生長(zhǎng)分化因子15 沉默抑制人肝癌HepG2增殖及遷移作用研究

艾郁蔥,閆光志

(吉林省腫瘤醫(yī)院 1.放療一科;2.結(jié)直腸胃腹部腫瘤外一科,吉林 長(zhǎng)春130012)

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌,為全球第三大癌癥死亡原因,盡管手術(shù)切除、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞和射頻消融、肝移植及受體酪氨酸激酶抑制劑等手段的應(yīng)用大大提高了肝癌患者生存率,但由于其復(fù)發(fā)率高,患者總5年生存率仍然很低[1-2]。闡明HCC發(fā)病機(jī)制,找到新的、有效的治療策略是目前亟待解決問(wèn)題。生長(zhǎng)分化因子15(GDF15)是 TGF-β 超家族的成員,其多肽分子由一個(gè)29個(gè)氨基酸信號(hào)肽、一個(gè)112個(gè)氨基酸的成熟蛋白和一個(gè)167個(gè)氨基酸的前肽組成[3]。研究表明,GDF15在多種腫瘤如肺腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌中有較高表達(dá),并通過(guò)自分泌和旁分泌作用激活TGF-β/Smad、蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路和ErbB2/AKT1等信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡,促進(jìn)癌癥的發(fā)展[4-5]。本研究擬通過(guò)用短發(fā)夾RNA(shRNA)構(gòu)建人肝癌HepG2細(xì)胞GDF15穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞系(shGDF15),并檢測(cè)其增殖及遷移能力變化,為尋找HCC治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;大腸桿菌DH5α、干擾載體購(gòu)自廣州萊德盟生物科技有限公司;PLKO.1慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶 BglⅡ和 HindⅢ、DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa公司;Transwell小室、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)春久欣生物科技有限公司;LipofectamineTM2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、TRIzol 裂解液購(gòu)自Invitrogen 公司;兔抗人E-cadherin、Vimentin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;小鼠抗人GAPDH 抗體、GDF15抗體購(gòu)自武漢博士德公司;二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 購(gòu)自北京中杉金橋公司;ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司;其余均為國(guó)產(chǎn)進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2用含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng),隔日換液,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部90%左右時(shí)按1∶3傳代。

1.2.2GDF15 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 用PLKO.1慢病毒載體構(gòu)建并鑒定shGDF15表達(dá)載體。使用含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選重組質(zhì)粒。在提取和純化無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒后,使用 LipofectamineTM2000將 PLKO.1-sh-GDF15 載體和 Lenti-Easy 包裝混合物共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。然后,收集細(xì)胞上清液用于濃縮和純化。慢病毒滴度采用熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定。將shGDF15載體轉(zhuǎn)染到添加了聚凝胺的HepG2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h,加入嘌呤霉素(2 mg/mL)進(jìn)行抗性篩選,2 周后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。使用RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡測(cè)量轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞GDF15 mRNA表達(dá)水平 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型HEPG2細(xì)胞及shGDF15轉(zhuǎn)染細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后,以6×105/孔鋪于6孔板,待其完全貼壁后用無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,按TRIzol說(shuō)明書提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。按逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,含總RNA 1 μg,4×gDNA Erase-Out Mix 5 μL,42℃ 逆轉(zhuǎn)錄15 min,經(jīng)85℃ 5 s滅活逆轉(zhuǎn)酶活性后用于qPCR。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qPCR,反應(yīng)體系為20 μL,含cDNA模板2 μL,2×Q3 SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,經(jīng)95 ℃預(yù)變性2 min,經(jīng)95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共 40個(gè)循環(huán)后,以GAPDH為內(nèi)參,用2-ΔΔCT法計(jì)算GDF15 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。qPCR引物序列如下: GDF15上游5′-CA-ACTTCCGTGTGCTTTGGG-3′,下游5′-CAACG-TCTCTGCCTTCCACT-3′;GAPDH上游5′-CCT-CGCCTTTGCCGATCC-3′,下游5′-CGTGCTCGA-TGGGGTACTTC-3′。

1.2.4Western blot法檢測(cè) 用Western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞shGDF15轉(zhuǎn)染效果及GDF15低表達(dá)HepG2細(xì)胞E-cadherin和Vimentin相對(duì)表達(dá)量。按1.2.3所述接種并培養(yǎng)細(xì)胞,收集培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白,BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白,電泳結(jié)束后,進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜;5%的脫脂奶粉 TBST 緩沖液室溫封閉1 h;加適當(dāng)比例稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜;次日,TBST 洗膜10 min,共4次;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶10 000),室溫孵育1 h;TBST洗膜10 min,共4次;用ECL化學(xué)發(fā)光顯色后通過(guò)上海Tanon化學(xué)發(fā)光成像一體機(jī)拍照分析。所用一抗及稀釋比例:GDF15(1∶1 000)、E-cadherin抗體(1∶500)、Vimentin(1∶300)、GAPDH(1∶5 000)。

1.2.5CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性影響 對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的GDF15低表達(dá)HEPG2細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔接種于96孔板,于接種24、48和96 h后用CCK8法檢測(cè)其增殖活力,以空載體轉(zhuǎn)染的HEPG2做為對(duì)照。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 將細(xì)胞首先接種于6孔板中,待細(xì)胞匯合度達(dá)到>90%后,用200 μL無(wú)菌槍頭劃一橫線,PBS 洗滌3次,將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照。放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,再次用同樣方法對(duì)相對(duì)位置進(jìn)行觀察、拍照。選取5個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量、統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn) 用Transwell小室法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的遷移情況。將HEPG2細(xì)胞饑餓24 h后,胰酶消化,制備細(xì)胞懸液,PBS洗1次,將細(xì)胞濃度調(diào)整至4×105個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室中,下室中加入800 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,37℃孵育。24 h后,用棉簽擦去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞,甲醛固定10 min,0.1%的結(jié)晶紫室溫孵育10 min,PBS清洗3遍,將小室底面朝上于顯微鏡下拍照,隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)分析,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 GDF15低表達(dá)HEPG2細(xì)胞系的獲得與鑒定

用shHK2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選2周,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果超過(guò)90%,shGDF15組細(xì)胞GDF15 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于shNC組,見(jiàn)圖1。

圖1 GDF15敲低穩(wěn)定細(xì)胞株 HEPG2 細(xì)胞的獲得與鑒定

2.2 GDF15低表達(dá)細(xì)胞增殖活力檢測(cè)結(jié)果

在培養(yǎng)24、48及96 h后,GDF15低表達(dá)細(xì)胞的增殖活力均明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同組別肝癌細(xì)胞的 OD570 nm相對(duì)值比較

2.3 GDF15低表達(dá)HEPG2遷移能力檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,shGDF15組細(xì)胞劃痕填充面積明顯低于對(duì)照組,見(jiàn)圖2A。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2B,培養(yǎng)24 h后,shGDF15組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量為正常組的50%(45.2%～66.7%)左右,明顯低于正常組細(xì)胞數(shù)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 敲低GDF15對(duì)HEPG2 細(xì)胞遷移的影響

2.4 GDF15低表達(dá)HEPG2 E-cadherin和Vimentin表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示,shGDF15細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平明顯增加,Vimentin 表達(dá)水平明顯降低,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖3。

圖3 敲低GDF15對(duì)HEPG2 細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

增殖、遷移是腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)性狀,與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力高度相關(guān),是評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程,是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過(guò)程。E-cadherin為一種跨膜糖蛋白,屬上皮細(xì)胞鈣離子依賴的黏附分子家族,是常用的上皮細(xì)胞標(biāo)志物,與多種腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Vimentin屬于一種中間絲蛋白,在EMT過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞Vimentin表達(dá)上調(diào),是EMT的常用細(xì)胞標(biāo)志物。腫瘤細(xì)胞增殖能力、遷移能力及EMT程度是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要指標(biāo)[6]。本研究將shGDF15載體轉(zhuǎn)染到HEPG2肝癌細(xì)胞中,獲得了內(nèi)源性GDF15轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均降低的HEPG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。增殖活力檢測(cè)結(jié)果顯示,GDF15低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系增殖活力明顯下降,遷移能力顯著降低,同時(shí),E-cadherin表達(dá)水平明顯增加而Vimentin表達(dá)水平明顯降低,表明抑制GDF15表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

研究表明,GDF15在器官損傷、缺氧、腫瘤等多種疾病狀態(tài)下表達(dá)增加,并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移促進(jìn)癌癥發(fā)展[7-8]。近年來(lái),GDF15在肝癌發(fā)生、發(fā)展及治療中的意義引起了學(xué)者的重視。LIU等[9]對(duì)412例肝臟疾病患者血清和組織GDF15檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HCC患者血清GDF15水平顯著高于健康受試者及HBV和HCV攜帶者,而且,HCC癌巢中GDF15表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織和正常肝臟,提示血清GDF15有作為HCC的生物標(biāo)志物的價(jià)值。GDF15單克隆抗體可有效抑制小鼠原發(fā)肝癌腫瘤生長(zhǎng),降低Tregs在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中的比例,提高CD3+T細(xì)胞中IFN-γ+T細(xì)胞比例,降低IL-10+T細(xì)胞比例,提高CD4+和CD8+T細(xì)胞活性,表明有效抑制GDF15高表達(dá)可能抑制腫瘤生長(zhǎng)、逆轉(zhuǎn)腫瘤引發(fā)的免疫抑制作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性GDF15表達(dá)下降低后,肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化能力均顯著降低,靶向GDF15,抑制其表達(dá)及活性可能對(duì)HCC治療有利,當(dāng)然GDF15在HCC發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚需大量研究證實(shí)。