雞MyD88基因?qū)奘杉毎鲋澈偷蛲龅挠绊?/h1>
2023-09-25 11:33:58丁夢霞朱召巖于燕鴿王冰欣昝瑞隆田亞東孫桂榮韓瑞麗蔣瑞瑞康相濤閆峰賓
中國獸醫(yī)學報 2023年8期
丁夢霞,朱召巖,于燕鴿,王冰欣,昝瑞隆,田亞東,孫桂榮,韓瑞麗,蔣瑞瑞,康相濤,閆峰賓*
(1.河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,河南 鄭州450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院,河南 鄭州 450046)
髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子,在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[1-2]。Toll樣受體是重要的天然免疫受體家族,是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁?，F(xiàn)有研究證明,除了TLR3以外,MyD88參與了TLRs家族其他所有成員介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn),激活MyD88所介導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,可導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡,破壞機體免疫系統(tǒng)[4]。MyD88活化后能參與調(diào)控多條信號通路,從而影響機體的免疫、增殖、凋亡等生理過程[5]。細胞增殖和凋亡是生物生長發(fā)育的基礎(chǔ),雞巨噬細胞(HD11)的增殖和凋亡對維持家禽機體正常的器官結(jié)構(gòu)和免疫功能至關(guān)重要。目前有關(guān)MyD88的研究多集中在動物感染性疾病、人類腫瘤和小鼠腸道炎,而在家禽中的報道較少。迄今為止,未見MyD88基因在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中作用的相關(guān)報道。
在前期研究中,通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)MyD88基因在皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)誘導(dǎo)的雛雞應(yīng)激模型中通過TLR4/MyD88信號通路對雞的免疫功能具有潛在調(diào)節(jié)作用[6]。免疫功能的改變會影響動物的生長發(fā)育,體內(nèi)代謝紊亂,改變細胞周期進程,導(dǎo)致細胞異常凋亡等。MyD88作為連接先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因,在人和小鼠方面研究屢有報道,但是,其在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中的作用尚不明確。因此,為探究免疫相關(guān)基因MyD88對雞HD11細胞增殖和凋亡的影響,本試驗通過構(gòu)建MyD88基因過表達載體,以及合成干擾片段,并分別轉(zhuǎn)染至雞HD11細胞中,為深入解析MyD88基因在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中的作用提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料HD11細胞由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所趙桂蘋教授贈予;RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Biological Industries(BI)公司;CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;細胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司;MyD88過表達載體(pcDNA3.1-EGFP-MyD88)由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建;MyD88干擾片段(si-RNA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
1.2 HD11細胞的培養(yǎng)將HD11細胞復(fù)蘇后置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞密度達到90%以上,即可進行細胞傳代,待細胞傳代至F3代,即可用于后續(xù)試驗。
1.3 CCK-8檢測細胞活性將HD11細胞均勻鋪在96孔板中,待細胞完全貼壁后根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-EGFP-MyD88)和干擾片段(si-MyD88)及相應(yīng)對照pcDNA3.1-EGFP和si-NC,轉(zhuǎn)染12,24,36,48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h后,采用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測細胞吸光度。
1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期將HD11細胞均勻鋪在12孔板中培養(yǎng),待細胞完全貼壁后轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段和相應(yīng)的對照,轉(zhuǎn)染24 h后棄去培養(yǎng)基,1 500 r/min離心4 min,每管加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇,重懸細胞,4℃固定12 h,離心后,每管加入500 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液,利用流式細胞儀,標準程序下檢測細胞周期,利用FlowJo 7.6軟件分析結(jié)果。
1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將HD11細胞接種于12孔板中,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段和相應(yīng)的對照24 h后,棄去培養(yǎng)基,用無EDTA胰酶消化后,2 500 r/min離心2 min,每管加入1 mL PBS清洗2次,取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中,加入5 μL FITC Annexin V(組份 A)和2 μL PI(組份 B),室溫避光反應(yīng) 15 min,加入 400 μL 1×Annexin-binding buffer,混勻后,用流式細胞儀進行檢測(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:530 nm)。
1.6 qRT-PCR檢測MyD88對HD11細胞增殖和凋亡標志基因表達水平的影響轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段和相應(yīng)對照36 h后,收集細胞,TRIzol 法提取細胞的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,雞GAPDH基因為內(nèi)參,采用qRT-PCR檢測增殖和凋亡標志基因CCND1、PCNA、P21和Bax、Caspase 3、Caspase 9、Bcl-2基因的表達變化。引物序列信息見表1。
表1 qRT-PCR引物信息
2 結(jié)果
2.1 轉(zhuǎn)染MyD88基因過表達質(zhì)粒熒光結(jié)果將pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與pcDNA3.1-EGFP空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細胞24 h后,利用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。結(jié)果如圖1所示,細胞內(nèi)均能觀察到EGFP綠色熒光蛋白標簽表達,表明所構(gòu)建的MyD88過表達質(zhì)粒能夠正常轉(zhuǎn)染至HD11細胞,且正常表達EGFP綠色熒光蛋白標簽。
A.HD11細胞形態(tài);B.HD11細胞內(nèi)表達綠色熒光;C.A與B兩者融合
2.2 MyD88對HD11細胞活性的影響為檢測MyD88對HD11細胞活性的影響,在分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段及其相應(yīng)對照后,采用CCK-8檢測各組細胞的活性。結(jié)果顯示,與過表達對照組pcDNA3.1-EGFP相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒36,48 h HD11細胞活力顯著下降(圖2A,P<0.05);與NC干擾對照組相比,轉(zhuǎn)染si-MyD88干擾片段36,48 h HD11細胞活力顯著高于對照組(圖2B,P<0.05)。
A.過表達MyD88對HD11細胞的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞的影響;與對照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同
2.3 MyD88對HD11細胞周期的影響為檢測MyD88基因?qū)D11細胞周期的影響,在分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段及其相應(yīng)對照后,采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期分布情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)?？娠@著增加G2期細胞數(shù)(P<0.05),極顯著降低S期細胞數(shù)(P<0.01),抑制HD11細胞增殖(圖3A);轉(zhuǎn)染si-MyD88干擾片段可極顯著降低G1期細胞數(shù)(P<0.01),增加S期細胞數(shù)(P<0.01),促進HD11細胞增殖(圖3B)。
2.4 MyD88對HD11細胞增殖標志基因mRNA表達水平的影響為進一步確定MyD88對HD11細胞增殖的影響,采用qRT-PCR檢測增殖標志基因CCND1、PCNA和P21的mRNA表達水平。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒后促增殖標志基因CCND1和PCNA表達水平顯著降低(P<0.05),抑增殖基因P21顯著升高(P<0.05,圖4A);轉(zhuǎn)染si-MyD88干擾片段可顯著上調(diào)促增殖標志基因PCNA的表達(P<0.05),顯著下調(diào)抑增殖基因P21的表達(P<0.05,圖4B)。此結(jié)果與CCK-8和細胞周期結(jié)果一致,進一步說明MyD88基因?qū)D11細胞增殖具有抑制作用。
2.5 MyD88對HD11細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因表達水平的影響為檢測雞MyD88基因?qū)D11細胞凋亡的影響,在分別轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒和干擾片段及相應(yīng)對照后,采用流式細胞術(shù)和qRT-PCR法檢測MyD88過表達和干擾對細胞凋亡的作用。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒和干擾片段及相應(yīng)對照后,與對照組相比MyD88過表達組凋亡率極顯著升高(P<0.01,圖5A);轉(zhuǎn)染MyD88基因干擾片段后可與對照組相比可顯著降低HD11細胞凋亡(P<0.05,圖5B)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)?？娠@著上調(diào)Bax、Caspase 3和Caspase 9基因的表達水平(P<0.05),下調(diào)Bcl-2基因的表達水平(P<0.05)(圖6A);轉(zhuǎn)染MyD88基因干擾片段后可顯著下調(diào)Bax和Caspase 9的表達水平(P<0.05,圖6B),結(jié)果表明,雞MyD88基因?qū)D11細胞凋亡具有促進作用。
3 討論
細胞增殖是細胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的前提。當機體受到外界不良刺激時,免疫系統(tǒng)一方面可以通過募集組織中巨噬細胞來增強免疫反應(yīng);另一方面,巨噬細胞通過快速增殖和自我更新同樣可以起到增強免疫反應(yīng)作用[7-8]。細胞增殖是通過細胞周期來實現(xiàn)的,細胞周期調(diào)控異常易發(fā)生細胞癌變。細胞增殖伴隨多種基因的轉(zhuǎn)錄和細胞因子的表達,CCND1是細胞周期從G1期到S期通過限制點調(diào)節(jié)過渡的關(guān)鍵把關(guān)蛋白[9];PCNA是參與DNA代謝過程的重要蛋白質(zhì),阻斷該基因會抑制DNA合成,進而阻滯細胞周期,由于其在復(fù)制中的作用而被認為是增殖的分子標記物[10];細胞周期蛋白激酶抑制劑p21可以通過抑制PCNA的活性,誘導(dǎo)DNA損傷,從而引發(fā)細胞周期阻滯,抑制細胞增殖[11-12]。大量研究表明,MyD88的表達與腫瘤、癌癥及免疫性疾病有著密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)[13],激活MyD88上游基因TLR7后能夠通過抑制T細胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤的作用。本研究在轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒后,通過流式細胞術(shù)和qRT-PCR檢測HD11細胞增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MyD88過表達可顯著降低細胞周期中DNA合成期S期的占比率,下調(diào)增殖標志基因的表達水平,提示MyD88活化后可通過影響HD11細胞的DNA合成來調(diào)控HD11細胞的增殖,從而影響HD11細胞的生長發(fā)育。
A.過表達MyD88對HD11細胞增殖標志基因的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞增殖標志基因的影響
A.過表達MyD88對HD11細胞凋亡標志基因的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞凋亡標志基因的影響
細胞凋亡可以使免疫細胞由活化狀態(tài)進入凋亡狀態(tài),從而降低細胞免疫反應(yīng),凋亡是由多種凋亡調(diào)節(jié)因子嚴格控制的過程,而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系[14-15]。其中,Bcl-2可防止細胞凋亡,而Bax位于線粒體外膜,能促進線粒體釋放促凋亡因子,引發(fā)細胞凋亡[16]。Caspase 9能促進細胞凋亡并參與細胞因子加工[17];Caspase 3是一種常被激活的死亡蛋白酶,參與細胞解體和凋亡小體的形成,被廣泛用作凋亡的生物標志物[18]。研究發(fā)現(xiàn),當使用siRNA敲除TLR4基因后,發(fā)現(xiàn)能抑制凋亡基因Caspase 3、Caspase 9和Bax的激活從而防止小鼠心肌凋亡[19]。當細胞中MyD88濃度升高到一定水平時可激活NF-κB的大量分泌,破壞細胞免疫平衡,引起炎癥因子的大量釋放,導(dǎo)致細胞凋亡[20]。本研究通過流式細胞術(shù)及qRT-PCR方法檢測過表達和干擾MyD88對HD11細胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,MyD88過表達后可顯著提高HD11細胞的凋亡率,促進HD11細胞的凋亡;干擾MyD88基因可顯著降低HD11細胞的凋亡率,抑制HD11細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)[13],激活依賴性MyD88信號通路后能夠促進腎癌細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡,其機制是通過依賴Caspase和Bcl-2途徑誘導(dǎo)靶基因凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)[21],成纖維細胞生長因子21(FGF21)通過抑制MyD88所在的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來抑制細胞凋亡。這與本研究通過干擾MyD88基因降低HD11細胞凋亡率結(jié)果一致。
綜合以上結(jié)果推測,MyD88基因能通過在雞HD11細胞中高表達,抑制HD11細胞的DNA合成期來抑制細胞的增殖,阻滯細胞周期進程導(dǎo)致細胞異常凋亡,其機制可能是通過激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,導(dǎo)致HD11細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),從而破壞細胞的免疫平衡。
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丁夢霞,朱召巖,于燕鴿,王冰欣,昝瑞隆,田亞東,孫桂榮,韓瑞麗,蔣瑞瑞,康相濤,閆峰賓*
(1.河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,河南 鄭州450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院,河南 鄭州 450046)
髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子,在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[1-2]。Toll樣受體是重要的天然免疫受體家族,是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁?，F(xiàn)有研究證明,除了TLR3以外,MyD88參與了TLRs家族其他所有成員介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn),激活MyD88所介導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,可導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡,破壞機體免疫系統(tǒng)[4]。MyD88活化后能參與調(diào)控多條信號通路,從而影響機體的免疫、增殖、凋亡等生理過程[5]。細胞增殖和凋亡是生物生長發(fā)育的基礎(chǔ),雞巨噬細胞(HD11)的增殖和凋亡對維持家禽機體正常的器官結(jié)構(gòu)和免疫功能至關(guān)重要。目前有關(guān)MyD88的研究多集中在動物感染性疾病、人類腫瘤和小鼠腸道炎,而在家禽中的報道較少。迄今為止,未見MyD88基因在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中作用的相關(guān)報道。
在前期研究中,通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)MyD88基因在皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)誘導(dǎo)的雛雞應(yīng)激模型中通過TLR4/MyD88信號通路對雞的免疫功能具有潛在調(diào)節(jié)作用[6]。免疫功能的改變會影響動物的生長發(fā)育,體內(nèi)代謝紊亂,改變細胞周期進程,導(dǎo)致細胞異常凋亡等。MyD88作為連接先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因,在人和小鼠方面研究屢有報道,但是,其在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中的作用尚不明確。因此,為探究免疫相關(guān)基因MyD88對雞HD11細胞增殖和凋亡的影響,本試驗通過構(gòu)建MyD88基因過表達載體,以及合成干擾片段,并分別轉(zhuǎn)染至雞HD11細胞中,為深入解析MyD88基因在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中的作用提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料HD11細胞由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所趙桂蘋教授贈予;RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Biological Industries(BI)公司;CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;細胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司;MyD88過表達載體(pcDNA3.1-EGFP-MyD88)由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建;MyD88干擾片段(si-RNA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
1.2 HD11細胞的培養(yǎng)將HD11細胞復(fù)蘇后置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞密度達到90%以上,即可進行細胞傳代,待細胞傳代至F3代,即可用于后續(xù)試驗。
1.3 CCK-8檢測細胞活性將HD11細胞均勻鋪在96孔板中,待細胞完全貼壁后根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-EGFP-MyD88)和干擾片段(si-MyD88)及相應(yīng)對照pcDNA3.1-EGFP和si-NC,轉(zhuǎn)染12,24,36,48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h后,采用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測細胞吸光度。
1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期將HD11細胞均勻鋪在12孔板中培養(yǎng),待細胞完全貼壁后轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段和相應(yīng)的對照,轉(zhuǎn)染24 h后棄去培養(yǎng)基,1 500 r/min離心4 min,每管加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇,重懸細胞,4℃固定12 h,離心后,每管加入500 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液,利用流式細胞儀,標準程序下檢測細胞周期,利用FlowJo 7.6軟件分析結(jié)果。
1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將HD11細胞接種于12孔板中,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段和相應(yīng)的對照24 h后,棄去培養(yǎng)基,用無EDTA胰酶消化后,2 500 r/min離心2 min,每管加入1 mL PBS清洗2次,取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中,加入5 μL FITC Annexin V(組份 A)和2 μL PI(組份 B),室溫避光反應(yīng) 15 min,加入 400 μL 1×Annexin-binding buffer,混勻后,用流式細胞儀進行檢測(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:530 nm)。
1.6 qRT-PCR檢測MyD88對HD11細胞增殖和凋亡標志基因表達水平的影響轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段和相應(yīng)對照36 h后,收集細胞,TRIzol 法提取細胞的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,雞GAPDH基因為內(nèi)參,采用qRT-PCR檢測增殖和凋亡標志基因CCND1、PCNA、P21和Bax、Caspase 3、Caspase 9、Bcl-2基因的表達變化。引物序列信息見表1。
表1 qRT-PCR引物信息
2 結(jié)果
2.1 轉(zhuǎn)染MyD88基因過表達質(zhì)粒熒光結(jié)果將pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與pcDNA3.1-EGFP空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細胞24 h后,利用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。結(jié)果如圖1所示,細胞內(nèi)均能觀察到EGFP綠色熒光蛋白標簽表達,表明所構(gòu)建的MyD88過表達質(zhì)粒能夠正常轉(zhuǎn)染至HD11細胞,且正常表達EGFP綠色熒光蛋白標簽。
A.HD11細胞形態(tài);B.HD11細胞內(nèi)表達綠色熒光;C.A與B兩者融合
2.2 MyD88對HD11細胞活性的影響為檢測MyD88對HD11細胞活性的影響,在分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段及其相應(yīng)對照后,采用CCK-8檢測各組細胞的活性。結(jié)果顯示,與過表達對照組pcDNA3.1-EGFP相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒36,48 h HD11細胞活力顯著下降(圖2A,P<0.05);與NC干擾對照組相比,轉(zhuǎn)染si-MyD88干擾片段36,48 h HD11細胞活力顯著高于對照組(圖2B,P<0.05)。
A.過表達MyD88對HD11細胞的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞的影響;與對照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同
2.3 MyD88對HD11細胞周期的影響為檢測MyD88基因?qū)D11細胞周期的影響,在分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒與si-MyD88基因干擾片段及其相應(yīng)對照后,采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期分布情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)?？娠@著增加G2期細胞數(shù)(P<0.05),極顯著降低S期細胞數(shù)(P<0.01),抑制HD11細胞增殖(圖3A);轉(zhuǎn)染si-MyD88干擾片段可極顯著降低G1期細胞數(shù)(P<0.01),增加S期細胞數(shù)(P<0.01),促進HD11細胞增殖(圖3B)。
2.4 MyD88對HD11細胞增殖標志基因mRNA表達水平的影響為進一步確定MyD88對HD11細胞增殖的影響,采用qRT-PCR檢測增殖標志基因CCND1、PCNA和P21的mRNA表達水平。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質(zhì)粒后促增殖標志基因CCND1和PCNA表達水平顯著降低(P<0.05),抑增殖基因P21顯著升高(P<0.05,圖4A);轉(zhuǎn)染si-MyD88干擾片段可顯著上調(diào)促增殖標志基因PCNA的表達(P<0.05),顯著下調(diào)抑增殖基因P21的表達(P<0.05,圖4B)。此結(jié)果與CCK-8和細胞周期結(jié)果一致,進一步說明MyD88基因?qū)D11細胞增殖具有抑制作用。
2.5 MyD88對HD11細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因表達水平的影響為檢測雞MyD88基因?qū)D11細胞凋亡的影響,在分別轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒和干擾片段及相應(yīng)對照后,采用流式細胞術(shù)和qRT-PCR法檢測MyD88過表達和干擾對細胞凋亡的作用。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒和干擾片段及相應(yīng)對照后,與對照組相比MyD88過表達組凋亡率極顯著升高(P<0.01,圖5A);轉(zhuǎn)染MyD88基因干擾片段后可與對照組相比可顯著降低HD11細胞凋亡(P<0.05,圖5B)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)?？娠@著上調(diào)Bax、Caspase 3和Caspase 9基因的表達水平(P<0.05),下調(diào)Bcl-2基因的表達水平(P<0.05)(圖6A);轉(zhuǎn)染MyD88基因干擾片段后可顯著下調(diào)Bax和Caspase 9的表達水平(P<0.05,圖6B),結(jié)果表明,雞MyD88基因?qū)D11細胞凋亡具有促進作用。
3 討論
細胞增殖是細胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的前提。當機體受到外界不良刺激時,免疫系統(tǒng)一方面可以通過募集組織中巨噬細胞來增強免疫反應(yīng);另一方面,巨噬細胞通過快速增殖和自我更新同樣可以起到增強免疫反應(yīng)作用[7-8]。細胞增殖是通過細胞周期來實現(xiàn)的,細胞周期調(diào)控異常易發(fā)生細胞癌變。細胞增殖伴隨多種基因的轉(zhuǎn)錄和細胞因子的表達,CCND1是細胞周期從G1期到S期通過限制點調(diào)節(jié)過渡的關(guān)鍵把關(guān)蛋白[9];PCNA是參與DNA代謝過程的重要蛋白質(zhì),阻斷該基因會抑制DNA合成,進而阻滯細胞周期,由于其在復(fù)制中的作用而被認為是增殖的分子標記物[10];細胞周期蛋白激酶抑制劑p21可以通過抑制PCNA的活性,誘導(dǎo)DNA損傷,從而引發(fā)細胞周期阻滯,抑制細胞增殖[11-12]。大量研究表明,MyD88的表達與腫瘤、癌癥及免疫性疾病有著密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)[13],激活MyD88上游基因TLR7后能夠通過抑制T細胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤的作用。本研究在轉(zhuǎn)染MyD88過表達質(zhì)粒后,通過流式細胞術(shù)和qRT-PCR檢測HD11細胞增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MyD88過表達可顯著降低細胞周期中DNA合成期S期的占比率,下調(diào)增殖標志基因的表達水平,提示MyD88活化后可通過影響HD11細胞的DNA合成來調(diào)控HD11細胞的增殖,從而影響HD11細胞的生長發(fā)育。
A.過表達MyD88對HD11細胞增殖標志基因的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞增殖標志基因的影響
A.過表達MyD88對HD11細胞凋亡標志基因的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞凋亡標志基因的影響
細胞凋亡可以使免疫細胞由活化狀態(tài)進入凋亡狀態(tài),從而降低細胞免疫反應(yīng),凋亡是由多種凋亡調(diào)節(jié)因子嚴格控制的過程,而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系[14-15]。其中,Bcl-2可防止細胞凋亡,而Bax位于線粒體外膜,能促進線粒體釋放促凋亡因子,引發(fā)細胞凋亡[16]。Caspase 9能促進細胞凋亡并參與細胞因子加工[17];Caspase 3是一種常被激活的死亡蛋白酶,參與細胞解體和凋亡小體的形成,被廣泛用作凋亡的生物標志物[18]。研究發(fā)現(xiàn),當使用siRNA敲除TLR4基因后,發(fā)現(xiàn)能抑制凋亡基因Caspase 3、Caspase 9和Bax的激活從而防止小鼠心肌凋亡[19]。當細胞中MyD88濃度升高到一定水平時可激活NF-κB的大量分泌,破壞細胞免疫平衡,引起炎癥因子的大量釋放,導(dǎo)致細胞凋亡[20]。本研究通過流式細胞術(shù)及qRT-PCR方法檢測過表達和干擾MyD88對HD11細胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,MyD88過表達后可顯著提高HD11細胞的凋亡率,促進HD11細胞的凋亡;干擾MyD88基因可顯著降低HD11細胞的凋亡率,抑制HD11細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)[13],激活依賴性MyD88信號通路后能夠促進腎癌細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡,其機制是通過依賴Caspase和Bcl-2途徑誘導(dǎo)靶基因凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)[21],成纖維細胞生長因子21(FGF21)通過抑制MyD88所在的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來抑制細胞凋亡。這與本研究通過干擾MyD88基因降低HD11細胞凋亡率結(jié)果一致。
綜合以上結(jié)果推測,MyD88基因能通過在雞HD11細胞中高表達,抑制HD11細胞的DNA合成期來抑制細胞的增殖,阻滯細胞周期進程導(dǎo)致細胞異常凋亡,其機制可能是通過激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,導(dǎo)致HD11細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),從而破壞細胞的免疫平衡。
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