茯苓皮與白茯苓中三萜類成分的HPLC指紋圖譜與化學(xué)模式識(shí)別研究

占慧慧,丁 嬋,彭思源,劉 媛,孟俊華,肖作為,崔培梧*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥性與藥效三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室;3湖南中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥研究室,長(zhǎng)沙 410208

茯苓又名茯菟、茯靈、松腴等,系多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核,味甘、淡,性平,歸心、肺、脾、腎經(jīng),有利水滲濕、健脾寧心的功效[1]。茯苓收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版一部,是中藥四君八珍之一,有“十方九苓”之稱[2]。茯苓的主要藥效物質(zhì)是茯苓多糖和茯苓三萜[3],現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,茯苓三萜具有利尿[4]、抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗炎[7]、抗衰老[8]、降血糖和調(diào)血脂[9]等作用,是當(dāng)前用于表征茯苓質(zhì)量和效應(yīng)的重要指標(biāo)[10-12]。目前市場(chǎng)流通的茯苓主要為栽培品種,不同的產(chǎn)地、加工方式、飲片規(guī)格等都可能影響茯苓藥材和飲片的質(zhì)量[11,13]。2020年版《中國(guó)藥典》僅采用薄層色譜法鑒別控制茯苓和茯苓皮藥材的質(zhì)量,難以全面反映其質(zhì)量的優(yōu)劣。指紋圖譜研究是現(xiàn)代中藥領(lǐng)域內(nèi)普遍被認(rèn)可、應(yīng)用較廣泛的中藥質(zhì)量控制方法之一,具有整體性高、特征性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),符合中藥多成分綜合作用的特點(diǎn),有進(jìn)一步鑒別、鑒定和分類的潛力[14,15]?；瘜W(xué)模式識(shí)別可對(duì)指紋圖譜的多維信息進(jìn)行分析,準(zhǔn)確反映藥材的質(zhì)量差異,從而達(dá)到整體描述和合理評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的目的[13]。本研擬究建立茯苓皮(源于茯苓菌核表皮)與白茯苓(源于茯苓菌核去皮后的部位)的HPLC指紋圖譜,并結(jié)合模式識(shí)別手段分析各共有峰對(duì)指紋圖譜的作用,找出其中的主要峰和特征峰,從整體上評(píng)價(jià)茯苓皮和白茯苓中各化學(xué)物質(zhì)的差異,為茯苓藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司);JS-40型超聲波清洗儀(常州鴻澤實(shí)驗(yàn)科技有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品茯苓新酸B(批號(hào)140723,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、茯苓新酸A(批號(hào)140314,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、去氫茯苓酸(批號(hào)140903,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、松苓新酸(批號(hào)140902,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、茯苓酸(批號(hào)140212,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司;去氫土莫酸(批號(hào)AF21032,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;乙腈為色譜純,水為怡寶純凈水,其余試劑為分析純。

茯苓藥材樣品來(lái)源見(jiàn)表1,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的不同藥用部位,符合《中國(guó)藥典》2020年版各項(xiàng)規(guī)定。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相為0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫:0～18 min,50%→60%B;18～28 min,60%B;28～58 min,60%→92%B;58～68 min,92%B;檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm和203 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫25 ℃;體積流量1.0 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各茯苓三萜酸對(duì)照品適量,加甲醇溶解制成茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.020 7、0.071 4、0.006 4、0.038 6、0.037 1、0.017 1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。放于4 °C冰箱保存,備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取茯苓樣品粉末2.0 g(過(guò)60目篩),精密稱定,置100 mL干燥具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,濾過(guò),茯苓皮樣品濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得;白茯苓樣品濾液先旋轉(zhuǎn)蒸干后定容至2.0 mL,再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取云南茯苓皮樣品(S8),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依據(jù)“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,以茯苓酸(10號(hào)峰)為參照峰,計(jì)算得各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.04%～0.86%和0.22%～1.69%之間,表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取云南茯苓皮樣品(S8),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依據(jù)“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積并計(jì)算得RSD值分別在0.01%～0.27%和0.32%～1.19%之間,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取云南茯苓皮樣品(S8)6份,精密稱定,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依據(jù)“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積并計(jì)算得RSD值分別在0.02%～0.29%和0.81%～4.53%之間,表明方法重復(fù)性好。

2.3.4 溶劑峰和滯后峰的考察

取空白對(duì)照(甲醇)和云南茯苓皮樣品(S8)溶液,檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)至2 h,考察結(jié)果如圖1所示,測(cè)試結(jié)果表明空白溶劑無(wú)干擾且未見(jiàn)滯后峰出現(xiàn)。

圖1 溶劑峰(A)和滯后峰(B)的考察色譜圖Fig.1 Investigation chromatograms of solvent peaks (A) and hysteresis peaks (B)

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜共有模式的建立

將14批不同產(chǎn)地不同藥用部位茯苓樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件分別生成茯苓樣品的疊加圖譜和對(duì)照指紋圖譜。14批茯苓皮和白茯苓樣品的疊加圖譜和對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖2,茯苓皮和白茯苓各自的對(duì)照指紋圖譜及混合對(duì)照品HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。由圖2和3可知,茯苓皮與白茯苓樣品共有的典型色譜峰有15個(gè);經(jīng)與混合對(duì)照品溶液色譜圖比對(duì),

圖2 14批茯苓皮與白茯苓飲片的指紋圖譜疊加圖和對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Superimposed fingerprints and control fingerprint of 14 batches of Poriae Cutis and White Poria decoction pieces

圖3 不同產(chǎn)地茯苓皮(A)和白茯苓(B)飲片對(duì)照指紋圖譜與混合對(duì)照品HPLC圖(C)Fig.3 Control fingerprints of Poriae Cutis (A) and White Poria (B) decoction pieces from different regions and HPLC chromatogram of mixed standards (C)注:2:茯苓新酸B;3:去氫土莫酸;4:茯苓新酸A;9:去氫茯苓酸;10:茯苓酸;12:松苓新酸。Note:2:Poricoic acid B;3:Dehydrotumulosic acid;4:Poricoic acid A;9:Dehydropachymic acid;10:Pachymic acid;12:Dehydrotrametenolic acid.

指認(rèn)了其中6個(gè)共有峰,分別為茯苓新酸B(2號(hào)峰)、去氫土莫酸(3號(hào)峰)、茯苓新酸A(4號(hào)峰)、去氫茯苓酸(9號(hào)峰)、茯苓酸(10號(hào)峰)、松苓新酸(12號(hào)峰);其中10號(hào)峰茯苓酸成分是茯苓中具有代表性的活性三萜酸類成分,性質(zhì)穩(wěn)定,峰面積所占比例較大,分離度好,因此確定其為參照峰(S)。

2.4.2 茯苓皮與白茯苓共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積

以不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品HPLC色譜圖中的10號(hào)峰(茯苓酸)為參照峰(S),計(jì)算各個(gè)批次樣品中其他共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積,結(jié)果見(jiàn)表2和表3。由表2和表3可知,茯苓皮與白茯苓樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間的波動(dòng)較小(RSD值在0.02%～0.64%),而相對(duì)峰面積波動(dòng)較大,表明茯苓皮與白茯苓HPLC指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致,但同一批次樣品各成分之間含有量及不同藥用部位樣品各成分含有量差別較大。

表2 14批茯苓皮與白茯苓飲片指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 14批茯苓皮與白茯苓飲片指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

2.4.3 相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件計(jì)算14批茯苓樣品HPLC指紋圖譜的相似度(見(jiàn)表4),由結(jié)果可知,茯苓皮樣品相似度在0.951～0.998,白茯苓樣品相似度在0.894～0.993,表明不同產(chǎn)地同一藥用部位茯苓樣品相似度較好;茯苓皮與白茯苓之間相似度在0.389～0.765,說(shuō)明不同藥用部位的茯苓指紋圖譜有明顯區(qū)別。

表4 14批茯苓皮與白茯苓飲片的相似度

2.5 各產(chǎn)地茯苓皮與白茯苓樣品的聚類分析

聚類分析(CA)是一種按“物以類聚”原則通過(guò)將觀察對(duì)象依據(jù)某些特征分類的多元統(tǒng)計(jì)分析手段,從而建立樣本與樣本之間的相似關(guān)系或親疏關(guān)系,目前在中藥方面的應(yīng)用較廣泛,如真?zhèn)舞b別、品種分類及質(zhì)量評(píng)價(jià)等[16]。采用SPSS 26.0軟件,以14批不同產(chǎn)地不同藥用部位茯苓樣品的15個(gè)共有峰峰面積為變量,用組間連接法、歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類,聚類結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,14份茯苓樣品被分成了2大類:第一大類為茯苓皮(S1～S9);第二大類為白茯苓(S10～S14),這與樣品的性狀鑒別結(jié)果吻合,表明不同藥用部位間茯苓樣品的差異較大,觀察“2.4.2”項(xiàng)下各共有峰的相對(duì)峰面積均值可發(fā)現(xiàn),茯苓皮中除峰6和峰9外其他共有色譜峰均高于白茯苓,提示各成分含量的高低可能是造成不同藥用部位藥材差異的主要原因。此外白茯苓樣品按產(chǎn)地分為兩類:I類樣品為S10和S11,產(chǎn)自湖南;II類樣品為S13和S14,產(chǎn)自云南。

圖4 14批不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品聚類分析樹(shù)狀圖Fig.4 Cluster analysis of 14 batches of Poriae Cutis and White Poria samples from different regions

2.6 各產(chǎn)地茯苓皮與白茯苓樣品的主成分分析

將不同產(chǎn)地茯苓皮與白茯苓樣品各共有峰峰號(hào)對(duì)峰面積作折線圖(見(jiàn)圖5),從圖可知在本實(shí)驗(yàn)條下茯苓樣品峰面積數(shù)據(jù)擬合度較小,樣本組間差異較大,故采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析(PCA)方法,使用的分析軟件為SPSS 26.0和SIMCA 14.1。

圖5 14批不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品峰面積折線圖Fig.5 Peak area line chart of 14 batches of Poriae Cutis and White Poria samples from different regions

2.6.1 主成分結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)化后的各共有峰峰面積為變量進(jìn)行PCA分析。表5為主成分結(jié)果,前2個(gè)主成分解釋了全部方差的90.387%,能夠反映茯苓皮與白茯苓指紋圖譜中共有峰的大部分信息,結(jié)合碎石圖(見(jiàn)圖6)可知,前2個(gè)主成分特征值相對(duì)較大,而其他主成分之間比較平緩,因此提取前兩個(gè)主成分并標(biāo)記為Y1和Y2。圖7為14批茯苓樣品的PCA散點(diǎn)得分圖,結(jié)果表明,14批樣品可分為2類,I類樣品為S1-S9,II樣品為S10-S14,該現(xiàn)象與CA分析結(jié)果基本一致。

圖6 茯苓飲片樣品PCA碎石圖Fig.6 PCA scree plot of decoction pieces samples made from P.cocos sclerotium

圖7 14批茯苓飲片樣品的PCA散點(diǎn)得分圖Fig.7 PCA score scatter plot of 14 batches of decoction pieces samples made from P.cocos sclerotium

表5 茯苓飲片樣品的主成分結(jié)果

2.6.2 主成分表達(dá)式

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的各個(gè)共有峰變量X1-15占主成分的權(quán)重(見(jiàn)表6),得到Y(jié)1、Y2的線性組合:Y1= 0.229X1+ 0.111X2+ 0.268X3-0.251X4+ 0.295X5+ 0.295X6+ 0.189X7+ 0.282X8+ 0.299X9+ 0.300X10+ 0.279X11-0.257X12-0.233X13-0.265X14-0.251X15,Y2= 0.331X1+ 0.504X2-0.091X3-0.304X4+ 0.094X5+ 0.015X6+ 0.360X7+ 0.191X8+ 0.041X9+ 0.077X10+ 0.157X11+ 0.290X12+ 0.360X13+ 0.231X14+ 0.265X15。

表6 茯苓飲片樣品PCA的成分得分系數(shù)矩陣

由上式可知,在Y1中,3、5和6、8～11號(hào)峰(X3、X5,6、X8-11)的系數(shù)絕對(duì)值大于其他共有峰變量的系數(shù)絕對(duì)值,所以主成分Y1是7個(gè)共有峰的綜合反應(yīng),觀察“2.4.2”項(xiàng)下各共有峰的相對(duì)峰面積可發(fā)現(xiàn),茯苓皮樣品3、5和6、8～11號(hào)峰的相對(duì)峰面積均值與白茯苓3、5和6、8～11號(hào)峰的相對(duì)峰面積均值較接近,而其他共有峰的相對(duì)峰面積均值都相差很大,說(shuō)明這7個(gè)共有峰及所代表的成分(包括已指認(rèn)的共有峰代表成分:去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸)在評(píng)價(jià)茯苓皮和白茯苓質(zhì)量?jī)?yōu)劣時(shí)是必不可少的。在Y2中,1和2、4、7、12～15號(hào)峰(X1,2、X4、X7、X12-15)的系數(shù)大于其他共有峰變量的系數(shù),所以主成分Y2是由這8個(gè)共有峰來(lái)綜合反應(yīng),根據(jù)各共有峰的相對(duì)峰面積可知,茯苓皮樣品這8個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積均值遠(yuǎn)大于白茯苓樣品,提示這8個(gè)共有峰(包括已指認(rèn)的共有峰,2號(hào)峰-茯苓新酸B、4號(hào)峰-茯苓新酸A、12號(hào)峰-松苓新酸)可以作為茯苓皮與白茯苓指紋圖譜(見(jiàn)圖2)中茯苓皮的特征鑒別分。

2.6.3 主成分得分和綜合得分

表7是根據(jù)主成分表達(dá)式計(jì)算的各樣本主成分得分和以各個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率占兩個(gè)主成分總方差貢獻(xiàn)率的比率為權(quán)重計(jì)算的綜合得分[17],主成分Y1得分比較高的是S10、S11、S13、S14,主成分Y2得分比較高的是S2、S4、S7、S10,綜合得分比較高的是S10～S14,結(jié)合茯苓皮和白茯苓各自的對(duì)照指紋圖譜(見(jiàn)圖3A和圖3B)或共有峰峰面積信息,可知在本研究的茯苓皮與白茯苓HPLC指紋圖譜條件下,白茯苓樣品(S10～S14)的3(去氫土莫酸)、5和6、8、9(去氫茯苓酸)、10(茯苓酸)、11號(hào)峰成分含量高于茯苓皮;而S2、S4、S7、S10樣品的1和2、4、7、12～15號(hào)峰成分含量高于其他樣品,其中S2、S4、S7都是茯苓皮樣品,提示在本實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得的茯苓皮的1、2(茯苓新酸B)、4(茯苓新酸A)、7、12(松苓新酸)、13-15號(hào)峰成分含量普遍高于白茯苓;綜合得分較高的都是白茯苓樣品,說(shuō)明白茯苓樣品15個(gè)共有峰成分含量間差異普遍比茯苓皮小。此外,載荷圖表明1、2(茯苓新酸B)、7號(hào)色譜峰對(duì)茯苓皮及白茯苓藥材的整體質(zhì)量起主要影響作用,如圖8所示。

圖8 14批茯苓飲片樣品的主成分載荷圖Fig.8 Loading scatter plot of PCA of 14 batches of decoction pieces samples made from P.cocos sclerotium

表7 主成分得分和綜合得分

3 討論與結(jié)論

本研究采用甲醇為提取溶劑、超聲處理30 min的樣品提取方法[18],考察了不同流動(dòng)相(乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水),不同色譜柱[Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm × 4.6 mm,5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)],不同體積流量(1.0、1.1、1.2 mL/min),不同色譜柱溫度(22、25、28 ℃),不同采集波長(zhǎng)(203、210、242 nm)對(duì)指紋圖譜的影響,最終確定色譜條件為流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水,Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色譜柱,體積流量為1.0 mL/min,色譜柱溫度25 °C,變波長(zhǎng)方式采集,此條件下基線平穩(wěn),色譜峰峰形較好,分離效果較佳。

在此基礎(chǔ)上采用HPLC法建立了14批來(lái)自不同產(chǎn)地的茯苓皮與白茯苓指紋圖譜,在茯苓皮與白茯苓指紋圖譜的共有模式下共標(biāo)定了15個(gè)共有峰,并通過(guò)化學(xué)對(duì)照品指認(rèn)了其中6個(gè)化學(xué)成分:茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸。通過(guò)14批不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品聚類分析樹(shù)狀圖和峰面積折線圖結(jié)合相似度數(shù)據(jù)可知不同藥用部位的茯苓樣品組間差異較大,組內(nèi)差異較小,白茯苓樣品與產(chǎn)地的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。因此模式識(shí)別采用無(wú)監(jiān)督的PCA方法,PCA結(jié)果將15個(gè)共有峰變量分成2個(gè)主成分Y1和Y2,Y1是包括去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸成分在內(nèi)的7個(gè)共有色譜峰的綜合反應(yīng),表明7個(gè)共有色譜峰在進(jìn)行茯苓皮與白茯苓指紋圖譜研究時(shí)必不可少;Y2是包括茯苓新酸B、茯苓新酸A、松苓新酸成分在內(nèi)的8個(gè)色譜峰的綜合反應(yīng),提示這8個(gè)色譜峰可作為在同時(shí)評(píng)價(jià)茯苓皮與白茯苓質(zhì)量時(shí)茯苓皮的特征鑒別峰。對(duì)指紋圖譜影響較大的共有峰變量參數(shù)為1、2(茯苓新酸B)、7號(hào)色譜峰。白茯苓這15個(gè)共有峰成分間含量差異比茯苓皮小。實(shí)際上白茯苓這15個(gè)共有峰成分含量都遠(yuǎn)低于茯苓皮,為了使茯苓皮與白茯苓指紋圖譜的共有模式更完整和可測(cè)故而在制備白茯苓時(shí)加了一步濃縮步驟。

研究表明本文建立的方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確,可以為茯苓皮及白茯苓的質(zhì)量評(píng)價(jià)、標(biāo)準(zhǔn)的制定及藥材的合理利用提供參考依據(jù)。