網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討霧水葛防治II型糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制

李漢成，曾 茗，莫紫嬌，馬德運

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

糖尿病是一種由多因素相互作用所致的代謝性疾病，由于胰島素分泌缺乏和生物作用障礙，導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等代謝紊亂.據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）統(tǒng)計，2021年全球糖尿病患者已經(jīng)達到5.37億，預(yù)計在2030年可達到6.43億[1].隨著我國居民生活水平的提高及生活方式的改變，糖尿病已經(jīng)成為繼心血管疾病及腫瘤之后的第三大疾病，給居民帶來沉重的經(jīng)濟負擔并嚴重影響其生活質(zhì)量.2021年我國糖尿病患者達到1.4億，位居世界首位，60歲以下患者超過40%，其發(fā)病特點呈現(xiàn)年輕化趨勢，其中約90%為II型糖尿病[2].

中醫(yī)認為II型糖尿病屬于“消渴”范疇，并發(fā)現(xiàn)“三多”（多飲、多尿、多食）是II型糖尿病患者常表現(xiàn)的癥狀.“消渴”首次記載于《素問·奇病論》中，認為經(jīng)常吃又甜又肥膩的食物是II型糖尿病患者患病原因之一，患者攝入過多甘美肥膩的食物后導(dǎo)致了脾運失常，脾熱上溢，最終導(dǎo)致了消渴癥.霧水葛，最早見于清代《生草藥性備要》，后見于《嶺南采藥錄》，其來源于蕁麻科植物霧水葛的帶根全草，在廣東、廣西等許多氣候溫暖的省份均有分布.霧水葛作為一味傳統(tǒng)中藥，味甘、淡，性寒，其清熱解毒、清腫排膿、利水通淋等功效與中醫(yī)治療II型糖尿病的理念不謀而合.霧水葛在廣東民間被廣泛應(yīng)用于降血糖，尤其是廣東粵西地區(qū)，老百姓從野外采摘霧水葛全株，洗凈泥土及雜質(zhì)，晾干，用水煎服以控制血糖，這一用藥習(xí)慣在當?shù)乩习傩罩幸呀?jīng)較為普遍，療效得到廣泛認可.此外，岑歡等人發(fā)現(xiàn)其對服用了小劑量及中劑量霧水葛水煎劑的糖尿病小鼠有明顯的降血糖作用[3].

目前，應(yīng)用霧水葛治療II型糖尿病的理論研究尚且處于初期階段，缺少對其降血糖靶點及作用機制的研究.本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對傳統(tǒng)中藥霧水葛治療II型糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制進行探討，為霧水葛治療II型糖尿病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 霧水葛活性成分的篩選及基因靶點的預(yù)測

通過文獻調(diào)研查找霧水葛活性成分，通過化源網(wǎng)（https://www.chemsrc.com）獲取主要成分CAS 號，通過pubchem（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫獲取主要成分的2D 結(jié)構(gòu).借助SwissADME 數(shù)據(jù)庫上對霧水葛的主要成分進行篩選，以胃腸道吸收度高Gl absorption High、并同時滿足藥物相似性中Druglikeness 中（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）含有兩個yes 為指標篩選出活性成分.通過Swiss Target Prediction（swisstargetprediction.ch）預(yù)測霧水葛活性成分作用靶點.

1.2 獲取疾病相關(guān)基因

在GeneCards（https://www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫中設(shè)置物種為“Homo sapiens”，輸入關(guān)鍵詞“diabetes mellitus type 2”檢索出與diabetes mellitus type 2相關(guān)的基因靶點.

1.3 篩選活性成分作用靶點與疾病靶點交集

通過微生信在線軟件（www.bioinformatics.com.cn）篩選霧水葛活性成分-II型糖尿病靶點交集.

1.4 構(gòu)建活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，活性成分、靶點基因或者作用通路等可通過節(jié)點表示，將不同節(jié)點相連稱為點（edge），網(wǎng)絡(luò)中的度（Degree）表示節(jié)點之間的連接數(shù).

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用（Protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入1.3中獲得的霧水葛活性成分與II型糖尿病的交集靶點，選擇物種為“Homo sapiens”.根據(jù)交集基因靶點的數(shù)目大小選擇置信度，不低于最低置信度，利用Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化.

1.6 基因本體（Gene Ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析

在David（https://david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫上導(dǎo)入1.3中獲得交集靶點，首先選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，選擇物種“Homo sapiens”，最后選擇列表類型“Gene List”，獲取GO，KEGG相關(guān)數(shù)據(jù)，并通過微生信軟件制作氣泡圖.

2 結(jié)果

2.1 霧水葛活性成分的篩選及基因靶點的預(yù)測

通過文獻調(diào)研獲取霧水葛14個活性成分，最終通過SwissADME 數(shù)據(jù)庫篩選得到相關(guān)活性成分5個，如表1所示，進一步采用Swiss Target Prediction預(yù)測得到227個靶基因.

表1 通過SwissADME數(shù)據(jù)庫篩選得到霧水葛5個活性成分

2.2 獲取II型糖尿病相關(guān)基因

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中檢索到diabetes mellitus type 2（II型糖尿病）的相關(guān)基因有14329 個，去除重復(fù)的基因.利用Uniprot（https://www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫對這些去重后的基因名標準化，使得數(shù)據(jù)更加準確，有利于網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析，最終II型糖尿病標準化的靶點共有1888個.

2.3 交互篩選霧水葛活性成分靶點與II型糖尿病相關(guān)靶點

通過微生信平臺完成霧水葛活性成分基因靶點與II 型糖尿病基因靶點的交集靶點的篩選，并制作Venn圖，發(fā)現(xiàn)霧水葛的活性成分與II型糖尿病之間有126個共同靶點，如圖1所示.

圖1 Venn圖交互篩選霧水葛-II型糖尿病共同靶點

2.4 相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于2.3 從微生信平臺中獲得的共同基因靶點126 個制作成相應(yīng)的network 文件和type 文件.將相關(guān)文件依次導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-基因靶點”網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示.通過Cytoscape3.9.1的插件CytoNCA 計算網(wǎng)絡(luò)中活性成分的度值，其越大表示該活性成分所調(diào)控的靶點越多，同理，作用靶點的度值越大則表示調(diào)控該靶點的活性成分越多[3].在“藥物-活性成分-基因靶點”網(wǎng)絡(luò)中按度值排名前10 位的作用靶點依次是ALOX5、ESR2、TERT、CYP19A1、AKR1B10、PTGS2、MMP2、MMP3、MMP13、TOP1、AR.這10個作用靶點可能是霧水葛活性成分治療II型糖尿病的重要靶點.5種活性成分的度值普遍較高，其中槲皮素與芹菜素的度值都處第一，這2種成分可能是霧水葛治療II型糖尿病的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ).

圖2 霧水葛-活性成分-II型糖尿病靶點網(wǎng)絡(luò)

2.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在String數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入2.3中獲得的霧水葛活性成分與II型糖尿病的交集靶點，選擇物種為“Homo sapiens”.由于交集基因靶點的數(shù)目較大，為了更加準確高效分析數(shù)據(jù)，選擇高度置信度為0.7，進一步制作PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape3.9.1軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，如圖3所示.SRC、EGFR、MAPK3、PIK3R1、AKT1、PTPN11、ESR1、AR、TNF、PTK2 等靶蛋白處于網(wǎng)絡(luò)的核心，推測這些靶點是霧水葛治療II型糖尿病的重要靶點.

圖3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO及KEGG富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 分析，發(fā)現(xiàn)生物學(xué)過程（BP）共有456 條，細胞學(xué)組分（CC）共有66 條，生物學(xué)功能（MF）共有133 條.將P 值倒序排列，選取P值最小的前20名條目利用微生信建立氣泡圖.在GO 富集分析中發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過程（BP）主要涉及細胞凋亡過程的負調(diào)節(jié)、對藥物的反應(yīng)及肽基-酪氨酸自磷酸化等；細胞學(xué)組分主要涉及大分子復(fù)合體、受體復(fù)合物及漿膜等；分子生物學(xué)功能（MF）主要涉及氧化應(yīng)激、類固醇結(jié)合、酶結(jié)合及調(diào)節(jié)跨膜受體蛋白酪氨激酶活性等，如圖4～6 所示.在KEGG 信號通路中包括HIF-1 信號通路、Phospholipase D通路、P13K-AKT通路、Relaxin通路、Estrogen 通路、Ras 通路、5-羥色胺能突觸等通路，如圖7所示.

圖4 排名前20的生物學(xué)過程

圖5 排名前20的細胞學(xué)組分

圖6 排名前20的生物學(xué)功能

圖7 排名前20的KEGG通路

2.7 構(gòu)建疾病-通路-靶點-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)

將126種成分疾病共有靶點、5種霧水葛的活性成分、KEGG前20條通路（根據(jù)P值由小到大排序，P＜0.05）通過Cytoscape3.9.1 構(gòu)建“II 型糖尿病-通路-活性成分-霧水葛”網(wǎng)絡(luò)，如圖8 所示.II 型糖尿病的信號通路與靶點、靶點與霧水葛的活性成分之間形成非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系.對“II 型糖尿病-通路-活性成分-霧水葛”網(wǎng)絡(luò)圖的拓撲參數(shù)分析，度值較前的信號通路為PI3K-Akt 信號通路，該信號通路的作用靶點為GSK3B，SYK，F(xiàn)LT3， FLT4， INSR， PIK3R1， EGFR，PIK3CG，PTK2，IGF1R，CDK6，ERBB2，CDK2，KDR，AKT1，TEK，MET，MAPK3.Ras信號通路的度值也偏高，其作用靶點為PLA2G1B，F(xiàn)LT3，F(xiàn)LT4，INSR，PLA2G4A，PTPN11，PIK3R1，EGFR，IGF1R，KDR，AKT1，TEK，MET，MAPK3.PI3K-Akt及Ras這兩條與糖尿病密切相關(guān)的通路，其對應(yīng)的靶點與網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點存在較多重合，提示霧水葛及其活性成分極有可能通過調(diào)控上述重要靶點，進而進一步影響PI3K-Akt及Ras信號通路，發(fā)揮治療II型糖尿病的作用.

圖8 “II型糖尿病-通路-靶點-活性成分-霧水葛”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

通過相關(guān)文獻及數(shù)據(jù)庫獲取到霧水葛的活性成分5個，其中熊果酸、槲皮素、芹菜素等霧水葛活性成分被廣泛用于II 型糖尿病的相關(guān)研究.熊果酸又稱烏蘇酸，研究表明熊果酸能對抗糖尿病及其引起的各種并發(fā)癥，其可通過降脂、降糖和抗氧化作用以及對抗高濃度葡萄糖的氧化應(yīng)激反應(yīng)和醛糖還原酶的表達和活性，產(chǎn)生防治糖尿病及其并發(fā)癥的作用[4-6].此外，熊果酸對II型糖尿病引起的視網(wǎng)膜、肝、腎及心肌損傷均有明顯的保護作用[7-12].研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可改善糖尿病大鼠的糖代謝，抑制胰島β細胞氧化應(yīng)激，減少胰島β細胞凋亡，并促進胰島β細胞的胰島素分泌，其還可抑制糖尿病大鼠炎癥反應(yīng)，減少脊髓背角神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)傳導(dǎo)，減輕疼痛癥狀[13-16].此外，槲皮素可以改善由糖尿病引起的視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)病理性疼痛、及腎臟損傷[17-20].芹菜素又稱洋芹素，諸多研究顯示其對于治療糖尿病及其并發(fā)癥具有良好的效果.芹菜素可通過減少抗氧化應(yīng)激、保護胰島β細胞線粒體膜、增加胰島素敏感性、激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ及改善心肌梗死后血流動力學(xué)紊亂等途徑發(fā)揮降血糖作用，同時對糖尿病引起的氧化應(yīng)激損傷、心肌損傷等其他糖尿病并發(fā)癥均有較好的治療作用[21-23].

通過預(yù)測霧水葛活性成分的作用靶點共有227個，與II型糖尿病相關(guān)的靶點共有1888個，其中霧水葛活性成分與II型糖尿病的交集靶點共有126個.通過對網(wǎng)絡(luò)圖的拓撲參數(shù)分析，其中度值較高的基因靶點包括MAPK3、EGFR、AKT1、PIK3R1及IGFIR 等.由GO 分析的結(jié)果可知，霧水葛治療II 型糖尿病主要涉及的生物過程有對細胞凋亡的負調(diào)節(jié)、肽酪氨酸自磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶信號傳導(dǎo)的正向調(diào)節(jié)等；細胞學(xué)組分主要涉及大分子復(fù)合體、受體復(fù)合物及漿膜等；其分子功能涉及氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸激酶活性及酶結(jié)合等.由KEGG分析可知，其信號通路中主要涉及HIF-1信號通路、P13K-AKT通路及Ras通路等通路.

PI3K/Akt信號通路是胰島素在肝臟中發(fā)揮作用的主要信號通路，PI3K/Akt信號通路的活化通常有兩種路徑，一種是Ras直接與pll0結(jié)合而引發(fā)PI3K活化Edgar KA，另一種是與具有酪氨酸殘基的受體或蛋白相互作用激活[24-25].胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)病機制之一，PI3K/Akt信號通路障礙及下游靶蛋白功能異常均可引發(fā)糖、脂代謝障礙，繼而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[26].根據(jù)GO分析，霧水葛及其靶基因的生物學(xué)過程中涉及氧化應(yīng)激，而HIF-1信號通路可減少胰島β細胞的凋亡，減弱機體對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，來維護胰島β細胞的正常功能[27].在分子生物功能及生物過程中都涉及了富集較高的磷酸酪氨酸結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性及非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶活性.受體酪氨酸激酶的活性降低會導(dǎo)致受體跨膜信號障礙，也會直接引起人體胰島素抵抗[28].

4 結(jié)論

霧水葛中的活性成分熊果酸、槲皮素及芹菜素等，可能通過作用于INSR、ERBB2、AKT1、TEK、PIK3R1、EGFR、IGF1R、MAPK3等重要靶點，進一步調(diào)節(jié)PI3K/Akt及HIF-1信號通路，從而影響與糖尿病密切相關(guān)的氧化應(yīng)激、胰島β細胞凋亡、胰島素抵抗等生物過程，發(fā)揮治療II型糖尿病的作用.本研究為霧水葛治療II型糖尿病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).