抗SARS-CoV-2 IgG抗體第2代內控參考品的制備及其在ELISA檢測方法中適用性的評價

周志軍，彭焱，岳勝蘭，陳麗梅，羅娟，馮璐，紀德銘，李璞，鄧琨，李策生，李陶敬，胡勇

1.國藥集團武漢血液制品有限公司，湖北武漢430207；2.湖北省鐘祥單采血漿公司，湖北鐘祥431900；3.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，四川成都610041

COVID-19是一種由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的急性傳染性疾?。?］。國藥集團武漢血液制品有限公司（以下簡稱武漢血制）以康復者恢復期血漿為原料制備的COVID-19 人免疫球蛋白是一種高純度、高比活、安全性好且不受血型限制的高特異性靶向治療制劑，但其原料血漿來源稀缺且不可持續(xù)［2］。隨著國內SARS-CoV-2 疫苗陸續(xù)附條件上市，其安全性和有效性已有大量數(shù)據(jù)支撐［3-5］，使采用SARS-CoV-2疫苗免疫后健康人血漿大規(guī)模制備COVID-19 人免疫球蛋白成為可能。選擇高通量、快速、與中和活性相關性好的方法篩選高滴度抗SARS-CoV-2 IgG 抗體的SARS-CoV-2 疫苗免疫血漿尤為重要。

目前，用于定量檢測血漿中抗SARS-CoV-2 IgG抗體的市售試劑盒大多以與SARS-CoV-2 中和抗體相關的受體結合位點（receptor binding domain，RBD）作為抗原［6］，生產(chǎn)廠家需制備內控參考品來建立定量檢測方法用于SARS-CoV-2 IgG 陽性血漿的篩選。武漢血制收集2020 年2 月COVID-19 康復者恢復期血漿，選取1 份用于ELISA-IgG 檢測的第1 代內控參考品（B1），并建立了定量檢測方法［7］。隨著B1 存量減少，本研究開始制備第2 代內控參考品（B2），原料由單份康復者恢復期血漿轉為多份免疫后的混合血漿，并采用抗SARS-CoV-2 免疫球蛋白第1 代WHO國際標準品（NIBSC 20／136）對B1 及B2 經(jīng)ELISA檢測的中和抗體效價（EIU／mL）進行標定［8］。同時，采用制備的內控標準品對免疫后血漿和康復者恢復期血漿進行篩查，制備不同ELISA-IgG稀釋倍數(shù)的混合血漿，通過假病毒中和試驗驗證其中和活性［9］，并對二者進行相關性分析，以判定該內控參考品對不同血漿篩查的適用性。

1 材料與方法

1.1血漿 2020 年12 月收集19 份接種北京生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)的SARS-CoV-2 滅活疫苗（BBIBP-CorV）的志愿者血漿［編號：C1～C19，經(jīng)北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒檢測ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)為20～60］、2020 年12 月30 日— 2021 年3 月16 日收集的434 份免疫BBIBP-CorV 后血漿及200 份于2021 年6 月收集的COVID-19 康復者恢復期血漿均由武漢血制提供。

1.2病毒及細胞 SARS-CoV-2假病毒（SARS-CoV-2-Fluc，批號為：20210121，滴度為：136 474 TCID50／mL）購自北京云菱生物醫(yī)藥有限公司；Huh-7細胞由中國食品藥品檢定研究院惠贈。

1.3主要試劑及儀器 SARS-CoV-2中和抗體檢測試劑盒（抑制率法及ELISA法，批號分別為：A201201和20201215）購自南京金斯瑞生物科技股份有限公司（廠家A）；SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（ELISA法，批號為：NCOG20200808B、NCOG20210 201B、NCOG0702B，cut-off = 0.19）、IgM 抗體檢測試劑盒（ELISA 法，批號為：NCOM20201208B，cut-off =0.105）及中和抗體測定試劑盒（ELISA 法，批號為：NCOVNAI20210201B）均購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司（廠家B）；SARS-CoV-2（2019-nCoV）中和抗體測定試劑盒（ELISA 法，批號為：20201201）購自北京華大吉比愛生物技術有限公司（廠家C）；NIBSC 20／136及SARS-CoV-2中和抗體國家標準品（標示效價為：1 000 U／mL）均由中國食品藥品檢定研究院提供；B1及注射用水（water for injection，WFI）由武漢血制自制；甘油（20201106）購自國藥集團化學試劑有限公司；化學發(fā)光檢測試劑（110-20391）購自美國PerKinelmer 公司；化學發(fā)光檢測儀（型號為：GM2010）購自美國Promega 公司；細胞計數(shù)儀（型號為：Cellometer Auto 1000）購自美國Nexcelcom公司。

1.4樣品的制備

1.4.1B2 采用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 試劑盒（NCOG20210201B 批）和IgM 抗體檢測試劑盒及廠家A、B、C的4個中和抗體試劑盒檢測C1～C19 號血漿，選取ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)在32～45 之間、IgM 陰性、廠家A 的中和抗體試劑盒檢測抑制率接近的非脂血血漿，每份血漿取100 mL，混合，56 ℃滅活30 min，按1 mL／支分裝，-25 ℃凍存，即為B2。

1.4.2NIBSC 20／136 母液 將1 支NIBSC 20／136凍干品用250μL WFI 復溶至效價為1 000 IU／mL，取100μL，加入100μL WFI及200μL甘油，混勻，終濃度為250 IU／mL，作為國際標準品母液，-20 ℃保存。

1.4.3混合血漿 將2020 年12 月30 日— 2021 年3月16 日收集的434 份免疫后血漿用廠家B 的SARSCoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（NCOG2021 0201B批）進行IgG檢測，按照ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)分為5個檔位（16～32、32～64、64～128、128～200、>200），每個檔位混合血漿不少于80份樣品，各自混合，相應編號為：P-pool16、P-pool32、P-pool64、P-pool128、P-pool 200；將2021 年6 月收集的200 份COVID-19 康復者恢復期血漿用廠家B的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG抗體檢測試劑盒（NCOG20210201B 批）進行IgG 檢測，按照ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)分為6 個檔位（8～16、16～32、32～64、64～128、128～256、> 256），每檔樣品各自混合，相應編號為R-pool8、R-pool16、R-pool32、R-pool64、R-pool128、R-pool256。

1.5B1和B2的標定

1.5.1B2 的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)的確定 采用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（NCOG20200808B及NCOG20210201B批）檢測B2。用試劑盒中的樣品稀釋液將B2 2倍系列稀釋（1∶10 ～1∶640，對應編號為：S1～S7），加入96孔板，100μL／孔，分別檢測4 次。樣品的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)為大于cut-off的最高稀釋倍數(shù)／起始稀釋倍數(shù)（該試劑盒起始稀釋倍數(shù)為10）。

1.5.2NIBSC20／136 標定B1、B2 的ELISA 法中和抗體效價 用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG抗體檢測試劑盒（NCOG20210201B 批）進行檢測，用試劑盒中的樣品稀釋液將NIBSC20／136 母液2 倍系列稀釋（1∶25 ～1∶1 600），對應的效價為100 ～1.56 IU／mL。將B1、B2用相同的樣品稀釋液2倍系列稀釋（1∶10～1∶640）。以NIBSC20／136 的理論效價（中和效價單位IU／mL 來標示ELISA 效價時，內部記為EIU／mL，以區(qū)分IU／mL）為橫坐標，對應的A450為縱坐標，進行四參數(shù)方程擬合，選取至少5個濃度使曲線滿足R2>0.9，計算B1、B2 的ELISA 中和抗體效價（EIU／mL）。另以B1的系列稀釋倍數(shù)為橫坐標，對應的A450為縱坐標，進行四參數(shù)方程擬合，選取至少5 個濃度使曲線滿足R2>0.9，計算NIBSC20／136及B2的ELISA-IgG稀釋倍數(shù)。

1.6B2的穩(wěn)定性檢測

1.6.1加速穩(wěn)定性將2支B2復融，分裝成0.1 mL／支的小樣，于2～8 ℃分別放置5、8、14、20、30 d，前4 個時間點樣品均于-25 ℃保存至最后一個時間點（30 d），將前4 個時間點樣品復融，與保存30 d 的樣品均采用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（NCOG20210201B 批）檢測ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)，以新鮮復融的B2 為對照，并按下式計算回收率，回收率應在（100±15）%范圍內。

1.6.2使用穩(wěn)定性 將B2 小樣于18～25℃分別放置1、2、3 h 后，前2 個時間點樣品置-25℃凍存至最后一個時間點（3 h），將前2個時間點樣品復融，與保存3 h 的樣品均采用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（NCOG20210201B 批）檢測ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)，以新鮮復融的B2為對照；將B2 小樣進行10 倍稀釋，室溫分別放置2 和4 h 后，按上述方法凍存及取樣，采用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（NCOG20210201B批）檢測ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)，以新鮮復融的B2為對照，并計算均值及回收率（公式同1.6.1 項），回收率應在（100±15）%范圍內。

提高概率函數(shù)的值，就是要努力讓失地農(nóng)民相信，“當自己做出了‘參與’再就業(yè)培訓這一決策之后，自己預期的結果有較大可能的實現(xiàn)”。結合上述實質理論，本研究提出如下兩點建議：一要努力加強培訓機構的實力建設和師資建設。培訓機構實力強大、師資力量雄厚，意味著培訓的計劃實施和品質可以得到更多的保障，這將有助于失地農(nóng)民形成“預期結果”更有可能實現(xiàn)的信念。二要注重“關鍵信息”的有效傳播。建議多搜集、多總結、多宣傳一些成功個案，尤其是那些有關失地農(nóng)民經(jīng)過再就業(yè)培訓成功促進了“就業(yè)素質提升”“能力證書獲取”“就業(yè)目標實現(xiàn)”的案例。積極正面的宣傳，將有助于增強失地農(nóng)民對預期結果實現(xiàn)可能性的感受。

1.6.3凍融穩(wěn)定性 取3 支B2 小樣，于-25 ℃分別凍融1、2、3 次，采用廠家B 的SARS-CoV-2（2019-nCoV）IgG 抗體檢測試劑盒（NCOG20210201B 批）檢測ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)，以新鮮復融的B2為對照，計算均值及回收率（公式同1.6.1 項），回收率應在（100±15）%范圍內。

1.6.4長期穩(wěn)定性 收集連續(xù)10 個月武漢血制質檢部門以B2（-25 ℃凍存）作為標準曲線（S1～S7）的A450結果，記錄每個月的檢測次數(shù)，以第1 個月的B2系列稀釋樣品均值建立的標準曲線作為長期穩(wěn)定性的起點，隨后每個月B2的每個稀釋樣品均取A450均值，代入標準曲線，計算稀釋倍數(shù)，按照不同稀釋倍數(shù)×稀釋樣品的稀釋倍數(shù)，得到B2 的多個ELISA-IgG 回算值，將回算值均值作為B2 在當月的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)，并計算回收率（公式同1.6.1 項），回收率應在（100±15）%范圍內。

1.7不同ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)混合血漿的假病毒中和抗體檢測 將1.4.3 項制備的混合血漿樣品用含10%的DMEM高糖培養(yǎng)基進行5倍系列稀釋（1∶4 ～1∶2500），加入96孔板，100μL／孔，再加入SARS-CoV-2-Fluc（用10%DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至1 365 TCID50），50μL／孔，混合血漿樣品終濃度達1∶6～1∶3 750，37 ℃中和反應1 h；加入Huh-7細胞，100μL／孔，37℃培養(yǎng)20～24 h；加入化學發(fā)光檢測試劑，化學發(fā)光檢測儀檢測相對光強度，計算中和抑制率，利用Reed-Muench 法計算IC50。根據(jù)SARS-CoV-2 中和抗體國家標準品的效價和IC50計算樣品的中和抗體效價。以ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)為橫坐標，假病毒中和抗體效價為縱坐標，繪制直線方程，計算兩者相關性（R2）。

1.8統(tǒng)計學分析 應用酶標儀附帶的Soft Max 5.2 軟件計算ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)，Excel 軟件進行ELISAIgG 稀釋倍數(shù)與中和抗體效價相關性的分析及作圖，通過簡單線性回歸和皮爾遜（Pearson）相關分析計算P和R2。

2 結果

2.119 份備選血漿的檢測 廠家B 的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)在32～45 之間的血漿共8 份（C4、C7、C10、C12、C14、C15、C16、C18），其中IgM 陽性1 份（C15），脂肪含量較高的乳糜樣血漿1 份（C14），廠家A 中和抗體試劑盒檢測抑制率接近的非脂血血漿共5 份（C4、C7、C10、C12、C16），選取這5 份血漿制備B2。結果還表明，不同廠家試劑盒檢測中和抗體結果的相關性較低。見表1。

表1 用于制備B2的19份備選血漿的檢測結果Tab.1 Test results of 19 alternative plasma samples used to prepare B2

2.2B1和B2的標定

2.2.1B2 的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)的確定 B2 經(jīng)1∶320 稀釋時cut-off> 0.19，經(jīng)1∶640 稀釋時cut-off<0.19，因此確定其最高稀釋倍數(shù)為320，ELISA-IgG稀釋倍數(shù)可賦值為32，見表2。

表2 B2的ELISA-IgG稀釋倍數(shù)的確定（A450）Tab.2 Determination of ELISA-IgG dilution ratio of B2（A450）

表3 NIBSC 20／136與B1和B2的標定結果Tab.3 Calibration results of NIBSC 20／136，B1 and B2

2.3B2 的穩(wěn)定性 加速穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性的回收率均在（100 ± 15）%范圍內，見表4 ~6。隨著凍存時間延長，B2 稀釋倍數(shù)逐步下降，但稀釋倍數(shù)回收率均在（100 ± 15）%之內，見表7。表明B2具有良好的穩(wěn)定性。

表4 B2的加速穩(wěn)定性檢測結果Tab.4 Accelerated stability of B2

表5 B2的使用穩(wěn)定性檢測結果Tab.5 Service stability of B2

表6 B2的凍融穩(wěn)定性檢測結果Tab.6 Freeze-thaw stability of B2

表7 B2的長期穩(wěn)定性檢測結果Tab.7 Long-term stability of B2

2.4不同ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)混合血漿的假病毒中和抗效價 相同來源血漿的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)與假病毒中和抗體效價呈顯著相關（R2均>0.99，P均<0.000 1），相同來源血漿的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)與假病毒中和抗體效價呈線性相關，R2分別為0.997 3和0.996 2，見圖1。表明ELISA-IgG 定量方法既可用于免疫后血漿的篩選，也可用于康復者期血漿檢測。雖然B1（康復者恢復期血漿）和B2（免疫后血漿）的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)接近，但細胞法中和抗體效價相差近4 倍，因此不同來源的血漿之間的中和抗體稀釋倍數(shù)不能用ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)代替。見表8。

圖1 相同來源血漿的ELISA-IgG 稀釋倍數(shù)與假病毒中和抗體效價的線性關系Fig.1 Linear relationship between ELISA-IgG dilution ratio and neutralizing antibody potency of pseudovirus in mixed plasma from same source

表8 不同來源混合血漿假病毒中和抗體效價和ELISA-IgG稀釋倍數(shù)匯總Tab.8 Summary of neutralizing antibody potency of pseudovirus and ELISA-IgG dilution ratio in mixed plasma from different sources

3 討論

在COVID-19疫情暴發(fā)早期，武漢血制檢測康復者恢復期血漿的方法采用的是半定量間接ELISA法，每個樣品稀釋為4 個倍數(shù)來判讀其滴度，無參考品［10］。隨后開始篩選免疫后血漿［11］，武漢血制科研開發(fā)部對比了5 個廠家的市售試劑盒并選定1 家建立了定量間接ELISA 法，選用的B1 源自1 份有中和活性的COVID-19患者恢復期血漿，由于無國際標準品，僅以其ELISA 稀釋倍數(shù)作為ELISA-IgG 的定量單位，按照試劑盒的要求以大于cut-off 的最高滴度倒數(shù)作為其稀釋倍數(shù)，目前，已檢測了近8 萬人份血漿，制備的靜注COVID-19人免疫球蛋白符合企業(yè)標準，表明以B1建立的定量檢測方法是可靠的［7］。

由于B1 存量有限，開始進行B2 的制備。目前，免疫后血漿供應充足，來源可控，因此，本研究將多份免疫后血漿進行混合制備新的參考品。SARSCoV-2中和抗體水平檢測的金標準為中和試驗，一般采用細胞病變抑制法［13-14］，中國食品藥品檢定研究院采用假病毒法中和試驗［9］，中國科學院武漢病毒所采用傳統(tǒng)的蝕斑法中和試驗進行檢測，這兩種方法均可對該項目進行準確檢定，但由于方法限制，檢定時間長，需要1～2 周，成本高。隨著體外診斷技術的發(fā)展［12］，市場上出現(xiàn)了一批替代細胞病變抑制法的試劑盒，本研究共選取了3家4種中和抗體試劑盒對備選的19 份免疫后血漿進行全面檢測，結果顯示，不同廠家中和試驗的原理和操作程序不同，導致結果相關性較低。根據(jù)多個廠家IgG 定量試劑盒的檢測結果，選取了5 份血漿，制備了B2，再通過假病毒中和試驗驗證其中和活性。

SARS-CoV-2的S蛋白有S1和S2兩個亞基組成，S1亞基包含RBD，RBD 可與存在于上皮細胞表面的細胞表面受體血管緊張素轉換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）結合［15-16］。病毒感染后刺激機體產(chǎn)生的抗體中，具有阻斷SARS-CoV-2細胞浸潤和復制的抗體亞群稱為中和抗體［17］。本研究選用的3種體外定量檢測中和抗體的ELISA試劑盒采用的均是競爭法，抗體效價與A450呈負相關，如廠家B采用的是競爭阻斷法，在酶標板上包被的是S蛋白基因重組抗原，可捕獲樣本中的SARS-CoV-2中和抗體，形成抗原抗體復合物，再加入HRP標記的S-RBD抗體與中和抗體競爭結合包被抗原；廠家A和C采用的是競爭法，模擬阻斷病毒感染過程，包被酶標板的是ACE2，再加入HRP酶標記的RBD［18-19］。但兩家在樣品中和程序上有所不同，廠家A是樣品稀釋后先與RBD-HRP孵育，即樣品的中和抗體先與酶標記的RBD抗原結合后，再加入酶標板進行反應，即剩余酶標記的RBD抗原才能與包被的ACE2結合而顯色；而廠家C是將樣品和酶同時加入酶標板，包被在酶標板上的ACE2與中和抗體同時競爭酶標記的RBD片段。這3種試劑盒的準確性及與中和試驗的相關性尚無明確數(shù)據(jù)，因此體外診斷試劑還需在質量上進一步提高。

本研究采用假病毒中和試驗對兩代內控參考品進行中和抗體效價檢測，結果發(fā)現(xiàn)，來源于恢復期血漿的B1的中和抗體效價遠高于來源于免疫后血漿的B2，兩者的ELISA-IgG稀釋倍數(shù)和國際標準品標定的ELISA-中和抗體效價差異較小。為驗證相同來源血漿的ELISA-IgG稀釋倍數(shù)與假病毒中和抗體效價的相關性，本研究分別收集了若干份康復期血漿和免疫后血漿，按照不同ELISA-IgG稀釋倍數(shù)制備混合血漿，同時進行ELISA-IgG稀釋倍數(shù)和假病毒中和抗體檢測，結果顯示，在相同來源的血漿中ELISA-IgG的結果與假病毒中和試驗相關性良好，用ELISA-IgG檢測能代表中和抗體的水平；免疫后血漿的中和抗體水平低于恢復期血漿，這可能是由于天然感染的SARS-CoV-2激發(fā)的免疫反應更全面，滅活疫苗的劑量和免疫原性弱于天然病毒，天然病毒感染人員產(chǎn)生的總抗體中中和抗體的種類多于滅活疫苗免疫后人群血漿（中和抗體譜更廣），前者產(chǎn)生的中和抗體在總抗體中的占比高于后者（同種中和抗體水平更高）。對于細胞水平的中和試驗的替代方法可考慮采用雙抗原夾心法［12，20］。

綜上所述，本研究制備的抗SARS-CoV-2 IgG抗體第2代內控參考品B2可用于ELISA法檢測。但當前SARSCOV-2仍在不斷變異［21-22］，長新冠后遺癥已成為公眾關注的重點［23-25］，這對治療藥物的開發(fā)提出新的需求。