浙江省豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分子流行病學(xué)調(diào)查

陳怡潔,袁秀芳,徐麗華,余 斌,蘇 菲,葉十一,盧碧凱,蔣利明,張 暉,李軍星*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528231;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,浙江 杭州 310021;3.浙江省臺(tái)州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,浙江 臺(tái)州 317700)

在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中,腹瀉是豬群最常見(jiàn)的疾病之一,各個(gè)階段的豬只均容易發(fā)生。有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)表明,細(xì)菌性腹瀉發(fā)病率占腹瀉病的大部分比例,對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)危害巨大,尤其是哺乳仔豬和保育仔豬,由于日齡小,機(jī)體抗應(yīng)激力差,病死率也更高[1]。臨床常見(jiàn)細(xì)菌性腹瀉往往由腸道致病性大腸桿菌感染引起。致病性大腸桿菌可分為多種,包括腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)、腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli,EPEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicE.coli,EHEC)、腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregativeE.coli,EAEC)及腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasiveE.coli,EIEC)。一般通過(guò)對(duì)致病性大腸桿菌進(jìn)行毒力因子檢測(cè)可確定其類型[2]。不同的致病因子可以誘導(dǎo)具有特定流行病學(xué)和病理特征的臨床癥狀。其中ETEC是引起新生仔豬和仔豬斷奶后腹瀉(postweaning diarrhea,PWD)的主要病原,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

ETEC是豬最重要的致病型菌株,包括能產(chǎn)生一種或幾種腸毒素引起分泌性腹瀉的菌株[3]。ETEC常見(jiàn)的菌毛黏附素有F4 (K88)、F5 (K99)、F6 (987P)、F18和F41,其首先在黏附素的介導(dǎo)下,黏附到仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的受體上,通過(guò)這種黏附可以避免腸道蠕動(dòng)而導(dǎo)致的脫落并穩(wěn)定地定植在上面,然后通過(guò)分泌腸毒素引起機(jī)體水、電解質(zhì)紊亂而最終導(dǎo)致腹瀉[4]。豬ETEC主要產(chǎn)生兩類腸毒素:熱穩(wěn)定毒素(ST)和熱敏感毒素(LT)[5]。根據(jù)在甲醇中的溶解性和生化特性,ST 又進(jìn)一步分為 STa和STb[6-7]。而且,LT有兩個(gè)亞單位,LT-I和LT-Ⅱ (也被稱為L(zhǎng)Ta和LTb)已有報(bào)道[8]。對(duì)大腸桿菌毒力因子分布和變遷的深入研究有助于及時(shí)調(diào)整仔豬大腸桿菌性腹瀉的預(yù)防及治療措施具有重要意義。ETEC和腸道正常大腸桿菌用細(xì)菌培養(yǎng)和生化反應(yīng)難以區(qū)分,血清鑒定不夠敏感和特異,故主要通過(guò)檢測(cè)腸毒素基因的有無(wú)鑒定ETEC[9]。本研究采用PCR技術(shù)對(duì)浙江地區(qū)大腸桿菌腸毒素及黏附素基因進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)大腸桿菌腸毒素及黏附素的流行分布情況,旨在為浙江省仔豬大腸桿菌性腹瀉病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基(含5%綿羊血)及LB培養(yǎng)基,按常規(guī)方法制備;FineMag快速磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、DL1000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;電泳級(jí)瓊脂糖購(gòu)自上海貝晶生物技術(shù)有限公司;GoldView新型核酸染料購(gòu)自賽百威公司。

1.2 主要儀器恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9270型)購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;全自動(dòng)核酸提取儀(Auto-Pure 32SH)購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司;基因擴(kuò)增儀(TPROFESSIONAL)購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份公司;瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-6C型)購(gòu)自北京六一儀器廠;瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(BioSpectrum,UVP)。

1.3 樣本采集及處理采集2014-2021年期間浙江省各地送檢至浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜禽疫病診療中心的腹瀉豬群小腸組織樣品、肛拭子和新鮮糞便。新鮮糞便或小腸內(nèi)容物直接劃線接種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基及血瓊脂培養(yǎng)基(含5%綿羊血),肛拭子置于無(wú)菌離心管中加入滅菌PBS混勻后劃線接種,37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)18～24 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況。然后挑取粉紅色或紅色疑似大腸桿菌單菌落于LB試管中,37℃搖床180 r/min培養(yǎng)6～8 h,與50%甘油1∶1混合裝于凍存管中,于-30℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 疑似致病菌的分離首先觀察血瓊脂培養(yǎng)基(含5%綿羊血)上的大菌落周圍有無(wú)溶血環(huán),選擇有明顯溶血環(huán)的菌落進(jìn)行鑒定。若無(wú)溶血性菌落生長(zhǎng),則在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上選擇生長(zhǎng)良好、光滑隆起、邊緣整齊的圓形紅色或粉紅色菌落,按常規(guī)方法涂片,革蘭染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 腸內(nèi)容物、糞樣總DNA的提取在96深孔板的第2,8列中分別加入200 μL預(yù)處理好的腸內(nèi)容物、肛拭子、新鮮糞便樣品和20 μL 蛋白酶 K,放入全自動(dòng)核酸提取儀,按試劑盒說(shuō)明書(shū)程序進(jìn)行自動(dòng)化提取,自動(dòng)化程序結(jié)束后,將第6,12列的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的無(wú)核酸酶離心管中供PCR擴(kuò)增用。

1.6 純培養(yǎng)菌體基因組DNA的提取取純培養(yǎng)大腸桿菌菌液500 μL,12 000 r/min離心5 min;棄上清,加入400 μL Tris (0.000 5% Tween-20,0.1 mol/L Tris,pH 8.5)重懸菌體,再加入10 μL蛋白酶K (20 g/L),56℃水浴40 min;然后100℃作用10 min,12 000 r/min離心1 min。取上清作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.7 ETEC的鑒定采用PCR檢測(cè)方法,快速對(duì)疑似菌株進(jìn)行分類和篩選,ETEC腸毒素及黏附素?cái)U(kuò)增引物序列參照文獻(xiàn)[10-12],詳見(jiàn)表1。用腸毒素(STa、STb、LT)和黏附素(987P、F18、F41、K88、K99)基因的引物對(duì)腸內(nèi)容物或糞樣總DNA進(jìn)行擴(kuò)增,如有任何上述毒力因子擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性,則從生長(zhǎng)的菌落中進(jìn)行鑒定,直至篩選出相關(guān)毒力因子陽(yáng)性的菌落。PCR擴(kuò)增體系(25 μL):ddH2O 16.2 μL,dNTP Mix 5 μL,10×Buffer 2.5 μL,上、下游引物各1 μL,rTaq 0.3 μL,Template 1 μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,33個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL與1 μL上樣緩沖液混合,加樣于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.005% GoldView DNA染料),以5 V/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度于1×TAE緩沖液中電泳,通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶大小并分析結(jié)果。

表1 ETEC腸毒素和黏附素引物信息

1.8 ETEC毒力因子模式統(tǒng)計(jì)不同菌株可能攜帶有不同的毒力基因,ETEC菌株中可能存在一種或幾種毒力基因[13],用同一菌株的上述8個(gè)毒力因子基因的擴(kuò)增結(jié)果表示該菌株的毒力因子模式,所有毒力因子基因擴(kuò)增結(jié)果均相同的2個(gè)菌株定義為同一毒力因子模式,有至少1對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果不同的則認(rèn)為2個(gè)菌株屬于不同的毒力因子模式。

1.9 ETEC致病性試驗(yàn)根據(jù)毒力因子模式數(shù)確定分組數(shù),另設(shè)1個(gè)攻毒對(duì)照組,1個(gè)不做任何處理的空白對(duì)照組,每組5只小鼠,分組方案見(jiàn)表2。將各毒力因子模式代表菌株復(fù)蘇純化后接種到LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期8～12 h,并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),用PBS將菌液濃度稀釋到1.0×109CFU/mL,抽取0.2 mL菌液口腔灌服5只小鼠,對(duì)照組小鼠灌服等量PBS,觀察小鼠發(fā)病及死亡情況,解剖死亡小鼠,分離病原菌并鑒定。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集所有存活小鼠的腸內(nèi)容物,并通過(guò)細(xì)菌分離鑒定檢測(cè)其是否仍攜帶相應(yīng)攻毒菌株。

表2 試驗(yàn)分組及攻毒方案

2 結(jié)果

2.1 ETEC的分離與鑒定對(duì)分離得到的大腸桿菌進(jìn)行革蘭染色,鏡檢可見(jiàn)紅色、兩端鈍圓的短小桿菌,單個(gè)、成對(duì)或成叢排列,無(wú)芽孢。經(jīng)PCR及瓊脂糖凝膠電泳分析,共檢出腸毒素(STa、STb、LT)和黏附素(F18、K88)等毒力基因的DNA條帶,與預(yù)期大小相符(圖1)。

M.DL1000 DNA Ladder;1～5.分別為STa、STb、LT、F18及K88基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 ETEC的流行特點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)室自2014年開(kāi)始系統(tǒng)從送檢的腹瀉病豬樣品中進(jìn)行ETEC的分離鑒定,由于受2018年非洲豬瘟傳入我國(guó)的影響,出于生物安全考慮,養(yǎng)殖場(chǎng)送檢意愿降低,2019-2020年收到養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的腹瀉樣品數(shù)量明顯減少(表3),而2020年我國(guó)飼料全面禁抗,2021年收到腹瀉樣品數(shù)量增多。2014-2019年腹瀉病豬樣品中ETEC的分離率不高于20.2%,2020-2021年ETEC的分離率大幅增加至67.8%。從圖3可以看出,2014-2018年從送檢病料中分離到的ETEC菌株為年均13株,其中產(chǎn)房仔豬分離株占28.1%,2020-2021年ETEC分離株迅速增加到年均36株,且產(chǎn)房仔豬分離株占比例提高至48.2%。結(jié)果表明我國(guó)2020年飼料禁抗后,浙江省腹瀉豬群ETEC感染的病例數(shù)量明顯上升,以斷奶前后仔豬腹瀉為主要臨床表現(xiàn),且發(fā)病日齡趨早(圖2)。

2.3 毒力基因及其分布檢測(cè)結(jié)果如表4所示,在采集到的大腸桿菌分離株中,137株檢測(cè)出毒力因子相關(guān)基因陽(yáng)性。腸毒素基因中,STb (129/137,94.2%)最常見(jiàn),其次是STa(64/137,46.7%)和LT (62/137,45.3%);黏附素基因以F18(56/137,40.9%)最占優(yōu)勢(shì),其次為K88(28/137,20.4%),未檢測(cè)到K99和987P及F41等黏附素。

表3 2014-2021年ETEC分離率統(tǒng)計(jì)

圖2 不同生長(zhǎng)階段病例所占比例

由圖3可以看出,在所有被檢測(cè)的日齡段中,腸毒素STb均為檢出率最高的腸毒素,且隨著日齡增加檢出率逐漸降低。黏附素F18隨著仔豬日齡的增加檢出率不斷增加;K88黏附素在各個(gè)生長(zhǎng)階段均能檢出,尤其在產(chǎn)房仔豬中檢出率最高。

表4 137株ETEC分離株中毒力因子檢出結(jié)果

2.4 毒力因子模式統(tǒng)計(jì)按照ETEC菌株所攜帶的黏附素和腸毒素基因的種類及數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),137個(gè)臨床分離株共產(chǎn)生了16個(gè)毒力因子模式,平均每8.6個(gè)菌株產(chǎn)生一種不同的毒力因子模式(表5),39.4%的ETEC菌株僅攜帶腸毒素基因且檢測(cè)不到經(jīng)典的黏附素基因,而另有1.5%的菌株則與之相反。有27.7%的菌株攜帶所檢測(cè)的全部3種腸毒素基因,但并未檢測(cè)到同時(shí)攜帶2種及以上黏附素基因的菌株。

圖3 不同生長(zhǎng)階段豬群ETEC菌株中毒力因子基因的檢出率

從同一養(yǎng)殖場(chǎng)5頭典型發(fā)病豬的肛拭子中,隨機(jī)挑選25個(gè)單菌落進(jìn)行8種毒力基因擴(kuò)增,最終篩選到3種不同毒力因子模式的菌株(表6),說(shuō)明同一豬群內(nèi)可能存在多種菌株的共同感染,對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷以及臨床治療帶來(lái)較大的挑戰(zhàn)。

表5 ETEC分離株中毒力基因模式統(tǒng)計(jì)

表6 同一養(yǎng)殖場(chǎng)ETEC分離株中毒力基因模式統(tǒng)計(jì)

2.5 ETEC分離菌株感染小鼠臨床癥狀及帶菌率檢測(cè)結(jié)果

2.5.1小鼠臨床癥狀 空白對(duì)照組和攻毒對(duì)照組小鼠背毛光滑、精神活躍、肛周清潔、剖檢腸道顏色正常、質(zhì)地緊密。各攻毒組小鼠在攻毒6 h后,均出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、被毛凌亂、呼吸急促等癥狀;12 h后,大多數(shù)小鼠出現(xiàn)拱背發(fā)抖、蜷臥少動(dòng)的現(xiàn)象,其中LT-F18、STa-STb、STb-F18、STb-K88、LT-STa-STb-F18、LT-STa-STb-K88的ETEC攻毒組小鼠眼周分泌物增加,且STa-STb-F18、LT-STb-K88、STb、STb-F18、LT-STb-F18、LT-STa-STb-F18的ETEC攻毒組小鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;24～36 h后,LT-STa-STb-K88毒力因子的ETEC攻毒組死亡小鼠增加;36 h后存活的小鼠癥狀減輕,開(kāi)始進(jìn)食且行為活躍;48 h后基本恢復(fù)正常狀態(tài);72 h后所有癥狀消失,期間未見(jiàn)腹瀉小鼠。毒力因子模式為STb-F18 的ETEC代表菌株致死率最高, 達(dá)到40%;STb、LT-F18、LT-STb-F18、LT-STb-K88、STa-STb-F18、LT-STa-STb-F18、LT-STa-STb-K88的ETEC致死率為20%,其余8種毒力因子模式的ETEC攻毒組未出現(xiàn)死亡(表7)。

2.5.2攻毒康復(fù)小鼠的ETEC帶菌率 由于攻毒72 h后所有存活小鼠恢復(fù)正常狀態(tài),因此在攻毒后7 d結(jié)束試驗(yàn),解剖小鼠,取腸內(nèi)容物,分離并鑒定相應(yīng)攻毒菌株。毒力基因攜帶情況的檢測(cè)結(jié)果顯示,STa-STb、STb-F18及 STb攻毒組的ETEC檢出率較高,分別為100%,100%,75%; F18、STa-STb-K88、LT-STb-F18、STa-STb-F18、STb-K88、LT-STa-STb、LT-STb-K88及LT-STa-STb-K88攻毒組的ETEC檢出率介于25%～60%之間,其余5種毒力因子模式的ETEC檢出率為0(表7)。

3 討論

在抗菌藥減量化、飼料環(huán)?；?兩化)背景下,從2020年開(kāi)始我國(guó)全面禁止飼料中促生長(zhǎng)類抗生素等藥物的添加。在飼料端“禁抗”的同時(shí),要求在養(yǎng)殖端也要“減抗/替抗”。然而國(guó)外的禁抗歷程表明,在禁抗初期,會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的快速反彈,引起豬場(chǎng)病死率的升高[14-15]。自禁抗以來(lái),我國(guó)產(chǎn)房、保育及育肥階段細(xì)菌性腹瀉病發(fā)病率及病死率明顯上升,呈現(xiàn)出與國(guó)外禁抗初期類似的現(xiàn)象[16]。

從近年浙江省各地腹瀉發(fā)病豬群送檢病料中分離到的腸道內(nèi)致病菌株以腸毒素大腸桿菌為主,共分離得到137株腸毒素性大腸桿菌,部分豬場(chǎng)內(nèi)同時(shí)存在多種毒力因子模式的菌株共同感染。其中129株分離菌株擴(kuò)增出腸毒素STb、64株擴(kuò)增出腸毒素STa、62株擴(kuò)增出腸毒素LT,檢測(cè)出浙江省主要流行腸毒素類型為STb (129/137,94.2%),其次是STa (64/137,46.7%),這與OJENIYI等[17]關(guān)于STa 或/和STb是腸毒素性大腸桿菌中最為常見(jiàn)的毒力因子以及姜中其等[18]研究了浙江省10個(gè)豬場(chǎng)斷奶腹瀉仔豬的大腸桿菌毒力因子,認(rèn)為該地區(qū)腸毒素以STa、STb為主等報(bào)道相吻合。而王春江等[19]調(diào)查了陜西省104株分離自腹瀉仔豬體內(nèi)的大腸桿菌,檢出腸毒素陽(yáng)性率為43.27%,優(yōu)勢(shì)腸毒素是STa,說(shuō)明不同地區(qū)流行菌株所攜帶的優(yōu)勢(shì)腸毒素有所差異。有研究人員用不同方法對(duì)我國(guó)東南部分地區(qū)不同時(shí)期致仔豬黃、白痢大腸桿菌黏附素進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏附素的種類在不同時(shí)期發(fā)生了較大的變化,但F18和K88始終占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[20-22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,40.9% (56/137)的大腸桿菌含有編碼F18的基因。國(guó)外不同地區(qū)的學(xué)者報(bào)道的F18陽(yáng)性率差異較大,WITTIG等[23]報(bào)道,F18陽(yáng)性率高達(dá)75%,而NIETFELD等[24]發(fā)現(xiàn)F18陽(yáng)性率有21.0%。同時(shí),本研究中 K88陽(yáng)性分離株占總菌株數(shù)的20.4% (28/137),與國(guó)外報(bào)道的73%相比陽(yáng)性率較低[24],但與OJENIYI等[17]發(fā)現(xiàn)25.8%的PWD大腸桿菌含K88菌毛相近。本試驗(yàn)未檢測(cè)到987P、F41及K99等黏附素,與FRANCIS等[25]報(bào)道表達(dá)987P、F41或K99的大腸桿菌菌株,已經(jīng)變得越來(lái)越少,甚至很少分離到的結(jié)果相符。結(jié)果顯示,在浙江省流行的黏附素類型主要為F18,占檢測(cè)陽(yáng)性樣品的40.9%,而K88僅占檢出陽(yáng)性樣品的20.4%,說(shuō)明ETEC黏附素的檢出率在時(shí)間和空間上具有差異性。

表7 不同毒力因子模式ETEC感染對(duì)小鼠的 致病性檢測(cè)結(jié)果 %

本研究結(jié)果表明,ETEC毒素類型的分布與仔豬的日齡關(guān)系密切。在檢測(cè)的腸毒素中, STb無(wú)論在哪個(gè)日齡階段都占有優(yōu)勢(shì);產(chǎn)房仔豬ETEC分離株K88檢出率稍高于F18檢出率,而保育及育肥階段F18檢出率都明顯高于K88。此外,隨著日齡的增加,K88的檢出率先下降后又增加,這與文獻(xiàn)報(bào)道的不一致[5,26],也說(shuō)明了ETEC黏附素的流行在時(shí)間和空間上具有差異性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的流行與仔豬日齡的關(guān)系很密切[27],這可能與仔豬的生理特點(diǎn)有關(guān)。

分離到的致病性大腸桿菌腸毒素多和黏附素基因相關(guān),共有93株菌同時(shí)表達(dá)腸毒素和黏附素,占檢出總數(shù)的67.4%。姜中其等[18]研究表明,大腸桿菌菌毛與腸毒素相關(guān)性達(dá)67.86%,與本研究結(jié)果相似。另外,值得注意的是有些菌株黏附素檢測(cè)陰性卻含有腸毒素基因,這些菌株是否含有本試驗(yàn)檢測(cè)的5種黏附素以外的新型黏附素尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)對(duì)8種常見(jiàn)毒力因子進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,腸毒素性大腸桿菌中常含有1～4 種毒力因子,但多種毒力因子共存于同一菌株中的情況也比較普遍。不同豬源ETEC菌株攜帶的毒力因子存在差異,且ETEC的致病性與其攜帶的毒力因子相關(guān)。為驗(yàn)證含有不同毒力因子模式的ETEC菌株的致病性,通過(guò)灌胃感染小鼠,試驗(yàn)中小鼠未出現(xiàn)腹瀉癥狀,這與高瑞娟[28]的研究中僅口腔灌服牛源致病性大腸桿菌,小鼠不出現(xiàn)腹瀉的臨床癥狀相吻合,因此豬源ETEC對(duì)小鼠的致病特性與其對(duì)豬的致病特性存在明顯差異。試驗(yàn)結(jié)果顯示,STb-F18毒力因子模式的菌株致死率最高,但其他含有STb-F18毒力因子的ETEC菌株如LT-STa-STb-F18-K88致死率明顯不同,這表明有除本試驗(yàn)檢測(cè)的8種毒力因子以外的其他因素發(fā)揮致病作用。攻毒7 d 后不同組的小鼠腸內(nèi)容物的致病菌帶菌率差異明顯,說(shuō)明一部分ETEC能夠在小鼠體內(nèi)存活,同時(shí)會(huì)在環(huán)境中持續(xù)傳播,成為導(dǎo)致豬群細(xì)菌性腹瀉的傳播媒介。此外,ETEC可能會(huì)隨著年代變遷獲得新的毒力因子[3],有必要定期檢測(cè)毒力因子,準(zhǔn)確掌握其動(dòng)態(tài),以便更有效地防制大腸桿菌引發(fā)的流行性疾病。