千里光化學(xué)成分及抗煙草花葉病毒活性研究

符 滔,李雅麗,張 威,吳江梅,劉 洋,羅新香,閆曉慧*,胡世俊

1西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,昆明 650233

植物病毒病被稱為“植物癌癥”,是僅次于植物真菌病害的第二大植物病害,由于缺乏理想的防治措施,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失,每年由植物病毒造成的經(jīng)濟(jì)損失超過100億美元[1,2]。煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是最早發(fā)現(xiàn)的單鏈RNA植物病毒,其寄主范圍廣泛,涉及有65個(gè)科的885種植物,煙草及其他農(nóng)作物感染TMV后,被感染的植株葉片葉綠素會(huì)遭到破壞,繼而使其光合作用減弱,出現(xiàn)生長困難、矮化等癥狀,甚至死亡[3-5]。煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,而TMV每年都會(huì)造成煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的嚴(yán)重?fù)p失,據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),每年因?yàn)闊煵莼ㄈ~病毒造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到一億美元,且防治TMV較為困難,雖已投入使用了幾種抗TMV的商業(yè)抗病毒劑,但有效和實(shí)用的品種很少[6,7]。因此開發(fā)高效、低毒的新型抗TMV藥劑迫在眉睫。

千里光屬(Senecio)作為菊科(Asteraceae)植物中最大的屬,共包括1 500多個(gè)種,在我國分布的有160多種[8]。千里光(Senecioscandens)是千里光屬多年生植物,莖多曲折呈攀援狀,上部多分枝,頭狀花序,花黃色,葉片呈卵狀三角形或橢圓狀披針形,主要分布于我國華東、中南及西南各地,多生于丘陵山地林邊,灌叢、草叢和路邊[9,10]。千里光是我國傳統(tǒng)的中藥材,具有清熱解毒、明目、利濕的功效,有較好的抗炎、抗菌、抗病毒的作用[11,12]。

本研究旨對(duì)千里光進(jìn)行抗TMV活性篩選,研究其中具有抗煙草花葉病毒活性的化學(xué)成分。從中優(yōu)選出活性最強(qiáng)的化合物,以此為煙草花葉病的防治提供理論依據(jù),也為千里光植物的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 植物材料

樣品采自云南昆明,經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)胡世俊副教授鑒定為千里光(SenecioscandensBuch.-Ham),標(biāo)本(QLG2018～11)存放于西南林業(yè)大學(xué)森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試病毒及寄主

TMV(U1)普通株系,由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供。繁殖于普通煙K326(Nicotianatabacumcv.K326)上,采用Gooding[13]的方法進(jìn)行提純,置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｐ娜~煙(Nicotianaglutinosa)為枯斑寄主,在無蟲溫室中培育,待煙苗長至4～6片真葉時(shí)進(jìn)行活性測定。

1.1.3 儀器

Bruker AM-500,Bruker AV-600 MHz核磁共振儀(德國布魯克公司);Bruker HTC/Esquire質(zhì)譜儀(德國布魯克公司);LC3000型半制備高效液相色譜儀(北京賽普銳思科技有限公司)。

1.1.4 試劑

柱層析硅膠及GF254薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司);C-18反向硅膠(日本YMC公司);色譜純?nèi)軇┘状己鸵译?上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?;工業(yè)乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿和丙酮經(jīng)重蒸后使用;以碘和5%的硫酸乙醇溶液為顯色劑;二甲基亞砜(DMSO)為分析純、8%寧南霉素水劑購自德強(qiáng)生物股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備

千里光地上部分12.00 kg干燥后粉碎,采用95%乙醇回流提取3次,每次3～4 h,合并三次提取液,減壓濃縮至浸膏狀;將乙醇提取物用蒸餾水溶解后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次,得相應(yīng)溶劑萃取物。

1.2.2 化合物的分離

乙酸乙酯萃取物(414.16 g)經(jīng)硅膠(100～200目)柱色譜分離,以石油醚-乙酸乙酯(50∶1→1∶1)進(jìn)行梯度洗脫,經(jīng)薄層層析檢測,合并相同組分,共獲得7個(gè)流分(Fr.1～Fr.7)。

Fr.1(2.07 g)采用葡聚糖凝膠色譜(氯仿-甲醇=1∶1),得到5個(gè)亞流分(Fr.1-1～Fr.1-5),Fr.1-4(0.75 g)經(jīng)正相硅膠柱層析,以正己烷-石油醚(0∶1→100∶1)梯度洗脫,得到化合物1(12.7 mg)。Fr.4(6.56 g)采用MCI小孔樹脂除色素,甲醇-水(20%→100%)梯度洗脫,20%(0.11 g)經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(30∶1→5∶1)梯度洗脫,得到化合物3(8.10 mg);80%(0.10 g)采用葡聚糖凝膠色譜(氯仿-甲醇=1∶1),經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(30∶1→6∶1)梯度洗脫,得到化合物4(5.90 mg);90%(0.80 g)經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(1∶0→5∶1)梯度洗脫后采用葡聚糖凝膠色譜柱(氯仿-甲醇=1∶1)劃段,通過半制備液相色譜分析,得到化合物6(10.00 mg);100%(0.39 g)經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(100∶1→5∶1)梯度洗脫,得到化合物2(3.40 mg)、化合物5(2.70 mg)。Fr.5(13.30 g)采用MCI小孔樹脂除色素,甲醇-水(20%→100%)梯度洗脫,90%部分采用葡聚糖凝膠色譜(甲醇)劃段,經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(100∶1→5∶1)梯度洗脫,得到化合物13(13.40 mg)。Fr.6(21.60 g)經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(30∶1→2∶1)梯度洗脫,得到Fr.6-1～Fr.6-19,Fr.6-19采用葡聚糖凝膠色譜(氯仿-甲醇=1∶1)劃段,采用葡聚糖凝膠色譜(甲醇)純化得到化合物7(4.00 mg);Fr.6-17采用葡聚糖凝膠色譜(氯仿-甲醇=1∶1)劃段,通過半制備液相色譜分析后用葡聚糖凝膠色譜(甲醇)純化得到化合物8(18.70 mg)。Fr.7(24.60 g)采用MCI小孔樹脂除色素,甲醇-水(20%→100%)梯度洗脫,80%部分(6.70 g)采用葡聚糖凝膠色譜(甲醇)分離得到化合物9(2.10 mg)和10(65.70 mg);90%部分(4.30 g)采用葡聚糖凝膠色譜(甲醇)劃段后,經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→5∶1)梯度洗脫,得到化合物11(4.50 mg)、12(2.30 mg)。

1.2.3 抗TMV活性測定

將供試化合物用DMSO配置成10 mg/mL的母液,置于4 ℃冰箱中備用,采用活體半葉枯斑法測定[14],用純凈水將化合物母液稀釋到50 μg/mL備用。挑選健康長勢(shì)一致的心葉煙,每株選取3片葉齡和葉片大小相近的上部葉片,測定其保護(hù)作用:在左半葉涂抹化合物,右半葉涂抹相同濃度的DMSO溶液作對(duì)照;陽性對(duì)照植株左半葉涂抹50 μg/mL的寧南霉素,右半葉涂抹相同濃度的DMSO溶液;6 h后摩擦接種TMV。治療作用:葉片摩擦接種TMV。6 h后,左半葉涂抹化合物,右半葉涂抹相同濃度的DMSO溶液作為對(duì)照;陽性對(duì)照設(shè)置同上。鈍化作用:將TMV 400倍稀釋液與化合物充分混合后靜置30 min;左半葉摩擦接種TMV與化合物混合溶液作為處理,右半葉摩擦接種相同濃度的DMSO與TMV混合溶液作為對(duì)照。以上處理均在無蟲溫室中培養(yǎng),2～3 d后葉片出現(xiàn)明顯的枯斑癥狀時(shí),統(tǒng)計(jì)枯斑的數(shù)量并由公式“抑制率=[(對(duì)照平均枯斑數(shù)-處理平均枯斑數(shù))/對(duì)照平均枯斑數(shù)]×100%”計(jì)算抑制率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,運(yùn)用Duncan檢驗(yàn)比較不同處理間的差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不同藥物處理的組別以變異數(shù)分析(ANOVA)計(jì)算,采用多重比較(LSD)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色針晶(氯仿);ESI-MS:m/z425[M+H]+;分子式為C30H48O;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.09(1H,s,H-24),1.70(3H,s,H-27),1.60(3H,s,H-26),1.10(3H,s,H-29),1.09(3H,s,H-30),1.05(3H,s,H-18),0.90(3H,s,H-28),0.89(3H,s,H-21),0.78(1H,d,J= 4.2 Hz,H-19β),0.56(1H,d,J= 4.3 Hz,H-19α);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:33.4(C-1),37.5(C-2),216.7(C-3),50.3(C-4),48.5(C-5),21.5(C-6),25.9(C-7),47.2(C-8),21.1(C-9),26.0(C-10),26.7(C-11),32.8(C-12),45.3(C-13),48.7(C-14),35.6(C-15),28.2(C-16),52.3(C-17),18.2(C-18),29.6(C-19),35.9(C-20),18.1(C-21),36.3(C-22),24.9(C-23),125.2(C-24),131.0(C-25),17.0(C-26),25.7(C-27),22.2(C-28),20.8(C-29),19.0(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致,故確定化合物為24-烯-環(huán)阿爾廷酮。

化合物2無色針狀結(jié)晶(氯仿);ESI-MS:m/z467[M + Na]+;分子式為C30H52O2;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.74(1H,s,H-6),3.60(1H,m,H-3),3.35(3H,s,7-CH3),3.28(1H,s,H-7),1.50(3H,m,H-26),1.25(3H,m,H-27),0.98(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J= 6.5 Hz,H-21),0.86(3H,m,H-29),0.65(3H,s,H-18);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:37.2(C-1),31.5(C-2),71.4(C-3),42.3(C-4),146.1(C-5),120.8(C-6),73.9(C-7),37.5(C-8),42.7(C-9),36.2(C-10),20.8(C-11),39.1(C-12),42.1(C-13),49.1(C-14),24.3(C-15),28.3(C-16),55.7(C-17),11.5(C-18),18.3(C-19),36.7(C-20),18.8(C-21),34.0(C-22),26.0(C-23),45.9(C-24),29.2(C-25),19.8(C-26),19.0(C-27),23.1(C-28),12.0(C-29),56.8(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道一致,故確定化合物為3β-羥基-7β-甲氧基-5-豆甾烯。

化合物3白色片狀結(jié)晶(氯仿);ESI-MS:m/z473[M + Na]+,分子式為C32H66;1H NMR(500 MHz3,CDCl3)δ:1.25(30×CH2),0.86(6H,m,2×CH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:31.9(2×CH2),29.7(24×CH2),29.4(2×CH2),22.7(2×CH2),14.1(2×CH3)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致,故確定化合物為正三十二烷。

化合物4無色針狀結(jié)晶(氯仿);ESI-MS:m/z455[M-H]-,分子式為C30H48O3;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.18(1H,s,H-12),3.60(1H,m,H-3),1.27(3H,s,H-27),1.04(3H,s,H-25),0.95(3H,s,H-23),0.91(3H,s,H-24),0.85(3H,m,H-29),0.81(3H,m,H-30),0.74(3H,s,H-26);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:38.7(C-1),28.1(C-2),78.9(C-3),39.0(C-4),55.2(C-5),18.5(C-6),33.1(C-7),39.4(C-8),47.6(C-9),36.9(C-10),23.5(C-11),124.9(C-12),138.8(C-13),42.2(C-14),28.1(C-15),24.5(C-16),49.2(C-17),53.2(C-18),39.3(C-19),39.4(C-20),30.9(C-21),37.2(C-22),29.3(C-23),16.5(C-24),14.0(C-25),17.0(C-26),22.7(C-27),182.7(C-28),17.0(C-29),21.2(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致,故確定化合物為烏索酸。

化合物5無色針狀結(jié)晶(氯仿);ESI-MS:m/z431[M + H]+,分子式為C29H48O2;1H NMR(150 MHz,CDCl3)δ:5.34(1H,t,J= 4.6 Hz,H-6),5.15(1H,dd,J= 15.1,8.5 Hz,H-22),5.01(1H,dd,J= 15.1,8.5 Hz,H-23),3.52(1H,m,H-3),2.27(1H,m,H-20),1.01(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J= 6.4 Hz,H-21),0.84(3H,t,J= 6.3 Hz,H-29),0.80(6H,d,J= 6.7 Hz,26,H-27),0.70(3H,s,H-18);13C NMR(600 MHz,CDCl3)δ:37.2(C-1),31.7(C-2),71.8(C-3),42.3(C-4),140.7(C-5),121.7(C-6),31.9(C-7),31.7(C-8),50.1(C-9),36.1(C-10),21.1(C-11),39.8(C-12),42.3(C-13),56.8(C-14),24.3(C-15),28.2(C-16),56.0(C-17),11.9(C-18),19.0(C-19),36.1(C-20),19.4(C-21),138.3(C-22),129.3(C-23),45.8(C-24),29.1(C-25),19.8(C-26),18.8(C-27),23.0(C-28),11.9(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致,故確定化合物為豆甾醇。

化合物6黃色無定形粉末;ESI-MS:m/z453[M+Na]+,分子式為C28H46O3;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:6.47(1H,d,J= 8.4 Hz,H-7),6.21(3H,d,J= 8.4 Hz,H-6),5.24(1H,dd,J= 15.4,7.3 Hz,H-23),5.18(1H,dd,J= 15.4,8.1 Hz,H-22),3.78(1H,m,H-3),1.01(3H,d,J= 7.2 Hz,H-28),0.93(3H,d,J= 6.4 Hz,H-21),0.88(3H,H-19),0.84(3H,d,J= 6.4 Hz,H-26),0.83(3H,s,H-18),0.81(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:35.7(C-1),31.1(C-2),66.2(C-3),37.7(C-4),82.3(C-5),136.5(C-6),131.1(C-7),79.4(C-8),38.0(C-10),21.3(C-11),40.3(C-12),45.1(C-13),52.7(C-14),29.3(C-15),24.0(C-16),57.0(C-17),13.2(C-18),18.5(C-19),40.5(C-20),20.0(C-21),132.8(C-22),136.4(C-23),43.7(C-24),33.8(C-25),20.3(C-26),18.0(C-27),21.3(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致,故確定化合物為(22E)-ergosta-6,22-diene-3β,5β,8α-triol。

化合物7黃色針狀結(jié)晶(甲醇);ESI-MS:m/z285[M-H]-,分子式為C15H10O6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:8.08(2H,d,J= 8.8 Hz,H-2′,6′),6.89(2H,d,J= 8.9 Hz,H-3′,5′),6.38(1H,d,J= 2.0 Hz,H-8),6.17(1H,d,J= 2.0 Hz,H-6);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:148.0(C-2),137.1(C-3),177.4(C-4),162.5(C-5),99.34(C-6),165.9(C-7),94.5(C-8),158.3(C-9),104.5(C-10),123.75(C-1′),160.6(C-4′),130.7(C-2′,C-6′),116.3(C-3′,C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致,故確定化合物為山柰酚。

化合物8無色針狀結(jié)晶(甲醇);ESI-MS:m/z144[M-H]-,分子式為C9H7NO;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:9.87(1H,s,H-8),8.15(1H,t,H-4),8.08(1H,s,H-2),7.47(1H,d,J= 8.9 Hz,H-7),7.27(1H,m,H-6),7.22(1H,m,H-5);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:139.7(C-2),120.1(C-3),125.7(C-3a),125.0(C-4),122.4(C-5),123.6(C-6),113.1(C-7),138.9(C-7a),187.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致,故確定化合物為3-吲哚甲醛。

化合物9淡黃色粉末;ESI-MS:m/z315[M-H]-,分子式為C16H12O7;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.38(1H,d,J=2.2 Hz,H-6′),7.36(1H,s,H-2′),6.88(1H,d,J= 7.9 Hz,H-5′),6.55(1H,s,H-8),6.53(1H,s,H-3),3.86(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:166.5(C-2),103.4(C-3),184.2(C-4),154.0(C-5),132.9(C-6),158.9(C-7),95.3(C-8),154.7(C-9),105.7(C-10),123.7(C-1′),114.1(C-2′),147.0(C-3′),151.0(C-4′),116.8(C-5′),120.3(C-6′),60.9(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,故確定化合物為澤蘭黃酮。

化合物10黃色針狀結(jié)晶(甲醇);ESI-MS:m/z301[M-H]-,分子式為C15H10O7;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.72(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2′),7.62(1H,dd,J= 8.5,2.0 Hz,H-6′),6.87(1H,d,J= 8.5 Hz,H-5),6.37(1H,d,J= 1.9 Hz,H-8),6.17(1H,d,J= 2.0 Hz,H-6);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:148.8(C-2),137.2(C-3),177.3(C-4),158.2(C-5),99.2(C-6),165.6(C-7),94.4(C-8),162.5(C-9),104.5(C-10),124.1(C-1′),116.0(C-2′),146.2(C-3′),148.0(C-4′),116.2(C-5′),121.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道一致,故確定化合物為槲皮素。

化合物11黃色無定形粉末;ESI-MS:m/z303[M-H]-,分子式為C15H12O7;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.95(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),6.83(1H,dd,J= 8.1,1.9 Hz,H-6′),6.78(1H,d,J= 8.1 Hz,H-5′),5.77(1H,s,H-6,H-8),4.89(1H,d,J= 11.5 Hz,H-2),4.43(1H,d,J= 11.3 Hz,H-3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:82.8(C-2),73.6(C-3),196.9(C-4),165.3(C-5),97.7(C-6),173.5(C-7),84.9(C-8),164.4(C-9),100.6(C-10),130.2(C-1′),116.0(C-2′),146.3(C-3′),147.0(C-4′),115.8(C-5′),120.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道一致,故確定化合物為紫杉葉素。

化合物12黃色無定形粉末;ESI-MS:m/z223[M+Na]+,分子式為C9H10O4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.05(1H,d,J= 10.1 Hz,H-5),6.13(1H,d,J= 10.1 Hz,H-6),3.64(3H,s,H-9),2.75(2H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:68.0(C-1),152.8(C-2),128.3(C-3),187.4(C-4),128.3(C-5),152.8(C-6),45.7(C-7),170.9(C-8),52.2(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道一致,故確定化合物jacaranone。

化合物13無色油狀;ESI-MS:m/z319[M+Na]+,分子式為C20H40O;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.40(1H,t,J= 6.9 Hz,H-2),4.14(2H,d,J= 6.9 Hz,H-1),1.98(2H,m,H-15),1.67(3H,s,H-17),1.52(1H,m,H-15),0.87(3H,d,J= 6.4 Hz,H-16),0.87(3H,d,J= 6.4 Hz,H-20),0.84(3H,d,J= 6.2 Hz,H-18),0.83(3H,d,J= 6.6 Hz,H-19);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:59.4(C-1),123.1(C-2),140.3(C-3),39.9(C-4),25.1(C-5),36.7(C-6),32.8(C-7),37.4(C-8),24.5(C-9),37.4(C-10),32.7(C-11),37.4(C-12),24.8(C-13),39.4(C-14),28.0(C-15),22.7(C-16),22.6(C-17),19.8(C-18),19.7(C-19),16.2(C-20)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]數(shù)據(jù)報(bào)道一致,故確定化合物為葉綠醇。

從千里光乙酸乙酯萃取物中分離的13個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-13

2.2 化合物抗TMV活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離得到的化合物1～13的抗TMV活性結(jié)果由表1所示?；衔?對(duì)心葉煙的保護(hù)作用顯著高于寧南霉素(見圖2);化合物1、4、9～13與寧南霉素?zé)o顯著差異,表明化合物1、4、8～13能誘導(dǎo)煙草獲得植物系統(tǒng)抗性抵抗病毒;化合物2、3、6、7低于寧南霉素,化合物5對(duì)TMV的侵染沒有抑制作用?；衔?3對(duì)TMV侵染心葉煙的治療作用高于寧南霉素(見圖2),化合物9與寧南霉素?zé)o顯著差異。除化合物8外其余化合物對(duì)接種TMV的心葉煙均有一定的治療作用,能明顯減輕枯斑癥狀?；衔?、9對(duì)TMV初侵染的體外鈍化作用與寧南霉素均無顯著差異;除化合物13無鈍化作用外,其余化合物均能在體外作用于病毒。

表1 化合物1～13的抗TMV活性結(jié)果

圖2 化合物8和13半葉枯斑法部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Partial experimental results of compound 8 and 13 through half-leaf method注:A.化合物8的保護(hù)作用;B.化合物13的治療作用。圖中左半葉施用化合物進(jìn)行處理,右半葉為對(duì)照。Note:A.Protective effect of compound 8;B.Therapeutic effect of compound 13.The left halves were processed with compounds and the right halves were control groups.

3 討論與結(jié)論

植物界產(chǎn)生超過40萬種次生代謝物[29],其中包括可抵抗植物病毒的有效成分,并且植物自身產(chǎn)生的化學(xué)防御物質(zhì),對(duì)植物本身有較低的自毒性,對(duì)環(huán)境友好。因此從植物中尋找抗TMV活性物質(zhì)是一條十分可行的路線,近年來,已有較多報(bào)道[30-32]。

本研究通過運(yùn)用現(xiàn)代高效的植物化學(xué)分離研究方法,從千里光乙酸乙酯萃取物中分離得到13個(gè)單體化合物,除化合物7和10外,其余化合物均為首次從千里光中分離得到?？篃煵莼ㄈ~病毒活性測試結(jié)果發(fā)現(xiàn),化合物8對(duì)TMV侵染的心葉煙的保護(hù)作用抑制率顯著高于寧南霉素;化合物1、4、9～13對(duì)心葉煙的保護(hù)作用均與寧南霉素?zé)o顯著差異,表明這些化合物均可以誘導(dǎo)煙草獲得植物系統(tǒng)抗性抵御病毒?；衔?3對(duì)煙草感染TMV的治療作用抑制率高于寧南霉素;化合物9的抑制率與寧南霉素?zé)o顯著差異?；衔?、9對(duì)TMV的體外鈍化作用與寧南霉素的抑制率差異不顯著,表明這兩個(gè)化合物可以直接作用于病毒發(fā)揮抗TMV作用。

綜上所述,千里光化學(xué)成分對(duì)TMV具有顯著的抑制作用,其中生物堿類、萜類和部分黃酮類化合物顯示了較強(qiáng)的抗TMV活性,這類成分是否為主要的抗病毒活性成分,值得進(jìn)一步探究,本研究豐富了千里光化學(xué)成分和生物活性的范疇,為今后煙草花葉病的綠色防控提供了一定的科學(xué)依據(jù)。