基于腸道菌群分析探討黃芪多糖調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠血糖的可能機(jī)制

苑紅, 張俊鋒, 扈瑞平, 李麗, 霍達(dá), 劉昊澤, 薛慧婷, 任貴強(qiáng)

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 呼和浩特 010110; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院, 呼和浩特 010059)

隨著人們生活水平的改善,飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生了變化,戶外活動(dòng)越來(lái)越少,且逐漸以高脂飲食為主。高脂飲食的結(jié)果會(huì)出現(xiàn)肥胖,且常為2型糖尿病、脂肪肝、高血壓及心血管等疾病的發(fā)病誘因[1-2]。高脂飲食常伴隨高血脂、高血糖等代謝紊亂。其中高脂飲食后常伴隨血糖升高,進(jìn)而誘發(fā)2型糖尿病,研究認(rèn)為空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)濃度可作為糖尿病的一個(gè)重要的預(yù)測(cè)指標(biāo),有研究表明血糖濃度每增加1 mg/dL,糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比原來(lái)高1.154倍[3]。所以關(guān)于高脂飲食誘發(fā)機(jī)體血糖水平升高的現(xiàn)象已備受關(guān)注。但其機(jī)制尚未清楚,其預(yù)防和治療手段也不很理想。

人類的腸道中存在大量的微生物,包括細(xì)菌、病毒和古生菌[4]。目前認(rèn)為,人類的消化道中有1 000余種共生的腸道微生物[5],它們的主要功能包括調(diào)節(jié)人體代謝、免疫反應(yīng)等[6-7]。同時(shí),這些微生物也影響包括炎癥介質(zhì)在內(nèi)的基因表達(dá)[8],如細(xì)胞因子、脂多糖和神經(jīng)活性代謝物。因此,腸道菌群又被認(rèn)為是肝臟以外的又一重要的“微生物器官”或與宿主形成“共生體”[9-10]。此外,腸道細(xì)菌可以降解多種外源性物質(zhì),包括鹵代芳香化合物,這可能對(duì)人體健康有益[11]。研究表明,不同飲食或藥物作用后常伴隨明顯的腸道菌群變化,因此,調(diào)節(jié)腸道菌群已經(jīng)被認(rèn)為是防治高血壓、糖尿病等代謝紊亂性疾病的重要干預(yù)靶標(biāo)[12]。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪的干燥根,黃芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黃芪的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[13]。研究發(fā)現(xiàn),APS可以使高脂飲食或糖尿病模型小鼠的糖代謝紊亂及胰島素的敏感性得到改善[14-15],并降低高脂飲食小鼠的體重[16],調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[17]以及影響放射性皮炎小鼠炎性因子表達(dá)[18]。但是,到目前為止,APS是否可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物而改善高血糖或影響高血糖小鼠炎性因子水平仍不清楚?，F(xiàn)從腸道菌群調(diào)節(jié)的角度,探討 APS 對(duì)高血糖小鼠血糖調(diào)節(jié)及炎性因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

黃芪多糖(純度70%)購(gòu)于羅恩公司。小鼠腫瘤細(xì)胞壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒、胰島素ELISA試劑盒,均為酶聯(lián)免疫品牌試劑盒;30 只8周齡C57BL/6J雄性小鼠,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀采用Thermo 公司(Multiskan FC)產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡C57雄性小鼠30只,適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為3組,分別為對(duì)照組(C)、模型組(M)、黃芪多糖組(D),每組10只小鼠。C組喂以正常普通飼料及飲用水,M組喂以高脂飼料和飲用水,D組喂以高脂飼料和20 g/L黃芪多糖溶液。連續(xù)喂養(yǎng)11周后收集樣本。

1.3 樣本收集和處理

將小鼠禁食水12～14 h后,收集糞便于滅菌的離心管中用于高通量測(cè)序。采用斷頭法將血液收集于滅菌的離心管中,靜置30 min,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,分離得血清,-80 ℃保存?zhèn)溆?用于血糖濃度和炎性因子水平測(cè)定,其中血糖濃度采用比色法測(cè)定,空腹胰島素濃度及炎性因子水平采用ELISA法測(cè)定。

1.4 腸道菌群分析

取約100 mg盲腸內(nèi)容物,采用CTAB/SDS方法提取細(xì)菌總基因組DNA。并對(duì)提取的DNA樣本質(zhì)檢,合格的樣本用于后續(xù)的分析,選取特定的引物:16S V4:515F-806R,18S V4: 528F-706R,18S V9:1380F-1510R擴(kuò)增16S rRNA/18S rRNA/ITS的16S V4/16S V3/16S V3-V4/16S V4-V5,18S V4/18S V9,ITS1/ITS2,Arc V4不同區(qū)域。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò) SPSS 19 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 “均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,用Bonferroni法進(jìn)行方差分析,分析組間差異,認(rèn)為P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高通量測(cè)序結(jié)果采用 OTUs 聚類分析法,進(jìn)行物種注釋及豐度分析。

2 結(jié)果分析

2.1 APS改善高脂飲食小鼠的空腹血糖和空腹胰島素水平

C57雄性小鼠經(jīng)過(guò)11周高脂飲食,檢測(cè)各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平,觀察APS對(duì)高脂飲食小鼠糖代謝的影響。結(jié)果顯示:M組小鼠空腹血糖水平顯著高于C組(P<0.001),而D組小鼠在高脂飲食同時(shí)喂以20 g/mL APS溶液后空腹血糖水平較M組顯著下降(P<0.05)(圖1)?？崭挂葝u素水平的變化趨勢(shì)與空腹血糖一致,M組小鼠在高脂飲食后空腹血糖水平顯著升高(P<0.05),而在服用APS的高脂飲食小鼠卻又顯著下降(P<0.05)(圖2)。該結(jié)果說(shuō)明,高脂飲食能夠顯著地升高小鼠空腹血糖和空腹胰島素水平,而APS又可以明顯改善高脂飲食引起的空腹血糖和空腹胰島素水平顯著升高的趨勢(shì)。

C為對(duì)照組,正常飲食+飲用水;M為模型組,高脂飲食+飲用水;D為高脂飲食+20 g/mL APS;***為P<0.001;*為P<0.05圖1 APS對(duì)高脂飲食小鼠的空腹血糖的影響Fig.1 Effect of APS on fasting blood glucose in high-fat diet mice

C為對(duì)照組,正常飲食+飲用水;M為模型組,高脂飲食+飲用水;D為高脂飲食+20 g/mL APS;*為P<0.05圖2 APS對(duì)高脂飲食小鼠的空腹胰島素水平的影響Fig.2 Effects of APS on fasting insulin levels in high-fat diet mice

2.2 APS可改善高脂飲食小鼠的血清炎性因子TNF-α、IL-6水平

為了進(jìn)一步探討APS是否可以影響高脂飲食小鼠血清炎性因子水平,檢測(cè)了各組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平,結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示,小鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6水平經(jīng)11周高脂飲食后,M組均明顯高于C組(IL-6:P<0.01,TNF-α:沒(méi)有顯著性),而D組小鼠在高脂飲食同時(shí)喂以20 g/mL APS溶液時(shí),TNF-α和IL-6水平較M組有明顯下降趨勢(shì),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明,高脂飲食可以明顯升高血清中炎性因子TNF-α和IL-6水平,而APS又可以改善高脂飲食引起的這些因子的高表達(dá)。

C為對(duì)照組,正常飲食+飲用水;M為模型組,高脂飲食+飲用水;D為高脂飲食+20 g/mL APS;**為p<0.01;ns為沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖3 APS對(duì)高脂飲食小鼠血清中TNF-α和IL-6水平的影響Fig.3 Effect of APS on serum neutralization of TNF-α and IL-6 in mice with high fat diet

2.3 APS可以改善高脂飲食小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)

為了明確APS改善血糖及炎性因子水平與改變腸道菌群的關(guān)系,利用基于16S rDNA序列測(cè)定的元基因組學(xué)方法,分析了C組、M組和D組腸道菌群差異。在綱水平上,比較了各組腸道菌群的組成(圖4),在C組中,擬桿菌綱(Bacteroidetes,擬桿菌門)約占所有細(xì)菌豐度的41.7%,芽孢桿菌綱(Bacilli,厚壁菌門)約占所有細(xì)菌豐度的15%和梭菌綱(Colstridia,厚壁菌門)約占所有細(xì)菌豐度的25%。與C組比較,M組中擬桿菌綱顯著下降(P<0.05),約占所有細(xì)菌豐度的13.3%;芽孢桿菌綱也出現(xiàn)一定程度下降(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),約占所有細(xì)菌豐度的18.3%;梭菌綱顯著升高(P<0.05),約占所有細(xì)菌豐度的25%。與M組相比,D組擬桿菌綱略有升高(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)約占15%,芽孢桿菌綱也出現(xiàn)明顯升高(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)約占38.3%,而梭菌綱也明顯下降,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn),小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在高脂飲食后變化明顯,而APS則使高脂飲食所致的腸道菌的變化得到明顯改善。在屬和綱水平上還利用熱圖分析了相對(duì)豐度較大的35個(gè)細(xì)菌OUTs(圖5),結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飲食確實(shí)能夠顯著地改變部分OUTs的相對(duì)豐度,而APS則又能夠全部或部分地恢復(fù)了高脂飲食引起一些菌群的變化。因此,APS確實(shí)可以改善高脂飲食所致的腸道菌群的變化。同時(shí),在高脂飲食時(shí)小鼠的血糖水平也出現(xiàn)明顯升高的現(xiàn)象,而在服用APS時(shí),又可以明顯降低小鼠血糖水平。因此,推測(cè)APS在逆轉(zhuǎn)高脂飲食小鼠高血糖的現(xiàn)象可能是由APS改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用的。

圖4 綱水平腸菌群相對(duì)豐度對(duì)比Fig.4 Comparison of relative abundance of intestinal flora at class level

圖5 綱水平上前35個(gè)OUT相對(duì)豐度的熱圖Fig.5 Heat map of the relative abundance of the top 35 OUTs at the horizontal level

2.4 APS引起腸道菌群的變化主要調(diào)節(jié)糖代謝通路

在對(duì)APS所致腸道菌群變化進(jìn)行功能預(yù)測(cè)各代謝途徑的KEGG分析(圖6)中發(fā)現(xiàn),APS引起差異表達(dá)的菌群在糖代謝通路富集最顯著。這也與檢測(cè)結(jié)果一致,APS參與改善高脂飲食引起的小鼠血糖濃度的調(diào)節(jié)。

3 討論

APS是黃芪的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性。本研究表明,高脂飲食能夠使小鼠的空腹血糖和空腹胰島素水平顯著升高,而APS可以顯著降低高脂飲食所引起的空腹高血糖和空腹高胰島素水平,也能夠改善炎性因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平;同時(shí),研究不僅發(fā)現(xiàn)APS能改善高脂飲食小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu),而且在高通量檢測(cè)分析中對(duì)APS引起腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的功能預(yù)測(cè)時(shí)也發(fā)現(xiàn)APS引起差異表達(dá)的菌群在糖代謝通路上富集最顯著。這些結(jié)果說(shuō)明APS的降糖作用可能是通過(guò)改變小鼠的腸道菌群而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)于對(duì)糖代謝的研究中發(fā)現(xiàn)APS具有雙向調(diào)節(jié)血糖的作用[19]。具體表現(xiàn)為APS對(duì)血糖正常的小鼠沒(méi)有明顯影響,但可以顯著降低小鼠葡萄糖負(fù)荷后的血糖水平,也能有效對(duì)抗腎上腺素引起小鼠血糖升高的反應(yīng)和苯乙雙胍致小鼠實(shí)驗(yàn)性低血糖,而對(duì)胰島素性低血糖沒(méi)有明顯影響[20]。廖葦萍等[21]也研究發(fā)現(xiàn)在高脂飼料中添加1 g/kg黃芪多糖可以顯著降低小鼠血糖。對(duì)3T3-L1脂細(xì)胞的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)1 g/mL的APS可以使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率增加2.62倍[22]。研究中高脂飲食的小鼠服用20 g/L的APS具有顯著的降低血糖和降低胰島素的作用。

越來(lái)越多證據(jù)表明,腸道菌群的變化與宿主的肥胖、糖尿病、高血壓等慢性疾病高度相關(guān)。研究表明,肥胖的形成常伴隨明顯的腸道菌群失衡,尤其是在腸道中占有主要比例的厚壁門與擬桿菌門細(xì)菌的比例失調(diào)[23]。當(dāng)厚壁菌門和擬桿菌門等正常菌群降低時(shí),可以降低腸道菌群對(duì)碳水、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝利用率。如C57小鼠連續(xù)7～14 d服用復(fù)合益生元將腸道菌群恢復(fù)為正常狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖者血糖顯著下降,同時(shí)空腹胰島素水平也顯著下降。為進(jìn)一步研究腸道菌群對(duì)小鼠糖代謝的影響,使C57小鼠連續(xù)4周每天口服1 mL的復(fù)合抗生素溶液導(dǎo)致其腸道微生態(tài)紊亂,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門等正常菌群的相對(duì)豐度降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠口服葡萄糖耐量曲線變化趨勢(shì)有所偏離[24]。在將遺傳性肥胖小鼠和同代的瘦小鼠的腸道菌群分別接種到無(wú)菌小鼠腸道內(nèi)的研究中發(fā)現(xiàn),在相同的進(jìn)食量下,接種肥胖小鼠菌群的小鼠體脂顯著高于接種瘦小鼠菌群的小鼠,這說(shuō)明肥胖與腸道菌群具有相關(guān)性[24]。在研究葛根山藥膠囊(含有黃芪)作為輔助降糖藥時(shí)發(fā)現(xiàn)空腹血糖水平與乳酸桿菌屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性,空腹血糖水平越高,乳酸桿菌相對(duì)豐度則越低;空腹血糖水平與支原體菌屬、鏈球菌屬、大腸志賀菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)正相關(guān)性[25]。因此推測(cè)高脂飲食可能首先引起小鼠腸道菌群的變化,進(jìn)而影響小鼠糖代謝,使小鼠血糖水平明顯升高。研究中也得到了相似的結(jié)果,高脂飲食組小鼠通過(guò)高脂飲食后腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)小鼠的血糖、胰島素水平明顯升高。另外,在高脂飲食同時(shí)飲用APS發(fā)現(xiàn),APS可以改善小鼠高脂飲食引起的腸道菌群變化,同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了由高脂飲食引起血糖、胰島素水平升高的現(xiàn)象。

劉艷秋等[26]在研究血清炎性因子與空腹血糖水平是否有相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn),糖尿病前期組和2型糖尿病組IL-6水平較正常組明顯升高,且IL-6與空腹血糖水平呈正相關(guān)。在研究老年癡呆患者糖代謝時(shí)發(fā)現(xiàn),空腹血糖水平與炎性因子 IL-6和TNF-α具有正相關(guān)性,空腹血糖升高時(shí),血清中IL-6和TNF-α水平也明顯升高[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)厭氧菌與需氧菌比值與血清中IL-6和TNF-α呈顯著負(fù)相關(guān)性[28],而且IL-6會(huì)隨患者菌群差異程度的升高而升高[29]。目前也有專家發(fā)現(xiàn)IL-6是具有腸道屏障功能障礙的關(guān)鍵分子[30]。在研究中也發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)血清中IL-6和TNF-α水平明顯升高,而通過(guò)服用APS后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生逆轉(zhuǎn),此時(shí)小鼠IL-6和TNF-α水平有一定程度恢復(fù)。

4 結(jié)論

推測(cè)APS可以降低高脂飲食小鼠的血糖可能是通過(guò)改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)血清中炎性因子IL-6和TNF-α水平而實(shí)現(xiàn)的。