缺氧環(huán)境下的肝星狀細胞中缺氧誘導因子1α與缺氧誘導因子2α對CD248表達水平影響

陳紀宏, 許向波, 何福亮, 田苗苗, 胡思雋, 祁興順

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016;2.大連醫(yī)科大學研究生院,遼寧 大連 116044;3.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心,北京 100050;4.空軍軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院 國家消化系統(tǒng)疾病臨床研究中心 腫瘤生物學國家重點實驗室,陜西 西安 710032;5.西北工業(yè)大學醫(yī)學研究院,陜西 西安 710072

缺氧與肝炎、肝纖維化、肝癌等多種肝疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[1]。在肝損傷早期,局部組織即可發(fā)生缺氧,缺氧可抑制肝組織再生,同時也可刺激肝發(fā)生纖維化[2]。缺氧是導致肝發(fā)生物理和化學損傷的重要因素之一,對肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)激活具有重要作用[3]。HSC激活、增殖和分化轉(zhuǎn)移是肝纖維化和肝癌等疾病發(fā)生的重要標志。HSC可分泌細胞外基質(zhì),還可以通過旁分泌信號傳導機制影響肝細胞增殖和肝組織再生[4-5]。當肝組織缺氧時,HSC中的缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)激活表達上調(diào),進而參與保護肝細胞、刺激血管生成和能量代謝等過程,同時也參與肝腫瘤發(fā)生、肝脂質(zhì)積聚和肝纖維化等病理過程[6]。目前,在HIF家族中已知參與調(diào)控細胞適應低氧變化的亞基主要是HIF-1α、HIF-2α[7]。CD248是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要存在于活化的間充質(zhì)細胞的質(zhì)膜上[8]。CD248在成人正常組織中表達很低或幾乎不表達,但在缺氧、惡性腫瘤、炎癥和一些纖維化疾病的間充質(zhì)細胞中則會表達升高[9]。在肝組織中,CD248僅在HSC和成纖維細胞中表達,且與纖維化和腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系,HSC中的CD248表達可抑制肝細胞增殖,達到影響肝疾病進展的作用[10-11]。HIF-1α、HIF-2α和CD248在肝組織缺氧時均會在HSC中表達增加,且均與肝纖維化和肝癌等多種肝疾病有著密切的關(guān)系。然而,目前在缺氧環(huán)境下HIF-1α、HIF-2α對CD248調(diào)控作用尚未被充分闡明。布-加綜合征(Budd-Chiari syndrome,BCS)的疾病進程與缺氧密切相關(guān)[12],且慢性BCS隨著病情發(fā)展可發(fā)生肝纖維化[13],故本研究選用BCS患者肝活檢組織進行臨床樣本研究。本研究旨在探討缺氧狀態(tài)下的HSC中HIF-1α、HIF-2α對內(nèi)皮唾液酸蛋白(endosialin/CD248/TEM1)表達水平的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 免疫組織化學 BCS患者肝組織活檢標本來自既往報道的9例患者[14]。將已經(jīng)脫蠟水化的標本切片放在3% H2O2中,在室溫下孵育5～10 min,隨后用PBS沖洗。分別滴加CD248(英國Abcam)、HIF-1α(英國Abcam)和HIF-2α(英國Abcam)等抗體,室溫孵育30～60 min后用PBS沖洗。再滴加相應的二抗(英國Abcam),室溫孵育10～20 min后PBS沖洗,應用DAB溶液顯色,蒸餾水沖洗、復染、脫水和封片。以PBS代替一抗作為陰性對照,采用已知陽性片作為陽性對照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Inc,Rockville,MD,USA)對結(jié)果進行分析,得出CD248、HIF-1α、HIF-2α的免疫組化累積光密度(immunohistochemical cumulative optical density,IOD)值。

1.2 細胞培養(yǎng) 本實驗所有HEK293T(上海吉凱)和HSC-LX2細胞(上海吉凱)所用的培養(yǎng)液均為含胎牛血清(上海微科)的DMEM完全培養(yǎng)液(美國Hyclone),并放于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建和鑒定過表達質(zhì)粒 根據(jù)Gene Bank中HIF-1α(NM_001530)和HIF-2α(NM_001430)的基因序列設(shè)計并合成上下游引物。引物序列如下:HIF-1α上游引物序列為5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCG AACGACAAGAAAAAG-3′,下游引物序列為5′-TCCTTGTAGTCCATACCGTTAACTTGATCCAAAGCTCT GAGTAATTCTTC-3′。HIF-2α上游引物序列為5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACAGC TGACAAGGAGAAGAAAAGG-3′,下游引物序列為5′-TCCTTGTAGTCCATACCGGTGGCCTGGTCCAGGG CTCTGAGGA-3′。HIF-1α、HIF-2α基因重組過表達質(zhì)粒的構(gòu)建均是在AgeI和BamHI酶切位點應用相應限制性核酸內(nèi)切酶(美國NEB)對GV358載體(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin,上海吉凱)進行雙酶切完成的。將經(jīng)凝膠電泳檢測合格的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增產(chǎn)物連接入線性化表達載體,形成帶有HIF-1α、HIF-2α基因的重組過表達載體(Ubi-HIF1α-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin和Ubi-HIF2α-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)。將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α(上海吉凱),應用嘌呤霉素抗性細菌培養(yǎng)基進行篩選。對PCR鑒定陽性的克隆結(jié)果進行測序,并對克隆質(zhì)粒進行PCR凝膠電泳鑒定,克隆質(zhì)粒凝膠電泳共設(shè)置12個點樣孔,分別為空白對照(雙蒸水)、陰性對照(空載自連質(zhì)粒)、陽性對照(甘油醛-3-磷酸脫氫酶,GAPDH)、DNA Marker(250 bp-Ⅱ DNA Ladder,上海捷瑞)和1～8號重組質(zhì)粒。

1.4 包裝過表達慢病毒 將制備好的重組過表達質(zhì)粒及p Helper 1.0載體質(zhì)粒(上海吉凱)、p Helper 2.0載體質(zhì)粒(上海吉凱)分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提,然后進行轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。培養(yǎng)對數(shù)生長期的HEK293T細胞,將消化后的細胞重新培養(yǎng)至細胞密度達到70%～80%。在轉(zhuǎn)染前2 h更換為Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco),向離心管中加入20 μg的GV358載體、15 μg的p Helper 1.0載體和10 μg的p Helper 2.0載體,將稀釋后的DNA與相應體積的轉(zhuǎn)染試劑混合均勻。混合液轉(zhuǎn)移至HEK293T細胞的培養(yǎng)液中進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,隨后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,離心除去細胞碎片。用濾器過濾上清液,置于超速離心管中進行離心,離心后將病毒濃縮液移出,分裝后保存于病毒管中。

1.5 測定病毒滴度 選用熒光法測定病毒滴度。在測定前1 d使用HEK293T貼壁細胞鋪板,每孔4×104個細胞。將病毒稀釋0.1、1.0和10.0 μl 3種滴度加在不同孔內(nèi)。24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μl,4 d后觀察熒光表達情況并計算病毒滴度。

1.6 確定慢病毒載體最佳感染條件 將密度為4×104個/ml的100 μl HSC-LX2細胞懸液接種于96孔板中。在慢病毒感染時,細胞融合率已達到40%,按照感染復數(shù)為100、10和1這3個梯度加入病毒。每個梯度均分別設(shè)置4個不同培養(yǎng)基進行篩選,分別為完全培養(yǎng)基、含5 μg/ml Polybrene(助感染試劑;美國Sigma-Aldrich)的完全培養(yǎng)基、含ENi.S(感染增強溶液;上海吉凱)的完全培養(yǎng)基和含5 μg/ml Polybrene+ENi.S的完全培養(yǎng)基。感染72 h觀察熒光表達情況,在感染復數(shù)為10的含ENi.S的完全培養(yǎng)基中熒光強度最大且細胞存活較多,最終確定為最佳感染條件。

1.7 慢病毒載體感染HSC-LX2細胞 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞時,均分別設(shè)置了陰性對照組和過表達慢病毒感染組。陰性對照組每孔均加入空載體慢病毒(上海吉凱)感染HSC-LX2細胞,過表達慢病毒感染組均加入HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞。

1.8 細胞低氧處理 細胞低氧處理使用1 000 μmol/L的 CoCl2作為缺氧誘導劑。在觀察缺氧條件下HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒和空載慢病毒感染HSC-LX2細胞后CD248的表達水平時,對HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒和空載慢病毒感染HSC-LX2細胞均使用1 000 μmol/L的CoCl2進行低氧處理。

1.9 RNA獲取、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR 應用定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)技術(shù)對HSC-LX2細胞中的HIF-1α、HIF-2α和CD248表達水平進行檢測并分析。以β-actin作為內(nèi)參基因,相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。qPCR引物序列如下:HIF-1α上游引物序列為5′-GTGTTATCTGTCGCTTTGAGTC-3′,下游引物序列為5′-GTCTGGCTGCTGTAATAATGTTC-3′;HIF-2α上游引物序列為5′-TTGCTCTGAAAACGAGTCCGA-3′,下游引物序列為5′-GGTCACCACGGCAATGAAAC-3′;CD248上游引物序列為5′-AGTGTTATTGTAGCGAGGGAGAGAC-3′,下游引物序列為5′-CCTCTGGGAAGCTCGGTCTA-3′;β-actin上游引物序列為5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′,下游引物序列為5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.10 Western blot法 對過表達慢病毒感染HEK293T細胞目的基因融合蛋白進行檢測時設(shè)置陰性對照(HEK293T空細胞)、陽性對照(感染含SURVIVIN-3FLAG-GFP慢病毒空載體的HEK293T)和HIF-1α/HIF-2α-3FLAG-GFP融合蛋白組(感染HIF-1α/HIF-2α重組過表達慢病毒的HEK293T細胞)。首先,對細胞進行裂解并提取總蛋白,用BCA法(美國HyClone)定量檢測蛋白濃度。使用恒壓80 V進行SDS-PAGE電泳2 h。電泳結(jié)束后,使用轉(zhuǎn)移電泳裝置在4℃,170 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜100 min,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉PVDF膜2 h,然后進行室溫下HIF-1α與HIF-2α一抗(英國Abcam)孵育2 h,并使用TBST洗膜3次,每次10 min。然后,用封閉液稀釋相應的二抗(英國Abcam),室溫下孵育PVDF膜2 h,并使用TBST洗膜3次,每次10 min。采用ECL發(fā)光液試劑盒(美國Amersham)進行顯色。

2 結(jié)果

2.1 BCS患者肝組織樣本HIF-1α、HIF-2α與CD248的IOD值相關(guān)性分析 通過免疫組化分析BCS患者肝組織樣本(圖1a)并檢測IOD值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),組織中CD248表達水平與HIF-1α(Pearson相關(guān)系數(shù):r=0.285,P=0.010;圖1b)和HIF-2α(Pearson相關(guān)系數(shù):r=0.382,P<0.001;圖1c)的表達水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。因此,CD248的表達與HIF-1α、HIF-2α的表達可能存在著密切的關(guān)系。

圖1 BCS患者肝組織免疫組化代表性圖片及HIF-1α、HIF-2α與CD248的IOD值相關(guān)性分析(每例患者均有3張肝組織免疫組化切片,每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照分析;a.BCS患者肝組織中HIF-1α、HIF-2α和CD248免疫組化代表性圖片;b.BCS患者肝組織中HIF-1α與CD248表達散點圖;c.BCS患者肝組織中HIF-2α與CD248表達散點圖)

2.2 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒的成功包裝與表達效果檢測

2.2.1 HIF-1α、HIF-2α過表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)設(shè)計好的HIF-1α、HIF-2α引物進行PCR擴增,并對其產(chǎn)物進行凝膠電泳,可見兩者特異性條帶大小分別為2 522 bp和2 654 bp,與預期相符(圖2a、b)。此外,產(chǎn)物測序結(jié)果與目的基因序列一致(圖2e、f)。將構(gòu)建好的HIF-1α、HIF-2α重組質(zhì)粒進行PCR凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示,兩種轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小分別為619 kb和1 368 kb(圖2c、d),與預期相符,證明兩種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 HIF-1α、HIF-2α重組過表達質(zhì)粒的構(gòu)建[a.HIF-1α引物PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果;b.HIF-2α引物PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果;c.HIF-1α重組過表達質(zhì)粒凝膠電泳結(jié)果:d.HIF-2α重組過表達質(zhì)粒凝膠電泳結(jié)果;e.HIF-1α重組過表達質(zhì)粒陽性克隆部分測序結(jié)果;f.HIF-2α重組過表達質(zhì)粒陽性克隆部分測序結(jié)果;圖2a、b電泳圖說明:M#為Marker,1#為HIF-1α引物PCR擴增產(chǎn)物,2#為HIF-2α引物PCR擴增產(chǎn)物;圖2c、d電泳圖說明:1#為陰性對照(ddH2O),2#為陰性對照(空載自連質(zhì)粒),3#為陽性對照(GAPDH),4#為Marker,5-12(C)#為HIF-1α的1-8號轉(zhuǎn)化子,5-12(D)#為HIF-2α的1-8號轉(zhuǎn)化子]

2.2.2 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒的包裝與鑒定 將HIF-1α、HIF-2α過表達質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后成功獲得HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒。使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示被轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞發(fā)射綠色熒光較強(圖3a),說明質(zhì)粒熒光標記基因表達正常,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。通過Western blot法檢測HIF-1α-3FLAG-GFP和HIF-2α-3FLAG-GFP融合蛋白表達情況,結(jié)果顯示兩種蛋白大小分別為96 KD和98 KD(圖3b、c),與預期相符,因此判斷兩種重組質(zhì)粒過表達成功。在轉(zhuǎn)染48 h后收集培養(yǎng)液上清中的病毒對HIF-1α過表達慢病毒[LV-HIF1A(8580-1)]和HIF-2α過表達慢病毒[LV-EPAS1(15237-1)]使用熒光法測定病毒滴度(圖4),結(jié)果顯示,兩種病毒滴度分別為2×108TU/ml和1×108TU/ml。這提示,成功獲得高滴度的HIF-2α和HIF-2α過表達慢病毒。

2.2.3 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞表達效果檢測 以β-actin為內(nèi)參基因,對HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒載體感染HSC-LX2細胞后HIF-1α、HIF-2α表達效果進行qPCR和Western blot檢測。結(jié)果顯示,與空載慢病毒感染的HSC-LX2細胞比較(分別為HIF-1α對照組和HIF-2α對照組),HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染的HSC-LX2細胞中(分別為HIF-1α組和HIF-2α組)基因表達豐度均顯著升高(P<0.05),說明兩種過表達慢病毒感染效果理想。見圖5。

圖5 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞后表達效果檢測(a.與HIF-1α對照組比較,HIF-1α組HIF-1α mRNA的表達水平顯著升高;b.與HIF-2α對照組比較,HIF-2α組HIF-2α mRNA的表達水平顯著升高;c.HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞后應用Western blot檢測蛋白表達情況)

2.3 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞對CD248表達水平的影響 使用HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒和空載慢病毒感染HSC-LX2細胞,并使用濃度為1 000 μmol/L的CoCl2溶液進行低氧處理。以β-actin作為內(nèi)參基因,使用qPCR對細胞中CD248的表達情況進行檢測,結(jié)果顯示,與空載慢病毒感染的HSC-LX2細胞(分別為HIF-1α陰性對照組和HIF-2α陰性對照組)比較,HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染的HSC-LX2細胞(分別為HIF-1α過表達組和HIF-2α過表達組)中,CD248基因表達豐度均顯著升高(P<0.05)。見圖6。因此,在缺氧環(huán)境下的HSC中,HIF-1α、HIF-2α均可能參與調(diào)控CD248基因表達增加。

圖6 HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞對CD248 mRNA表達水平的影響(a.HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染HSC-LX2細胞的明場視野與綠色熒光視野;b.與HIF-1α陰性對照組比較,HIF-1α過表達組CD248 mRNA表達水平顯著升高;c.與HIF-2α陰性對照組比較,HIF-1α過表達組CD248 mRNA表達水平顯著升高)

3 討論

目前,CD248被認為是激活狀態(tài)的周細胞和腫瘤間質(zhì)肌成纖維細胞的標記物[15]。CD248在腫瘤疾病進程中主要參與血管生成、調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞遷移等過程[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn),CD248過表達的細胞有較強的遷移能力及粘附性質(zhì)[18]。目前,關(guān)于CD248下游調(diào)控分子機制的研究較少。近年的研究發(fā)現(xiàn),CD248主要通過PDGF受體信號途徑調(diào)節(jié)細胞增殖,細胞中的CD248可調(diào)控PDGF-BB刺激誘導PDGF受體和MAP激酶ERK-1/2磷酸化及轉(zhuǎn)錄因子c-Fos表達,進而調(diào)節(jié)細胞增殖[19]。此外,目前關(guān)于CD248表達及其上游調(diào)控分子機制也缺乏足夠的認識。本研究在探索HIF對CD248調(diào)控作用時,首先在BCS肝組織活檢樣本中發(fā)現(xiàn)了CD248與HIF-1α、HIF-2α之間表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān),隨后通過構(gòu)建HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒載體并感染使用CoCl2低氧誘導的HSC-LX2細胞來觀察CD248的表達情況,結(jié)果顯示,與空載慢病毒感染組比較,HIF-1α、HIF-2α過表達慢病毒感染的HSC-LX2細胞中CD248 mRNA表達明顯增高,這表明,在HSC中HIF-1α、HIF-2α過表達可能直接或間接上調(diào)CD248基因的表達水平。

HIF是細胞在缺氧環(huán)境中保護細胞和調(diào)節(jié)細胞適應缺氧環(huán)境的重要細胞因子。在正常氧水平的環(huán)境下,HIF的α亞基被氧依賴的脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)修飾,導致α亞基發(fā)生泛素化,進而發(fā)生蛋白降解。缺氧時,PHD被誘導失活,導致α亞基穩(wěn)定存在并轉(zhuǎn)位到細胞核中,與β亞基結(jié)合形成有活性的轉(zhuǎn)錄復合體[20]。HIF可以調(diào)節(jié)多種基因表達,包括促進血管生成的血管內(nèi)皮生長因子及血管生成素-2等[21-22]。然而,目前少有研究評估肝組織中HIF對CD248基因表達的影響。Ohradanova等[23]在腫瘤細胞的缺氧環(huán)境中評估了HIF-1α、HIF-2α與CD248表達之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下HIF-2α會上調(diào)CD248基因表達水平,并在CD248基因的上游調(diào)節(jié)區(qū)中發(fā)現(xiàn)了可與HIF-2直接結(jié)合并介導缺氧反應的順式反應元件;該研究還發(fā)現(xiàn),高細胞密度上調(diào)CD248表達是由缺氧環(huán)境通過SP1轉(zhuǎn)錄因子介導的;但此研究未證實HIF-1α在缺氧條件下對CD248基因表達調(diào)節(jié)的影響。本研究發(fā)現(xiàn),在缺氧狀態(tài)下的HSC中,HIF-1α與HIF-2α均可誘導CD248基因表達上調(diào)。

本研究存在一些局限性。由于BCS是一種罕見疾病,本研究僅收集到了9例合格的BCS患者,樣本量較小,在日后的研究中筆者將擴大樣本量并制作動物模型進一步探索。此外,本研究僅完成了mRNA水平上HIF-1α與HIF-2α對CD248表達調(diào)控的研究。日后的研究應將繼續(xù)探索在蛋白水平上HIF-1α與HIF-2α對CD248表達的影響,并進一步闡明其在肝疾病中的作用機制。

近年來,隨著HIF和CD248在癌癥和纖維化等肝疾病中的作用機制被不斷闡明,二者也逐漸成為治療此類疾病的理想靶點[24-25]。筆者認為,本研究對日后探索缺氧相關(guān)肝疾病的分子靶向治療方面具有重要意義,并為進一步探索HIF對CD248的調(diào)控關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述,在缺氧狀態(tài)下的HSC中,HIF-1α、HIF-2α均可能參與調(diào)控CD248基因表達增加。