DNA 甲基化在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展△

楊志珍，談艷芳

1成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，成都 610000

2德陽市人民醫(yī)院檢驗科，四川 德陽 618000

食管癌是一種食管上皮來源的高度惡性腫瘤，2018 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球食管癌病死率居第6 位，發(fā)病率居第7 位，其惡性程度高，預(yù)后差[1]。2018 年中國食管癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別居全部惡性腫瘤的第6 位和第4 位[2]。食管鱗狀細(xì)胞癌為食管癌的主要亞型，約占食管癌總數(shù)的90%，并且患者5 年生存率﹤30%[3]。文獻(xiàn)提示，DNA 甲基化作為一種表觀遺傳修飾，是目前發(fā)現(xiàn)的在食管鱗狀細(xì)胞癌分子診斷中具有廣泛應(yīng)用前景的生物學(xué)標(biāo)志物，在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[4]。與傳統(tǒng)影像、內(nèi)鏡、病理等檢查相比，DNA 甲基化檢測靈敏度高、特異性強、創(chuàng)傷小、無輻射，適合人群早期篩查，在食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷、藥物治療、轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估方面顯示出了巨大優(yōu)勢。因此，本文綜述DNA 甲基化在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展。

1 DNA 甲基化

DNA 上的表觀遺傳標(biāo)記是可逆的、可遺傳的修飾，能在不改變DNA 序列的前提下，改變基因的功能或活性。DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)改變，是DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化DNA 序列上的特定堿基，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosine methionine，SAM）為甲基供體，通過共價鍵得到甲基的化學(xué)修飾過程，這種DNA 甲基化主要指基因組中CpG 二核苷酸胞嘧啶第5 位碳原子的甲基化過程，是哺乳動物DNA 甲基化的唯一形式[5]。根據(jù)序列的同源性和功能，真核生物DNMT 目前分為4 種，即DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L。DNMT1 參與CG 序列甲基化的維持；DNMT3a和DNMT3b也被稱為從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以為未修飾的DNA 建立新的甲基化模式；DNMT3L 沒有催化活性，是一種缺乏甲基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，通過與DNMT3a和DNMT3b 結(jié)合，發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶的作用[5]。DNA甲基化通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性以及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用等方式，參與細(xì)胞分化、基因組穩(wěn)定性、X 染色體失活、基因印跡等細(xì)胞生物學(xué)過程，從而控制基因表達(dá)[6]。

2 腫瘤與DNA 甲基化

國際癌癥研究機構(gòu)于2018 年發(fā)布的《世界癌癥報告》中指出，在134 個國家中，腫瘤是導(dǎo)致過早死亡（即30～69 歲死亡）的第一大或第二大原因，在另外45 個國家中，腫瘤是導(dǎo)致過早死亡的第三大或第四大原因，全世界的腫瘤發(fā)病率和病死率都在上升，與2008 年相比，2018 年全球腫瘤新發(fā)病例和死亡病例分別約1810 萬和960 萬，新發(fā)病例較2008 年增長了42.5%，死亡病例較2008 年增長了26.3%，排名前十位的腫瘤依次為肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、甲狀腺癌、膀胱癌，占腫瘤總發(fā)病例數(shù)的60.8%[1]。腫瘤對人類健康造成嚴(yán)重威脅，加重了國家經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，也將可能成為人口預(yù)期壽命增長的主要障礙。

DNA 甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，已被證明是許多腫瘤的重要標(biāo)志。DNA 甲基化異常會導(dǎo)致基因異常表達(dá)，使其成為腫瘤進(jìn)展的重要調(diào)控因子。因此，通過對DNA 甲基化進(jìn)行分析，可為早期識別不同的腫瘤類型提供新的可能。DNA 是穩(wěn)定的，容易從不同種類的物質(zhì)中分離出來，DNA 甲基化是可逆的，可以很容易地被檢測和分析，這可能會成為一種有效的檢測方法。DNA 甲基化標(biāo)志物的檢測對于腫瘤的早期篩查、診斷、治療、預(yù)后評估是至關(guān)重要的。

3 食管鱗狀細(xì)胞癌與DNA 甲基化

食管鱗狀細(xì)胞癌經(jīng)歷了一個緩慢、多階段、雙向的轉(zhuǎn)化過程，可有不同程度的炎癥、不典型增生、低級別上皮內(nèi)瘤變和高級別上皮內(nèi)瘤變，最終發(fā)展為腫瘤，預(yù)防和治療食管鱗狀細(xì)胞癌的緊迫性是顯而易見的。食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生是一個多因素的復(fù)雜過程，是原癌基因激活和抑癌基因因遺傳和表觀遺傳變化而失活的結(jié)果。這種基因的表觀遺傳修飾在一定條件下是可逆的，且不依賴于DNA 序列的變化，特別是DNA 甲基化異常是食管鱗狀細(xì)胞癌的常見表觀遺傳學(xué)改變。

3.1 DNA 修復(fù)相關(guān)基因

食管鱗狀細(xì)胞癌中DNA 修復(fù)基因O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）和mutL 同源物1（mutL homolog 1，MLH1）的失活主要歸因于其啟動子區(qū)域的甲基化[7]。避免細(xì)胞從鳥嘌呤（G）突變?yōu)橄汆堰剩ˋ），以保持基因組的準(zhǔn)確性和完整性，其功能異常會影響DNA 的修復(fù)能力，從而增加腫瘤發(fā)生過程中的突變率。有學(xué)者在對原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，脆性組氨酸三聯(lián)體二腺苷三磷酸酶（fragile histidine triad diadenosine triphosphatase，F(xiàn)HIT）基因與基因組穩(wěn)定性及腫瘤進(jìn)展相關(guān)，F(xiàn)HIT基因的甲基化與吸煙相關(guān)；由于其常發(fā)生在食管鱗狀細(xì)胞癌的早期，因此可以作為早期食管鱗狀細(xì)胞癌潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，在食管鱗狀細(xì)胞癌未進(jìn)行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前被檢測出，大大提高了食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷率及治療效果[8]。

3.2 細(xì)胞周期相關(guān)基因

在鱗狀細(xì)胞癌中，一些細(xì)胞周期相關(guān)基因的啟動子被高甲基化，從而抑制了它們的表達(dá)。細(xì)胞周期相關(guān)基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）和Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員1A（Ras association domain family member 1A，RASSF1A）在食管鱗狀細(xì)胞癌中經(jīng)常被高甲基化和轉(zhuǎn)錄沉默[7]。叉頭框和環(huán)指結(jié)構(gòu)域檢查點（checkpoint with forkhead and ring finger domains，CHFR）啟動子區(qū)甲基化在食管鱗狀細(xì)胞癌中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，已有研究通過對食管鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織及癌旁組織的研究發(fā)現(xiàn)，隨著組織異型增生級別的增加，CHFR甲基化呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，當(dāng)用多西他賽或紫杉醇治療時，CHFR甲基化食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的活力低于未甲基化的細(xì)胞，說明CHFR甲基化可降低食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對多西他賽或紫杉醇的敏感性，可通過監(jiān)測CHFR甲基化程度判斷食管鱗狀細(xì)胞癌的病變程度及這兩種藥物的化療效果[9]。腫瘤抑制基因p16是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，有研究顯示，隨著食管病變嚴(yán)重程度的增加，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中p16甲基化頻率呈增加趨勢，p16甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)[10]。

3.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase pi 1，GSTP1）是一種致癌物質(zhì)，與煙草代謝相關(guān)，食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病過程可能與GSTP1的多態(tài)性相關(guān)。有學(xué)者對食管鱗狀細(xì)胞癌組織的研究顯示，GSTP1多態(tài)性作為食管鱗狀細(xì)胞癌的獨立危險因素，通過體細(xì)胞CpG 島啟動子失活的GSTP1在各種腫瘤亞型中被證明是高甲基化的，GSTP1基因去甲基化后，細(xì)胞增殖率降低，凋亡率增加，食管鱗狀細(xì)胞癌受到抑制，腫瘤細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性增加，提示GSTP1基因去甲基化可能會抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，提高食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。

3.4 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

鈣黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）基因位于染色體16q24 上，編碼E-鈣黏蛋白（E-cadherin），在維持正常上皮細(xì)胞的細(xì)胞連接中起著關(guān)鍵作用。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，CDH1基因甲基化率為14%～61%，與早期食管鱗狀細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)相關(guān)，其表達(dá)喪失與食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[12-14]。去甲基化后，CDH1基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)恢復(fù)，說明CDH1基因的沉默與其啟動子區(qū)的高甲基化有關(guān)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中蛋白酪氨酸磷酸酶非受體6 型（protein tyrosine phosphatase non- receptor type 6，PTPN6）基因的甲基化率為63.4%，PTPN6甲基化水平可能與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有關(guān)[16]，可作為食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，對臨床監(jiān)測食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移具有重要意義。

3.5 WNT 信號通路基因

WNT/β-catenin 信號通路被報道與人類食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系，在許多食管鱗狀細(xì)胞癌病例中發(fā)現(xiàn)WNT 通路的基因改變[17]。WT1 轉(zhuǎn)錄因子（WT1 transcription factor，WT1）通過作用于WNT/β-catenin 通路上游而促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，有研究發(fā)現(xiàn)，WT1在食管鱗狀細(xì)胞癌中因啟動子甲基化而表達(dá)失調(diào)[18]。APC 是WNT 通路抑制因子，食管鱗狀細(xì)胞癌中APC啟動子高甲基化的患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)較少，預(yù)后較好，可以作為食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物[19]。WNT5a在食管鱗狀細(xì)胞癌中出現(xiàn)高頻甲基化[20]。DNA 甲基化標(biāo)志物已被報道用于評估食管鱗狀細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險，有研究結(jié)果證明，鋅指蛋白382（zinc finger protein 382，ZNF382）作為一種良性腫瘤抑制因子，其啟動子甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌分化水平相關(guān)，并通過抑制WNT通路來抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的惡化[21]。

3.6 轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）通路基因

轉(zhuǎn)化生長因子-β 受體2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2）是一種重要的腫瘤抑制因子，是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介導(dǎo)因子。有研究表明，食管鱗狀細(xì)胞癌組織樣本中TGFBR2啟動子相關(guān)CpG 位點的甲基化水平高于正常食管組織樣本，TGFBR2啟動子不僅在從非典型增生到癌變的過程中表現(xiàn)出高甲基化，而且在從正常上皮到癌變的過程中也表現(xiàn)出高甲基化，TGFBR2在食管鱗狀細(xì)胞癌中由于其啟動子區(qū)DNA 超甲基化而表達(dá)下調(diào)，食管鱗狀細(xì)胞癌中TGFBR2CpG 高水平甲基化提示TGFBR2啟動子區(qū)DNA 甲基化可能導(dǎo)致TGFBR2mRNA 表達(dá)缺失或降低，從而促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的癌變，用DNMT 抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理腫瘤細(xì)胞，可逆轉(zhuǎn)TGFBR2啟動子的甲基化[22]。研究TGFBR2 在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用，可以更深入了解該疾病的發(fā)展機制，并可能成為食管鱗狀細(xì)胞癌患者個體化治療的生物標(biāo)志物。

3.7 其他基因

Rh 家族C 糖蛋白（Rh family C glycoprotein，RHCG）是一種新的抑癌基因，在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。RHCG 通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路和基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）表達(dá)抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，具有評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的潛力[23]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白樣1（insulin like growth factor binding protein like 1，IGFBPL1）在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)受啟動子區(qū)甲基化的調(diào)控，IGFBPL1的甲基化與腫瘤大小和TNM 分期有關(guān)，IGFBPL1 通過抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長，IGFBPL1甲基化是一種潛在的食管鱗狀細(xì)胞癌早期檢測標(biāo)志物，也是食管鱗狀細(xì)胞癌PI3K 靶向治療的預(yù)測標(biāo)志物[24]。配對盒5（paired box 5，PAX5）基因甲基化被確定為檢測食管鱗狀細(xì)胞癌的一個很好的標(biāo)志物，其高甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和順鉑耐藥顯著相關(guān)[25]。Piwi 相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）-823 作為一種新型的非編碼小分子RNA，在食管鱗狀細(xì)胞癌中具有作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，其可能通過表觀遺傳途徑DNMT3b 誘導(dǎo)DNA 甲基化，從而在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮致癌作用[26]。EYA 轉(zhuǎn)錄輔激活因子和磷酸酶4（EYA transcriptional coactivator and phosphatase 4，EYA4）在大多數(shù)被檢測的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中存在低表達(dá)和高甲基化，用5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后可恢復(fù)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中EYA4 的表達(dá)，EYA4 通過失活A(yù)KT/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3B）/Slug 通路和抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲，可能與食管鱗狀細(xì)胞癌TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[27]。半胱氨酸雙加氧酶1（cysteine dioxygenase type 1，CDO1）具有酶活性，其甲基化在食管鱗狀細(xì)胞癌中很常見，具有抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用，CDO1 的表達(dá)通過降低MDA-MB-231 細(xì)胞的活性氧（reactive oxygen species，ROS）解毒能力來降低細(xì)胞活性，CDO1甲基化可能是原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌的一個強有力的預(yù)后預(yù)測因子，并對食管鱗狀細(xì)胞癌的治療具有重要的臨床意義[28]。

4 DNA 甲基化作為食管鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性的標(biāo)志物及治療靶點

DNA 甲基化異常是食管鱗狀細(xì)胞癌中常見的表觀遺傳學(xué)改變。DNA 甲基化失調(diào)會導(dǎo)致腫瘤抑制基因失活和原癌基因激活。DNA 是穩(wěn)定的、可逆的，容易從不同種類的物質(zhì)中分離出來，這為腫瘤的治療提供了新的機會。因此，可以應(yīng)用去甲基化藥物來恢復(fù)抑癌基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤的發(fā)展。DNA 甲基化狀態(tài)可評估患者對化療的敏感性。關(guān)于DNA 甲基化作為食管鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性標(biāo)志物的報道非常有限。PAX5甲基化被確定為鱗狀細(xì)胞癌的一個很好的標(biāo)志物，PAX5的高甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和順鉑耐藥顯著相關(guān)，PAX5高甲基化可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞對化療藥物順鉑的耐藥性，導(dǎo)致無復(fù)發(fā)生存期和總生存期延長[25]。GSTP1的DNA甲基化是LINC01419 促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展和5-氟尿嘧啶化療耐藥的原因，下調(diào)LINC01419 的表達(dá)可增加食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞在體內(nèi)對5-氟尿嘧啶的敏感性，GSTP1基因去甲基化后，可使細(xì)胞增殖減少，凋亡增加，食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展受到抑制，腫瘤細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性增加，提示GSTP1基因去甲基化可能抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，提高食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。

5 小結(jié)與展望

表觀遺傳改變已被認(rèn)為是食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。DNA 甲基化是食管鱗狀細(xì)胞癌早期研究最廣泛的表觀遺傳修飾之一，可作為食管鱗狀細(xì)胞癌早期篩查、診斷、治療、預(yù)后評估和化療敏感性的標(biāo)志物。本文總結(jié)了食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中一些基因異常甲基化對食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)防、診斷及治療等方面的影響。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，表觀遺傳調(diào)控機制和DNA 甲基化分子標(biāo)志物尚待進(jìn)一步研究，未來可建立食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷、預(yù)防、轉(zhuǎn)移模型，為臨床醫(yī)師提供有價值的食管鱗狀細(xì)胞癌早期篩查、防治工具，這對于提高食管鱗狀細(xì)胞癌患者的生存率、及時挽救患者生命具有非常重要的意義。