基于D值法的煙草苗期抗旱評價方法研究及抗旱材料篩選

陳 剛, 喻奇?zhèn)? 熊 晶, 舒彥淇, 陸安彬, 龍本山, 劉仁祥

(1.貴州大學農(nóng)學院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室, 貴陽 550025; 2.貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室, 貴陽 550025;3.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司, 貴州 畢節(jié) 551700)

干旱是影響作物生長的主要非生物脅迫因子之一,干旱脅迫會導致作物減產(chǎn)50%甚至于全年失收[1]。煙草 (NicotianatabacumL.)起源于熱帶,整個生育期需水量較大[2-3]。干旱脅迫會影響煙葉生長發(fā)育,導致產(chǎn)量降低與品質(zhì)下降[4-5]。煙草是我國西南地區(qū)鄉(xiāng)村振興的重要經(jīng)濟作物,而西南地區(qū)春旱時常發(fā)生,對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生了明顯的不利影響[6]。因此,選擇和培育苗期煙草抗旱品種對我國煙葉生產(chǎn)具有重要意義。作物的抗旱性是干旱脅迫下多種生理代謝作用的結(jié)果,難以用某種單一的指標來對其進行評價[7-8]。目前,對抗旱性進行評價主要是通過綜合評價法[9]。在綜合評價中,抗旱系數(shù)(DC)能夠消除各指標量綱差異,還能表示各材料在某個指標上的抗旱性強弱[10]。此外,評價指標的選擇和各指標的權(quán)重尤為重要,抗旱性度量值(D)充分考慮了干旱脅迫下各指標的權(quán)重,是一種可靠的評價方法[11]。蔡建國等[12]采用D值法對繡球進行抗旱性評價,并構(gòu)建了繡球抗旱性評價方法。目前,D值法在煙草苗期抗旱性評價研究中已有報道[13],但煙草苗期抗旱性評價方法相關(guān)研究鮮有報道。前期,本課題組觀察到NC82×畢納一號組合的多個高世代株系對干旱脅迫表現(xiàn)出明顯的抗性差異,但各株系的抗旱性有待準確鑒定,尤其是苗期抗旱性快速評價方法有待建立。為此,本研究從NC82×畢納一號組合的F6及以上高世代品系中,選擇在田間干旱條件下表現(xiàn)出明顯差異的21個品系,以其5葉1心的煙苗為材料,采用PEG-6000模擬干旱處理,通過測定葉綠素a等10項指標,構(gòu)建了煙草苗期抗旱性評價方法,對參試材料的抗旱性進行了評價,以期為煙草抗旱品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為NC82×畢納一號組合的F6及以上高世代品系,根據(jù)田間抗旱性觀察結(jié)果,選擇抗旱性差異明顯的21份材料。材料由貴州大學貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室提供。

1.2 試驗設計

試驗設置干旱脅迫(15% PEG-6000模擬干旱)和正常對照2個處理,各3個重復,每重復5株。試驗于2021年在貴州大學煙草學院光照培養(yǎng)室進行,采用漂浮盤育苗,待苗長至4葉1心時將苗從漂浮盤上取出,將根洗凈后水培至5葉1心時進行模擬干旱處理,處理48 h取煙苗倒二葉鮮樣于液氮中暫存,取樣結(jié)束后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 測定指標與方法

葉片相對含水量(RWC)測定采用稱重法[14],葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量采用95%乙醇浸提法[15],MDA含量采用硫代巴比妥酸法[16],Pro含量采用茚三酮法[17],SOD、POD、CAT活性分別使用蘇州格銳思生物科技有限公司的酶活試劑盒測定,H2O2含量使用南京建成生物科技有限公司試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Excel2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理分析,用DPS7.05軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析和通徑分析。參照李紀潮等[18]和鄭巨云等[19]方法,分別計算各單項指標的抗旱系數(shù)(DC)、隸屬函數(shù)值(μ(Xi))和抗旱性度量值(D)。計算公式如下:

DC=干旱脅迫測定值/對照測定值

(1)

(2)

負向指標的隸屬函數(shù)值:

(3)

式中,Xi、Xmin和Xmax分別為第i個綜合指標及該指標的最小值和最大值。

(4)

(5)

式中,ωi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度,Pi為第i個綜合指標的貢獻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單項指標的抗旱系數(shù)分析

由表1可知,干旱脅迫下,煙草苗期的10項生理指標變異系數(shù)在7.7%～75.6%之間,說明21份材料的各項生理指標對干旱脅迫的響應存在明顯差異。其中,類胡蘿卜素、MDA、H2O2、CAT、Pro的變異系數(shù)均在40.0%以上,分別為75.6%,44.0%,42.6%,41.9%和44%,說明這5項指標干旱脅迫后變化較大。而POD和葉片相對含水量的變異系數(shù)均小于20.0%,分別為9.8%和7.7%,說明POD和葉片相對含水量受干旱脅迫影響較小。此外,干旱脅迫后10項生理指標抗旱系數(shù)均值在0.837～2.388之間,10項指標在干旱脅迫下變化有所不同,其中,除葉綠素a、葉綠素b、POD及葉片相對含水量外其他指標均值均大于1,說明干旱脅迫下煙草葉綠素含量降低、葉片失水,而活性氧增加導致細胞膜受到破壞。同時,為適應干旱脅迫,煙草幼苗內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加以維持細胞滲透壓并通過激活抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、CAT)來清除活性氧,維持干旱脅迫下的正常生長。進一步觀察21個材料各指標的抗旱系數(shù)發(fā)現(xiàn),干旱脅迫后同一指標在不同材料間變化趨勢有所不同,如干旱脅迫后SOD在1號、4～5號、8號、16～17號、19號、21號材料中降低,而在2～3號、6～7號、9～15號、18號、20號材料中上升。說明21份材料對干旱的響應存在差異,而各指標在不同材料中的變化趨勢和程度不同,很難用單一的指標來判斷各材料間的抗旱性差異,應當用多個指標對各個材料的抗旱性進行綜合評價。

表1 干旱脅迫后各指標抗旱系數(shù)Table 1 Drought resistance coefficient of indicators after drought stress

2.2 抗旱性評價指標篩選

由于不同材料間各指標變化趨勢不一致,采用單一指標對供試材料進行抗旱性評價具有片面性,因此需要多指標綜合考慮。通過各指標相關(guān)性分析(表2)表明,葉綠素a與類胡蘿卜素呈極顯著正相關(guān),與CAT呈極顯著負相關(guān);葉綠素b與類胡蘿卜素呈顯著正相關(guān),與CAT呈顯著負相關(guān);類胡蘿卜素與CAT呈顯著負相關(guān); H2O2與Pro呈極顯著正相關(guān);葉片相對含水量與H2O2呈極顯著負相關(guān),與Pro呈顯著負相關(guān)。這說明10項生理指標中存在相互關(guān)聯(lián),反映煙苗對干旱脅迫的響應存在信息重疊,因此需對這10項指標進行主成分分析,用以篩選抗旱性評價指標。

表2 各指標相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of indicators

對21份煙草材料10項生理指標進行主成分分析,結(jié)果(表3)表明,前5個主成分的貢獻率分別為31.329%,22.339%,14.206%,9.442%和8.562%,累積貢獻率達到85.877%,特征值的累積貢獻率超過80.000%,說明前5個主成分能夠有效反映材料85.877%的抗旱性信息,因此將前5個主成分作為21份煙草材料苗期抗旱性評價的主要因子。在主成分1中葉綠素a含量具有較高的載荷量(0.538),在主成分2中H2O2含量具有較高的載荷量(0.576),在主成分3中MDA含量具有較高的載荷量(0.663),在主成分4中SOD活性具有較高的載荷量(0.674),在主成分5中,除MDA外,POD活性具有較高的載荷量(0.549)。綜合主成分分析,分別選擇5個主成分中載荷量較高的指標(葉綠素a、H2O2、MDA、SOD、POD)作為煙草苗期抗旱性評價指標。

表3 各指標主成分分析Table 3 Principal component analysis of each indicator

2.3 煙草苗期抗旱性評價方法構(gòu)建

以抗旱性度量值(D)作為評價標準,D值越大,代表供試材料抗旱性越強。由表4可以看出,21個材料的抗旱性存在明顯差別,供試材料的D值在0.301～0.858之間,其中D值最大的為2號材料,D值最小的為1號材料。

表4 供試材料抗旱性評價的D值Table 4 D value of drought resistance evaluation of test materials

為探究煙草苗期抗旱性快速評價方法,以D值作為因變量,以篩選出的5個指標的抗旱系數(shù)作為自變量進行通徑分析,得到關(guān)于D值與各指標抗旱系數(shù)的回歸方程(表5)Y=0.044+0.471X1-0.065X2-0.106X3+0.068X4+0.305X5,其中,X1～X5分別代表葉綠素a、MDA、H2O2、SOD和POD。回歸方程的決定系數(shù)分別為R2=0.999,p=0.000 1達到極顯著水平,說明該回歸方程擬合度好,可以作為煙草苗期的抗旱性預測模型。由預測模型可知,干旱脅迫后葉綠素a含量、MDA含量、H2O2含量、SOD活性和POD活性對煙草苗期抗旱性具有顯著影響,可以作為煙草苗期抗旱性評價的指標。由表6可知,干旱脅迫后葉綠素a含量(X1)與D值呈極顯著相關(guān)性,表明干旱脅迫后葉綠素a含量(X1)對D值的直接作用大于間接作用總和,對D值起主要作用,而其余指標對D值的貢獻主要是通過干旱脅迫后葉綠素a含量間接實現(xiàn),因此可以將葉綠素a作為煙草苗期抗旱性評價的關(guān)鍵指標,通過比較各材料葉綠素a的抗旱系數(shù)可以對煙草苗期抗旱性進行快速評價。

表5 供試材料的抗旱性模型預測Table 5 Drought resistance model prediction of test materials

表6 各綜合指標的通徑分析Table 6 Diameter analysis of each comprehensive indicator

2.4 煙草苗期抗旱材料篩選

利用構(gòu)建出的抗旱性預測模型(Y)和快速評價指標葉綠素a的抗旱系數(shù)(DCChla)對供試材料進行抗旱性評價(表7),兩種方法各材料順序相似,部分材料排名不一致,表明通過比較各材料葉綠素a的抗旱系數(shù)可以對煙草苗期抗旱性進行初步評價,利用葉綠素a可以將抗旱性差異較大的材料篩選出來,但差異較小的材料仍需抗旱性模型進行評價。

表7 兩種方法評價結(jié)果Table 7 Evaluation results of the two methods

分別對21份材料的預測模型值(Y)和葉綠素a的抗旱系數(shù)(DCChla)進行聚類分析(圖1),兩種方法均可將21份材料分為5類,分別為高抗、中抗、抵抗、不抗和敏感型。綜合兩種分析結(jié)果,在高抗和中抗兩種類群中篩選出同時出現(xiàn)的2號、4號、6號和19號抗旱性較強的材料,作為抗春旱品種選育的種質(zhì)資源。

注:左為Y值,右為DCChla。圖1 21份材料D值聚類分析Fig.1 Cluster analysis of D values of 21 materials

3 討 論

3.1 煙草苗期對干旱脅迫的生理響應

干旱脅迫會導致煙草的生長發(fā)育受到影響。Han等[20]研究指出,干旱脅迫下煙草幼苗內(nèi)活性氧(H2O2)增多,活性氧會對蛋白質(zhì)、脂類和脫氧核糖核酸造成氧化損傷,從而損害細胞的正常功能[21];細胞膜受到破壞,MDA含量增多;葉片水分流失、葉綠素及類胡蘿卜素含量降低,光合速率減弱,從而導致煙草幼苗生長發(fā)育緩慢。此外,梁棟等[22]指出,干旱脅迫還會加快煙苗細胞程序性死亡(PCD)的進程,且干旱敏感品種較抗旱品種發(fā)生細胞程序性死亡(PCD)時間較早。為應對干旱脅迫,煙草通過多種生理代謝過程來減少水分流失和活性氧損傷,Jha等[23]通過SbCDR基因在煙草中的過表達研究發(fā)現(xiàn),過表達植株較野生種具有較強的抗旱性,且轉(zhuǎn)基因煙草植株中Pro及可溶性糖含量顯著高于野生種;Khan等[24]研究表明,干旱脅迫后,煙草中抗氧化酶(POD,CAT,APX)活性和原性保護物質(zhì)(AsA)含量抗氧化酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平(CAT,APX1和GR2較高),抗氧化酶活性增加能夠有效地消除細胞中的活性氧,降低細胞氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn),干旱脅迫導致葉片失水,葉片含水量降低,同時H2O2含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性及Pro含量升高,這說明干旱脅迫對煙草幼苗的生理代謝造成損傷之后,煙草通過激活抗氧化酶和增加細胞滲透調(diào)節(jié)能力來響應干旱。光合色素的變化在干旱脅迫的不同時間有所不同,在短時間(48 h)干旱脅迫下葉綠素含量普遍降低,這與Han等[20]研究結(jié)果一致。而汪志威[25]和吳迪等[26]研究則表明,長時間(8 d)干旱脅迫下,葉綠素含量增加。這可能是由于早期干旱脅迫導致葉綠素被破壞,而經(jīng)歷持續(xù)干旱脅迫后,葉綠素也能夠作為一種響應因子來降低干旱脅迫損傷,而具體的響應機理目前鮮有報道,因此還需進一步深入研究。

3.2 煙草苗期抗旱性評價

作物的抗旱性是多種生理響應機制共同作用的結(jié)果,因此對作物抗旱性進行評價時,評價指標的選擇尤為重要[27-28]。目前對于抗旱性評價指標的篩選已有大量研究,但指標篩選的方法各有不同。如郭瑩等[29]通過灰色關(guān)聯(lián)度分析指出,灌漿期不同麥類種質(zhì)的熒光系數(shù)與抗旱指數(shù)關(guān)聯(lián)度最高,可以利用熒光系數(shù)來評價不同麥類種質(zhì)灌漿期抗旱性。程少波等[30]利用主成分分析指出,活力指數(shù)和根長是評價多花黑麥草萌發(fā)期抗旱性強弱的關(guān)鍵指標。在這些方法中,主成分分析能將各抗旱指標進行綜合簡化,客觀評價各指標權(quán)重,避免主觀隨意性,是一種客觀的指標選擇方法[31]。在煙草中,汪志威[25]和吳迪等[26]通過各指標與隸屬函數(shù)值的相關(guān)關(guān)系分析,指出葉綠素a等可以作為煙草苗期抗旱性評價指標。本試驗通過對10項生理指標進行主成分分析,選擇出5個指標用作煙草苗期抗旱性評價的重要指標,在前人研究基礎上又篩選出了活性氧(H2O2)和抗氧化酶(POD)兩個評價指標,完善了煙草苗期的抗旱性評價指標篩選。

通過篩選出來的指標對供試材料進行抗旱性評價,目前,對作物的抗旱性評價主要包括模糊隸屬函數(shù)、抗旱性度量值法(D)等評價方法。在眾多評價方法中,汪燦等[11]研究認為,D值的評價結(jié)果與田間表現(xiàn)更接近,是一種更可靠的評價方法。盛偉等[32]利用D值法對41份木豆材料進行抗旱性評價并篩選出11份高抗旱性材料。閆成川等[33]也用D值法篩選出了包括JK625等14份陸地棉花鈴期抗旱材料。在煙草抗旱性研究中李顯航等[13]利用D值法篩選出煙草苗期高抗旱性品種TN90和紅花大金元,而煙草的抗旱性評價方法構(gòu)建相關(guān)研究鮮有報道。本試驗利用D值法對21份煙草材料苗期抗旱性進行綜合評價,基于D值構(gòu)建煙草苗期抗旱性評價模型(Y=0.044+0.471X1-0.065X2-0.106X3+0.068X4+0.305X5,其中,X1～X5分別代表葉綠素a、MDA、H2O2、SOD和POD)和快速評價指標(DCChla)。通過模型和快速評價指標將21份材料分為高抗型、中抗型、低抗型、不抗型和敏感型,從21份材料中篩選出4份苗期抗旱性較強的煙草材料。

4 結(jié) 論

本試驗通過對干旱脅迫后21個材料的生理指標進行綜合評價,從10個生理指標中篩選出葉綠素a、H2O2、MDA、SOD和POD等5項指標用作煙草苗期抗旱性評價指標。構(gòu)建了煙草苗期抗旱性評價模型,模型表明,葉綠素a與煙草苗期抗旱性直接相關(guān),說明通過干旱脅迫后葉綠素a的變化可以對煙草苗期抗旱性進行初步評價。利用兩種快速評價方法將21個供試材料分為高抗型、中抗型、低抗型、不抗型和敏感型5種類型,篩選出4份煙草材料作為煙草苗期抗旱育種的種質(zhì)資源,本研究為煙草苗期抗旱品種篩選與抗旱新品種的選育提供理論依據(jù)。