duì)河流與海洋等水域開(kāi)闊的自然生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行DNA富集。酒精沉淀法主要是用3 mol/L的醋酸鈉溶液以及無(wú)水乙醇與水樣混合來(lái)進(jìn)行DNA富集[47],而過(guò)濾法則是利用過(guò)濾裝置對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾將DNA截留在濾膜上以達(dá)到富集的效果[46],在過(guò)濾過(guò)程中濾膜的合理選用至關(guān)重要。然而,由于不同研究人員具有不同的研究目的與研究對(duì)象,在利用過(guò)濾法進(jìn)行DNA富集時(shí)所選取的濾膜也不盡相同。就目前現(xiàn)有的研究可知,在進(jìn)行eDNA富集時(shí)研究人員最為常用的濾膜為玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、聚碳酸酯膜、混合纖維膜以及尼龍膜,而最為常見(jiàn)的濾膜孔徑則為0.45 μm與1.2 μm兩種[48]。為了能夠使研究結(jié)果更加精確,作者建議在具體的研究中研究人員應(yīng)該針對(duì)自己的研究對(duì)象對(duì)水樣的采集量以及eDNA富集方法進(jìn)行篩選,以達(dá)到最佳的效果。

2.1.2沉積物樣品采集

eDNA沉積物樣品的采集方案應(yīng)該根據(jù)水深、底質(zhì)類(lèi)型以及目標(biāo)生物類(lèi)群而定[49]。對(duì)于以魚(yú)類(lèi)為目標(biāo)類(lèi)群的研究而言,表層沉積物樣品的采樣量一般集中在0.25—10 g[50],采樣設(shè)備的選用則根據(jù)生態(tài)系統(tǒng)的類(lèi)型有所不同,其中對(duì)于大型河流和深度為幾百米以內(nèi)淺海的沉積物樣品一般選用抓斗進(jìn)行采樣[51—52],而對(duì)于湖泊和深海等底質(zhì)較為松軟的沉積物樣品則利用巖芯進(jìn)行采樣[53—54]。此外,由于沉積物中DNA的混合不均勻,通常還需要在采樣點(diǎn)所在的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行子樣本的采集[55]。

2.1.3eDNA的被動(dòng)采集

由于eDNA的主動(dòng)采集方式往往需要科研人員在野外花費(fèi)大量的時(shí)間采集樣品,為了能夠節(jié)省野外調(diào)查的時(shí)間,相關(guān)研究人員開(kāi)始嘗試從自然界中尋找天然的eDNA富集器或者設(shè)計(jì)富集能力很強(qiáng)的特殊材料來(lái)完成eDNA的被動(dòng)采樣,諸如在海洋生態(tài)系統(tǒng)中以海綿作為純天然的海水過(guò)濾器,通過(guò)采集海綿來(lái)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)生態(tài)調(diào)查[56—58],更有甚者是利用3D打印的羥基磷灰石作為DNA富集器將其置于采樣點(diǎn)處來(lái)完成eDNA的被動(dòng)采樣[59]。然而,上述被動(dòng)采樣的方式雖然在一定程度上節(jié)省了時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本,但關(guān)于其在具體科學(xué)問(wèn)題的解決方面是否合理有效還有待進(jìn)一步的證實(shí)。

2.2 eDNA的提取

鑒于eDNA樣品成分復(fù)雜且含有較多的雜質(zhì),為了能夠提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)物種的檢出率,如何從樣品中提取出高質(zhì)量的DNA至關(guān)重要。在eDNA技術(shù)應(yīng)用到水生生態(tài)系統(tǒng)研究領(lǐng)域的初期,傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法以及各種商業(yè)化的試劑盒均被應(yīng)用于eDNA的提取,但提取效果參差不齊,而后有研究人員專(zhuān)門(mén)對(duì)常用的幾種商業(yè)化試劑盒與酚-氯仿-異戊醇法提取水環(huán)境中eDNA的效果做了對(duì)比,發(fā)現(xiàn)使用商業(yè)化的試劑盒能夠提取更高質(zhì)量的eDNA[46]。目前最新的研究中基本上采用商業(yè)化的試劑盒來(lái)進(jìn)行eDNA的提取,其中提取水樣eDNA使用較多的試劑盒為DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN)與Mo Bio Power Water DNA Extraction Kit兩種[46,60],而提取沉積物樣品eDNA使用較多的試劑盒主要為DNeasy PowerSoil DNA Isolation Kit (QIAGEN)與DNeasy PowerMax Soil Kit (QIAGEN)兩種[49,50]。

2.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

PCR引物的設(shè)計(jì)和DNA條形碼區(qū)段的選擇在eDNA技術(shù)的應(yīng)用中也是至關(guān)重要的一環(huán),這對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性具有決定性的作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?通?？梢苑譃槟繕?biāo)物種的特異性監(jiān)測(cè)和某特定生物類(lèi)群的多樣性監(jiān)測(cè)。特異性監(jiān)測(cè)主要是針對(duì)某一特定的物種設(shè)計(jì)特異性極強(qiáng)的引物從而能夠在PCR過(guò)程中只擴(kuò)增該物種的基因序列而不會(huì)擴(kuò)增其他親緣物種的基因序列,多樣性監(jiān)測(cè)則是針對(duì)某特定的生物類(lèi)群設(shè)計(jì)通用性引物,要求能夠盡可能多的覆蓋該生物類(lèi)群的基因序列。目前常用的引物設(shè)計(jì)軟件主要有Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、PrimerHunter以及Primer Express等[61—62],引物設(shè)計(jì)在線網(wǎng)站主要有NCBI Primer-Blast、Primer3 Plus、Bath Primer、The PCR Suit、Primerbank 以及PrimerX等。

目前研究人員選取的條形碼區(qū)段主要集中在線粒體上,主要原因在于與細(xì)胞核DNA(nDNA)相比,線粒體DNA(mtDNA)具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)[63]:(1)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中含有大量的mtDNA基因序列數(shù)據(jù),有利于進(jìn)行eDNA的序列比對(duì);(2)細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)要遠(yuǎn)高于nDNA的拷貝數(shù);(3)mtDNA相對(duì)保守,含有更多的能夠進(jìn)行物種鑒定的高變區(qū)以及易于設(shè)計(jì)通用引物的保守區(qū)。關(guān)于mtDNA目的基因的選擇最常見(jiàn)的主要有(表1)細(xì)胞色素c氧化酶亞基I (COI) 基因[80—81]、細(xì)胞色素b (Cytb) 基因[82—83]、12s核糖體RNA(12s rRNA)基因[22,84]以及16s核糖體RNA(16s rRNA)基因[85—86]等,而具體在研究中該選擇哪個(gè)基因作為目標(biāo)基因則取決于研究所選取生物類(lèi)群的特征。同時(shí),引物的選擇對(duì)eDNA監(jiān)測(cè)的結(jié)果也具有一定的影響,例如Zhang等通過(guò)Silico PCR的方法比較了22對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)的通用引物并將其用于北京市的河流水樣中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)12s rRNA區(qū)段的引物能夠監(jiān)測(cè)到的魚(yú)類(lèi)多樣性要優(yōu)于其他基因區(qū)段的引物[87]。此外,Shu等類(lèi)似的研究也證實(shí)了上述觀點(diǎn)[88]。因此,在選擇PCR擴(kuò)增所用的引物時(shí)要遵循以下3個(gè)原則:(1)由于eDNA降解嚴(yán)重,因而引物擴(kuò)增的片段不宜過(guò)長(zhǎng),要保證能夠盡可能多的回收樣品中的DNA[89—90];(2)所選擇的引物要保證具有良好的擴(kuò)增效果,既要能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目標(biāo)類(lèi)群,同時(shí)又不會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增[91—92];(3)所選擇引物擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域最好能夠具有完善的基因參考數(shù)據(jù)庫(kù),能夠使盡可能多的測(cè)序數(shù)據(jù)被注釋到種的水平[93]。

表1 環(huán)境DNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)中常用的通用引物Table 1 Universal primers commonly used in environmental DNA technology for fish monitoring

2.4 測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

在應(yīng)用eDNA技術(shù)進(jìn)行單物種監(jiān)測(cè)時(shí),PCR產(chǎn)物用傳統(tǒng)的一代測(cè)序即可,而在用宏條形碼進(jìn)行物種多樣性監(jiān)測(cè)時(shí),往往用高通量測(cè)序(NGS)更為合適,主要原因在于高通量測(cè)序速度快、數(shù)據(jù)量大且準(zhǔn)確性高。目前,eDNA研究領(lǐng)域中應(yīng)用的高通量測(cè)序主要為擴(kuò)增子測(cè)序,應(yīng)用較多的測(cè)序平臺(tái)主要為Illumina Miseq、Illumina Hiseq、Illumina NextSeq以及Roche GS FLX 454等[47,94—96]。

測(cè)序之后就是對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,一代測(cè)序的數(shù)據(jù)在NCBI上進(jìn)行比對(duì)即可確定目標(biāo)種的有無(wú),高通量測(cè)序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)處理則較為復(fù)雜,其主要流程包括質(zhì)量控制、過(guò)濾、分子可操作分類(lèi)單元(MOTU)聚類(lèi)以及對(duì)代表性MOTU序列進(jìn)行BLAST比對(duì)和物種注釋(圖2)。目前測(cè)序數(shù)據(jù)處理的主流軟件主要有Mothur[97]、OBITools[87]、Usearch[98]、Vsearch[99]、PhyloPythia[100]、Cutadapt[95]、QIIME[101]以及QIIME 2[102]等。通常來(lái)說(shuō),對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析要求科研人員具有一定的編程基礎(chǔ),但為了方便那些無(wú)編程背景的科研人員,生物公司通常開(kāi)發(fā)了高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理的生物信息云計(jì)算平臺(tái),例如MiFish Pipeline (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/)魚(yú)類(lèi)多樣性在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)等[103]。

圖2 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析流程Fig.2 Analysis process of sequencing dataMOTU:分子可操作分類(lèi)單元Molecular Operational Taxonomic Units

3 eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

自eDNA技術(shù)被引入水生生態(tài)系統(tǒng)的研究領(lǐng)域以來(lái),在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。目前,eDNA技術(shù)主要被用來(lái)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)的目標(biāo)物種監(jiān)測(cè)、生物量評(píng)估、多樣性監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)、繁殖活動(dòng)監(jiān)測(cè)、種群遺傳分析以及攝食生態(tài)等方面的研究[23,104]。在本部分,將以eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的4個(gè)方向展開(kāi)論述。

3.1 目標(biāo)物種監(jiān)測(cè)

精確地掌握目標(biāo)物種的空間分布與豐度情況對(duì)研究物種的生態(tài)習(xí)性與制定相關(guān)的保護(hù)政策至關(guān)重要[105]。對(duì)于魚(yú)類(lèi)等水生生物而言,其所生存的環(huán)境在一定程度上增加了物種監(jiān)測(cè)的困難性[48],尤其是針對(duì)那些種群密度極小物種的調(diào)查,諸如隱存種、瀕危種、稀有種以及處于入侵早期的入侵種。同時(shí),由于傳統(tǒng)方法往往很難捕獲到密度極小的種群,從而無(wú)法精確地掌握其種群動(dòng)態(tài)。鑒于上述原因,科研人員嘗試?yán)胑DNA技術(shù)進(jìn)行極小密度種群的監(jiān)測(cè)。目前,eDNA技術(shù)在極小密度種群監(jiān)測(cè)應(yīng)用中的成功案例主要有入侵魚(yú)類(lèi)與珍惜瀕危魚(yú)類(lèi)的監(jiān)測(cè)兩個(gè)方面。

生物入侵是生物多樣性喪失和全球同質(zhì)化的主要原因之一[106—107]。一旦入侵成功,入侵種會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)、林業(yè)、漁業(yè)、電力生產(chǎn)以及貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,進(jìn)而造成當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的大量損失[108]。為了能夠有效地遏制生物入侵,最佳的解決辦法便是在入侵種尚未形成較大種群時(shí)就將其消除[107]。Nakao等利用eDNA技術(shù)對(duì)5個(gè)大壩庫(kù)區(qū)的大口黑鱸Micropterussalmoides、小口黑鱸Micropterusdolomieu以及藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)Lepomismacrochirus這3種入侵魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了監(jiān)測(cè),結(jié)果表明eDNA技術(shù)可以被作為一種生物入侵監(jiān)測(cè)的工具,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題,例如該技術(shù)在一些eDNA濃度較低的采樣點(diǎn)靈敏度較低[19]。因此,未來(lái)在用eDNA技術(shù)進(jìn)行入侵種的監(jiān)測(cè)時(shí),尚有許多難題需要攻克。

珍稀瀕危魚(yú)類(lèi)通常因其極小的種群密度而難以用傳統(tǒng)的調(diào)查方法對(duì)其種群動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)[107],而掌握其種群的分布與豐度狀況對(duì)于保護(hù)策略的制定至關(guān)重要[109]。許多珍稀瀕危物種自種群數(shù)量急劇下降之后便很難用傳統(tǒng)的方法對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè),這為科研人員的工作帶來(lái)了極大的困難,eDNA技術(shù)的出現(xiàn)則使上述情況出現(xiàn)了轉(zhuǎn)機(jī)。Cardás等利用eDNA技術(shù)對(duì)西班牙北部納隆河和薩拉河的歐洲鰻鱺Anguillaanguilla進(jìn)行了監(jiān)測(cè)[110],證實(shí)了eDNA在瀕危魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)方面的潛力。此外,Budd等利用eDNA技術(shù)對(duì)美國(guó)關(guān)島西太平洋海域的路氏雙髻鯊Sphyrnalewini進(jìn)行了監(jiān)測(cè),并建立了相關(guān)的監(jiān)測(cè)體系,其中特別值得關(guān)注的是基于傳統(tǒng)方法的調(diào)查自1970年開(kāi)始便再未捕獲到路氏雙髻鯊[111]。由此可見(jiàn),eDNA技術(shù)是一種強(qiáng)有力的珍稀瀕危魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)工具。

3.2 生物量評(píng)估

生物量是生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中重要的基礎(chǔ)生物學(xué)參數(shù)之一[112],準(zhǔn)確地評(píng)估生物量對(duì)于種群大小的管理[113—114]、自然資源的保護(hù)[115]、生態(tài)系統(tǒng)的功能與服務(wù)[116]以及生態(tài)交互作用[117]具有十分重要的意義。自上個(gè)世紀(jì)以來(lái),有關(guān)動(dòng)物種群生物量評(píng)估方法的研究一直是科研人員與政策制定者所關(guān)注的焦點(diǎn)[118]。然而,對(duì)于魚(yú)類(lèi)等水生生物類(lèi)群而言,準(zhǔn)確的評(píng)估其生物量是十分困難的[112]。同時(shí),現(xiàn)有的評(píng)估方法通常成本高昂、耗時(shí)耗力且對(duì)于種群數(shù)量極小的物種無(wú)法開(kāi)展有效的工作[119—120]。為了解決上述問(wèn)題帶來(lái)的困擾,Takahara等首次提出利用eDNA技術(shù)來(lái)評(píng)估魚(yú)類(lèi)的生物量,并將該技術(shù)應(yīng)用到了鯉Cyprinuscarpio的生物量評(píng)估中,其原理主要是尋找魚(yú)類(lèi)釋放到水環(huán)境中的eDNA的濃度與魚(yú)類(lèi)生物量之間的關(guān)系,進(jìn)而建立相應(yīng)的生物量評(píng)估模型[112]。自此之后,利用eDNA技術(shù)探究魚(yú)類(lèi)生物量的研究日益增多。為了摸清魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)對(duì)eDNA技術(shù)進(jìn)行生物量評(píng)估的影響,Mizumoto等以日本北部的瀕危物種遠(yuǎn)東哲羅鮭Parahuchoperryi為研究對(duì)象,探究了由不同生長(zhǎng)階段的遠(yuǎn)東哲羅魚(yú)組成的魚(yú)群釋放eDNA的濃度與其生物量之間的關(guān)系,結(jié)果表明在魚(yú)類(lèi)生物量恒定的情況下,不同規(guī)格的魚(yú)所組成的魚(yú)群釋放的DNA的濃度是相等的[121]。然而,以往在自然水域中進(jìn)行的研究,結(jié)果通常顯示eDNA的濃度與生物量之間的相關(guān)性并不是很強(qiáng)[119]。為了能夠進(jìn)一步提高利用eDNA技術(shù)進(jìn)行生物量評(píng)估結(jié)果的精確性, Fukaya等提出在利用eDNA評(píng)估魚(yú)類(lèi)生物量時(shí)應(yīng)充分考慮eDNA時(shí)空分布形成的機(jī)制,并以日本竹筴魚(yú)Trachurusjaponicus為研究對(duì)象證實(shí)了只有在某些特定的假設(shè)條件下才能夠利用廣義線性模型來(lái)準(zhǔn)確地評(píng)估魚(yú)類(lèi)的種群數(shù)量[122]。但時(shí)至今日,關(guān)于eDNA在水環(huán)境中動(dòng)態(tài)變化的情況尚無(wú)定論,而這始終是阻礙利用eDNA技術(shù)評(píng)估魚(yú)類(lèi)生物量的一大障礙。因此,在未來(lái)一段時(shí)間內(nèi),如何利用eDNA技術(shù)精確地評(píng)估魚(yú)類(lèi)的生物量仍是該領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題之一。

3.3 生物多樣性監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)

生物多樣性是衡量物種豐富程度的重要指標(biāo)之一,而生物多樣性調(diào)查則是開(kāi)展生物多樣性評(píng)價(jià)的重要基礎(chǔ)性工作,如何獲取精確的調(diào)查數(shù)據(jù)將會(huì)對(duì)后續(xù)的研究工作產(chǎn)生重要的影響。傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)多樣性調(diào)查方法主要依賴(lài)于魚(yú)類(lèi)標(biāo)本的采集,諸如底拖網(wǎng)、圍網(wǎng)、流刺網(wǎng)、地籠以及電捕魚(yú)法等,但上述方法往往具有一定的選擇性,不能夠全面系統(tǒng)地對(duì)研究區(qū)域內(nèi)的魚(yú)類(lèi)多樣性做出精確的評(píng)價(jià)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,Thomsen等開(kāi)創(chuàng)性地應(yīng)用eDNA技術(shù)對(duì)丹麥海域的魚(yú)類(lèi)多樣性進(jìn)行了調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了15種魚(yú)類(lèi),其中包括一罕見(jiàn)種——?dú)W洲沙丁魚(yú)Sardinapilchardus。同時(shí),為了驗(yàn)證eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)多樣性監(jiān)測(cè)方面的效率,Thomsen等還將eDNA調(diào)查的結(jié)果與9種傳統(tǒng)調(diào)查方法的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比,表明利用eDNA監(jiān)測(cè)到的魚(yú)類(lèi)物種數(shù)高于或者等于傳統(tǒng)方法,證實(shí)了eDNA在魚(yú)類(lèi)多樣性調(diào)查方面具有極大的潛力[47]。此后,利用eDNA進(jìn)行魚(yú)類(lèi)多樣性調(diào)查的相關(guān)研究日益增多[65—66]。

在利用eDNA技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)多樣性研究的初期,研究人員最為關(guān)注的是eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)方面的能力,相關(guān)研究的主題主要是利用eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)方法同時(shí)對(duì)某特定研究區(qū)域內(nèi)的魚(yú)類(lèi)多樣性進(jìn)行調(diào)查,進(jìn)而驗(yàn)證eDNA技術(shù)是否可被用來(lái)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)多樣性的調(diào)查[47]。在經(jīng)過(guò)大量研究的證實(shí)之后,eDNA技術(shù)逐漸開(kāi)始被用來(lái)解決具體的科學(xué)問(wèn)題,例如魚(yú)類(lèi)群落時(shí)空分布的動(dòng)態(tài)變化[123—124]、魚(yú)類(lèi)群落中各物種相對(duì)豐度的情況[66,125]、魚(yú)類(lèi)群落的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[126]以及功能多樣性[127—128]等。然而,生物多樣性監(jiān)測(cè)的目的是為了進(jìn)行生物多樣性評(píng)價(jià)。為了得到準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)結(jié)果,如何選擇合適的評(píng)價(jià)指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)尤為重要[129—130]。盡管基于eDNA技術(shù)的監(jiān)測(cè)方法能夠提供比傳統(tǒng)方法更多的可用于生物多樣性評(píng)價(jià)的信息[131],但目前尚未有一套基于eDNA技術(shù)的生物多樣性評(píng)價(jià)體系。未來(lái)要想將基于eDNA技術(shù)的方法整合到現(xiàn)有的生物多樣性監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)體系中,還需要從國(guó)家與國(guó)際的層面來(lái)采取行動(dòng)以制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)[131]。

3.4 魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)監(jiān)測(cè)

精確地掌握魚(yú)類(lèi)產(chǎn)卵的時(shí)間與場(chǎng)所有助于人類(lèi)更加清楚地認(rèn)識(shí)魚(yú)類(lèi)的繁殖習(xí)性、準(zhǔn)確地評(píng)估魚(yú)類(lèi)種群的繁殖力,進(jìn)而能夠針對(duì)當(dāng)前的資源狀況制定相關(guān)的開(kāi)發(fā)利用與保護(hù)策略。然而,當(dāng)前在魚(yú)類(lèi)早期資源調(diào)查中所用到的調(diào)查方法通常會(huì)導(dǎo)致受精卵與仔稚魚(yú)死亡率的升高,進(jìn)而會(huì)對(duì)受威脅種與稀有種的種群繁殖造成極大的傷害。鑒于上述原因的考慮,相關(guān)科研人員嘗試?yán)胑DNA技術(shù)來(lái)探究魚(yú)類(lèi)產(chǎn)卵的時(shí)間與場(chǎng)所。Bylemans等利用eDNA技術(shù)對(duì)澳洲麥?zhǔn)削|Macquariaaustralasica的產(chǎn)卵時(shí)間與場(chǎng)所進(jìn)行了調(diào)查,研究發(fā)現(xiàn)在繁殖期水體中nDNA的量要顯著高于mtDNA的量,而在其他時(shí)期nDNA的量與mtDNA的量大致相等。因此,可以根據(jù)棲息環(huán)境中魚(yú)類(lèi)nDNA與mtDNA相對(duì)豐度的變化來(lái)識(shí)別產(chǎn)卵時(shí)間與場(chǎng)所[69]。Bracken等以海七鰓鰻Petromyzonmarinus為研究對(duì)象,利用qPCR對(duì)愛(ài)爾蘭境內(nèi)2條河流中固定點(diǎn)位eDNA的時(shí)空分布進(jìn)行了連續(xù)3年的監(jiān)測(cè),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在海七鰓鰻的繁殖期,河流中eDNA的濃度將會(huì)顯著升高,表明eDNA技術(shù)可以被用來(lái)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)的監(jiān)測(cè)[132]。此外,還有大量類(lèi)似的研究同樣支持利用eDNA技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)的監(jiān)測(cè)[133—135]。

盡管目前已有大量研究利用eDNA技術(shù)對(duì)魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)進(jìn)行了監(jiān)測(cè),并證明eDNA技術(shù)在該方面具有一定的潛力,但其在實(shí)際應(yīng)用中仍存在些許問(wèn)題。就當(dāng)前利用eDNA技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)監(jiān)測(cè)的研究而言,所選取的研究對(duì)象多為人類(lèi)已熟知其生活習(xí)性并掌握了其繁殖時(shí)間的物種,從而能夠使科研人員根據(jù)已掌握的情況結(jié)合eDNA量的變化來(lái)推斷魚(yú)類(lèi)的產(chǎn)卵活動(dòng),而對(duì)那些生活習(xí)性沒(méi)有被人類(lèi)所掌握的魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō),則無(wú)法使用該方法來(lái)進(jìn)行判斷。因此,未來(lái)應(yīng)著重探究在尚未熟知魚(yú)類(lèi)生態(tài)習(xí)性的背景下如何利用eDNA技術(shù)精確地識(shí)別魚(yú)類(lèi)的繁殖時(shí)間與繁殖場(chǎng)所。

4 eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中面臨的挑戰(zhàn)

應(yīng)用eDNA技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)調(diào)查的主要目的是為了能夠精確的掌握某特定研究區(qū)域內(nèi)魚(yú)類(lèi)資源的狀況[79],從而解決一些具體的科學(xué)問(wèn)題。因此,為了能夠保證eDNA研究結(jié)果的精確性,闡明影響eDNA研究結(jié)果精確性的因素至關(guān)重要[136]。目前,eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用中產(chǎn)生的錯(cuò)誤主要有假陽(yáng)性與假陰性兩種類(lèi)型,而造成上述錯(cuò)誤的主要原因來(lái)自于eDNA釋放到環(huán)境中之后的一系列生態(tài)學(xué)過(guò)程以及eDNA分析流程中的各個(gè)方面。鑒于此,為了能夠使科研人員在應(yīng)用eDNA技術(shù)的過(guò)程中盡量避免假陽(yáng)性與假陰性錯(cuò)誤的產(chǎn)生,本部分將針對(duì)造成eDNA研究結(jié)果中各類(lèi)錯(cuò)誤的原因展開(kāi)詳細(xì)的論述并提出可能的解決方案。

4.1 eDNA技術(shù)操作流程的標(biāo)準(zhǔn)化

隨著eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)的日益流行,尋求一套能夠使研究結(jié)果最佳的eDNA技術(shù)操作流程與實(shí)驗(yàn)方案已成為科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[137—138]。當(dāng)前已有研究表明,水樣采集量、eDNA的富集與提取方法、PCR擴(kuò)增目的基因的選擇等均會(huì)對(duì)研究結(jié)果的精確性產(chǎn)生影響[27,46,139]。同時(shí),也有大量研究對(duì)eDNA技術(shù)的操作流程進(jìn)行了優(yōu)化,但現(xiàn)有的研究更多的是針對(duì)某些特定的生物類(lèi)群以及研究區(qū)域所做出的優(yōu)化,在一定程度上不具有普適性,從而也就使不同區(qū)域的研究結(jié)果無(wú)法進(jìn)行相應(yīng)的對(duì)比[21,48]。為了能夠在更大尺度上使利用eDNA技術(shù)調(diào)查獲得的數(shù)據(jù)具有可比較性,同時(shí)能夠使政策制定者在相應(yīng)政策的制定上不做出誤判,eDNA技術(shù)的應(yīng)用必須規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化[21]。目前,歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)已經(jīng)在討論制定歐盟成員國(guó)在使用eDNA技術(shù)進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題[140],日本也成立了專(zhuān)門(mén)的eDNA學(xué)會(huì)并編寫(xiě)了一本eDNA技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的研究手冊(cè)[21]—“Environmental DNA Sampling and Experiment Manual” (http://ednasociety.org/en/manual)。然而,目前國(guó)內(nèi)關(guān)于eDNA領(lǐng)域的研究日益增多,但不同單位的科研人員在采樣以及實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)等方面存在諸多差異,這將使不同研究之間結(jié)果的精確性無(wú)法被進(jìn)行準(zhǔn)確地評(píng)估。因此,為了能夠使eDNA技術(shù)在國(guó)內(nèi)廣泛的正確使用,政府部門(mén)應(yīng)該盡快出臺(tái)相應(yīng)的研究手冊(cè),以確保在全國(guó)范圍內(nèi)使用eDNA技術(shù)獲取的生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)能夠具有良好的對(duì)比性。

針對(duì)上述eDNA技術(shù)分析流程標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)題,相關(guān)部門(mén)在編寫(xiě)eDNA研究手冊(cè)時(shí)應(yīng)著重考慮樣品采集、DNA富集與提取、PCR擴(kuò)增以及后續(xù)的生物信息學(xué)分析等方面標(biāo)準(zhǔn)的制定。目前,已有不少研究專(zhuān)門(mén)針對(duì)eDNA技術(shù)的分析流程進(jìn)行了優(yōu)化,相關(guān)研究結(jié)果可作為eDNA技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的參考依據(jù)[46,55,141—142]。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的整理即可發(fā)現(xiàn)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)研究領(lǐng)域中eDNA樣品的采集應(yīng)以水樣采集為主,水樣采集地點(diǎn)要盡可能覆蓋各種生境類(lèi)型,水樣的采集量則以1 L或2 L為最佳且每個(gè)采樣點(diǎn)至少采集3個(gè)平行樣本[94,143]。關(guān)于eDNA的富集方法一般推薦使用過(guò)濾的方法將DNA截留在濾膜上,而濾膜材質(zhì)與孔徑的選擇則主要傾向于0.45 μm的玻璃纖維濾膜[141]。富集之后則需要對(duì)eDNA進(jìn)行提取,就eDNA的提取而言當(dāng)前主要推薦使用商業(yè)化的試劑盒,其中提取效果較好的試劑盒主要為Qiagen′s DNeasy Blood &Tissue Kit與Mo Bio Power Water DNA Extraction Kit兩種[46,60]。eDNA提取之后PCR擴(kuò)增測(cè)序過(guò)程中需要標(biāo)準(zhǔn)化的主要是引物的選取,當(dāng)前在關(guān)于引物的選用方面較為推薦使用12s rRNA基因的通用引物[87,88]。測(cè)序之后需要標(biāo)準(zhǔn)化的則為生物信息學(xué)分析流程,盡管目前已有大量用于生信分析的軟件,但不同軟件在算法上存在諸多差異,未來(lái)最好能夠開(kāi)發(fā)出一套專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)eDNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理的軟件與分析流程[144]。相信通過(guò)對(duì)eDNA技術(shù)的分析流程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后,將能夠使eDNA研究結(jié)果的精確性得到極大的提升。

4.2 參考數(shù)據(jù)庫(kù)的缺乏

在eDNA技術(shù)成為主流的魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查方法之前,尚有許多方法論上的困難需要克服[65],其中之一便是DNA序列參考數(shù)據(jù)庫(kù)的不完全以及現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)中存在諸多錯(cuò)誤信息[22]。目前,eDNA研究中常用的公共參考數(shù)據(jù)庫(kù)主要有NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL)(http://www.ebi.ac.uk/embl)、生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(BOLD)(http://v4.boldsystems.org)、漁業(yè)生物條形碼計(jì)劃在線數(shù)據(jù)庫(kù)(FISH-BOL)(http://www.fishbol.org)以及日本的魚(yú)類(lèi)線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(MitoFish)(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp)等。然而,鑒于上述數(shù)據(jù)庫(kù)中大量錯(cuò)誤信息的存在與魚(yú)類(lèi)12s rRNA基因序列的極度匱乏,科研人員逐漸意識(shí)到建立本土魚(yú)類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的重要性,且現(xiàn)已有相關(guān)研究證明相較于公共數(shù)據(jù)庫(kù)而言,本土魚(yú)類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)能提供更加精確的物種分類(lèi)注釋信息,對(duì)eDNA研究結(jié)果精確性的提高具有十分重要的意義[31,145]。

為了解決上述數(shù)據(jù)庫(kù)不完全的問(wèn)題,科研人員在利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查時(shí)應(yīng)盡可能廣泛地收集構(gòu)建魚(yú)類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)所需的魚(yú)類(lèi)組織材料,以確保構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)能夠在最大程度上涵蓋某海域或流域的魚(yú)類(lèi)物種信息。同時(shí),為了保障數(shù)據(jù)庫(kù)的精確性,數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)包含每個(gè)魚(yú)類(lèi)物種的樣品采集信息、分類(lèi)鑒定信息以及DNA條形碼信息,尤其是對(duì)于那些形態(tài)學(xué)上較難辨認(rèn)的物種要格外注意。此外,關(guān)于數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中條形碼擴(kuò)增片段的選擇方面,作者建議最好能夠建立魚(yú)類(lèi)線粒體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以滿足不同研究的需求,即便是出于成本的考慮只能構(gòu)建單基因片段的數(shù)據(jù)庫(kù),那么也應(yīng)該建立能夠覆蓋該目的基因全部序列的長(zhǎng)片段DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)[23]。盡管擁有一個(gè)盡可能完善且精確的本土魚(yú)類(lèi)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)將能夠極大地提高eDNA研究結(jié)果的精確性,但本土數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)也存在一個(gè)嚴(yán)重的缺陷——物種的覆蓋度較低,這說(shuō)明在研究中如果僅使用本土數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種的分類(lèi)注釋,將無(wú)法檢測(cè)到數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未涵蓋的某些處于入侵早期的魚(yú)類(lèi)物種信息[144],從而也會(huì)對(duì)研究結(jié)果的精確性產(chǎn)生一定的影響。因此,為了能夠取得最佳的研究效果,在進(jìn)行高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的物種分類(lèi)注釋時(shí)最好能夠同時(shí)利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)與本土數(shù)據(jù)庫(kù)。

4.3 eDNA被釋放后生態(tài)學(xué)過(guò)程的探究

eDNA的生態(tài)學(xué)過(guò)程(圖3)主要包括eDNA在環(huán)境中的來(lái)源、狀態(tài)、遷移以及最終的結(jié)局[146]。eDNA的生態(tài)是一系列物理、化學(xué)以及生物相互作用的過(guò)程,在此過(guò)程中影響eDNA監(jiān)測(cè)結(jié)果精確性的因素主要包括各類(lèi)生物因素與非生物因素。

圖3 eDNA的生態(tài)Fig.3 The ecology of eDNA

魚(yú)類(lèi)群落中種群數(shù)量的大小、所處的生活史階段、新陳代謝狀況、捕食者的存在以及各類(lèi)洄游等均會(huì)影響環(huán)境中可檢測(cè)的eDNA信號(hào)強(qiáng)度[23]。Maruyama等設(shè)計(jì)室內(nèi)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)由于代謝活動(dòng)方面的差異,幼魚(yú)較成魚(yú)有更高的eDNA釋放率[147]。然而,在自然水域中魚(yú)類(lèi)種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜且利用eDNA技術(shù)無(wú)法判別種群結(jié)構(gòu)信息,這將導(dǎo)致利用eDNA技術(shù)無(wú)法準(zhǔn)確地推算魚(yú)類(lèi)種群的生物量。此外,Jo等發(fā)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)生物量的大小也會(huì)影響eDNA的釋放效率[148],而魚(yú)類(lèi)的集群以及各種類(lèi)型的洄游往往會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)種群生物量的驟增,這也會(huì)對(duì)eDNA監(jiān)測(cè)結(jié)果的精確性產(chǎn)生一定的干擾。因此,為了能夠使eDNA技術(shù)的監(jiān)測(cè)結(jié)果更具說(shuō)服力,在后期的研究中加強(qiáng)魚(yú)類(lèi)eDNA釋放速率方面的研究十分必要。

除上述生物因素外,環(huán)境中的非生物因素也會(huì)嚴(yán)重影響eDNA的監(jiān)測(cè)結(jié)果。據(jù)當(dāng)前的研究表明,影響魚(yú)類(lèi)eDNA監(jiān)測(cè)效率的非生物因素主要包括水溫、pH、紫外光照、鹽度、渾濁度以及水文條件等,例如Strickler等探究了紫外光照、溫度以及pH對(duì)eDNA在水體中存留時(shí)間的影響,并發(fā)現(xiàn)eDNA在黑暗、低溫且偏堿性的水環(huán)境中能夠存留的時(shí)間更久[15],而Diaz-Ferguson和Moyer則發(fā)現(xiàn)水文條件的變化會(huì)影響eDNA在水環(huán)境中的分布情況[149]。盡管目前已有大量關(guān)于非生物因素對(duì)eDNA監(jiān)測(cè)結(jié)果影響的方面的研究,但基本上是基于室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)且在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中僅考慮了部分環(huán)境因子對(duì)eDNA生態(tài)的影響,這與自然水體中eDNA生態(tài)的真實(shí)情況還存在一定的差距。因此,探究所有對(duì)eDNA的生態(tài)有影響的非生物因子如何綜合影響eDNA的研究結(jié)果將是科研人員未來(lái)應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注的方向。

針對(duì)上述eDNA在環(huán)境中的生態(tài)學(xué)過(guò)程會(huì)對(duì)研究結(jié)果精確性產(chǎn)生影響這一問(wèn)題,作者建議在后期的研究中應(yīng)充分發(fā)揮多學(xué)科交叉融合研究的作用,綜合運(yùn)用各種生態(tài)學(xué)以及水文學(xué)模型進(jìn)一步闡明eDNA的生態(tài)學(xué)過(guò)程。此外,研究人員在具體的研究中應(yīng)充分考慮eDNA的生態(tài)學(xué)過(guò)程可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果所帶來(lái)的影響,并在前期的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與后期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋時(shí)將其納入[136,146],從而將eDNA的生態(tài)學(xué)過(guò)程對(duì)研究結(jié)果精確性的影響降至最低。

5 總結(jié)及前景展望

自eDNA技術(shù)被引入水生生態(tài)系統(tǒng)的研究領(lǐng)域以來(lái),經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展其已經(jīng)成為了一種強(qiáng)有力的魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查手段。目前,eDNA技術(shù)已經(jīng)在物種監(jiān)測(cè)、魚(yú)類(lèi)多樣性監(jiān)測(cè)、生物量評(píng)估以及魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)監(jiān)測(cè)等方面得到了廣泛的應(yīng)用且表現(xiàn)出極大的潛力。同時(shí),相較于傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)方法而言,eDNA技術(shù)在監(jiān)測(cè)效率、時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本以及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的干擾等方面更具優(yōu)勢(shì)。然而,由于eDNA技術(shù)在操作流程上的不規(guī)范、物種注釋參考數(shù)據(jù)庫(kù)的不完善以及eDNA被釋放進(jìn)入環(huán)境之后生態(tài)學(xué)過(guò)程的不明確等原因,科研人員在應(yīng)用eDNA技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)時(shí)所得研究結(jié)果的精確性將會(huì)受到一定的影響。因此,未來(lái)要想使eDNA技術(shù)能夠成為一種替代傳統(tǒng)方法的常規(guī)化魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)手段還需要克服很多困難。

在本文中,綜述了eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀,同時(shí)對(duì)eDNA在具體應(yīng)用中所面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn)做了相關(guān)總結(jié),并提出了相應(yīng)的解決方案。最終,通過(guò)對(duì)eDNA技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中相關(guān)文獻(xiàn)的梳理可發(fā)現(xiàn),在未來(lái)的研究中要想使eDNA調(diào)查得出的結(jié)果具有更高的可信度,科研人員應(yīng)聚焦于以下幾個(gè)方面:(1)不斷完善魚(yú)類(lèi)mtDNA 12s rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。當(dāng)前利用eDNA技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)的研究中,業(yè)內(nèi)普遍認(rèn)為以12s rRNA基因作為目的基因能夠獲得的物種鑒別效果最佳,而在全球范圍內(nèi)該基因的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)極度匱乏,嚴(yán)重影響了高通量測(cè)序數(shù)據(jù)物種注釋結(jié)果的精確性。因此,未來(lái)亟需構(gòu)建全球各地的本土魚(yú)類(lèi)12s rRNA基因參考數(shù)據(jù)庫(kù)。(2)闡明eDNA的生態(tài)學(xué)過(guò)程。eDNA的生態(tài)學(xué)過(guò)程一直以來(lái)都是影響eDNA監(jiān)測(cè)結(jié)果精確性的重要原因之一,盡管當(dāng)前已有大量科研人員在該方面做了許多工作,但尚無(wú)明確的定論,未來(lái)應(yīng)考慮多學(xué)科交叉并結(jié)合各種水文學(xué)以及生態(tài)學(xué)模型全面綜合的考慮各種影響eDNA生態(tài)過(guò)程的生物與非生物因素,進(jìn)一步闡明eDNA在不同生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)學(xué)過(guò)程。(3)開(kāi)發(fā)魚(yú)類(lèi)eDNA研究的生物信息學(xué)分析流程。當(dāng)前用來(lái)分析魚(yú)類(lèi)eDNA宏條形碼測(cè)序數(shù)據(jù)的主流軟件最初大多是專(zhuān)門(mén)針對(duì)微生物研究而開(kāi)發(fā)的,且不同的軟件在算法上存在一定的差異,從而會(huì)在一定程度上影響最終的分析結(jié)果。因此,未來(lái)科研人員應(yīng)開(kāi)發(fā)一套專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)eDNA研究的生物信息學(xué)分析流程,盡可能的降低不同研究中測(cè)序數(shù)據(jù)在分析過(guò)程中因算法導(dǎo)致的差異。(4)不斷開(kāi)發(fā)新技術(shù),早日實(shí)現(xiàn)eDNA監(jiān)測(cè)自動(dòng)化。近年來(lái)關(guān)于eDNA采樣的各種新型設(shè)備層出不窮,甚至某些在線監(jiān)測(cè)設(shè)備已經(jīng)被投入使用,但上述有關(guān)設(shè)備在許多方面仍不完善,得到的監(jiān)測(cè)結(jié)果并不具備很強(qiáng)的說(shuō)服力?？蒲腥藛T未來(lái)可加強(qiáng)在監(jiān)測(cè)設(shè)備開(kāi)發(fā)方面的研究,爭(zhēng)取早日開(kāi)發(fā)出能夠放置在各種水生生態(tài)系統(tǒng)中自動(dòng)監(jiān)測(cè)并上傳魚(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的儀器設(shè)備,以實(shí)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)eDNA監(jiān)測(cè)的自動(dòng)化。