大黃素-香豆素噻唑類衍生物的合成及其抗哈氏弧菌活性

吳玉宇, 梁馨文, 蘇子欽, 陳 超, 高田田, 邱 敏, 胡繼亮, 劉 強, 張建龍, 劉瑋煒,2,3*

(1. 江蘇海洋大學(xué) 藥學(xué)院 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室,江蘇 連云港 222005;2. 江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院 江蘇海洋生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 連云港 222005;3. 江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇 連云港 222005)

近年來,我國的海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛,漁業(yè)產(chǎn)量大幅增長,穩(wěn)居世界前列。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度的不斷提高,養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化,各類水產(chǎn)致病菌引發(fā)的病害頻發(fā),嚴重阻礙了海水魚類的養(yǎng)殖和發(fā)展,給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失[1-2]。我國的海水養(yǎng)殖疾病已多達100余種,細菌性疾病是其中一類最常見的、多發(fā)性的和危害最大的病害,已知的病原菌達數(shù)10種,而哈氏弧菌(Vibrioharveyi)是其中一種主要的條件致病菌[3-4]。

當前對于海水養(yǎng)殖過程中的細菌性疾病多采用化學(xué)藥物防治的方法,主要包括抗生素類藥物青霉素,喹諾酮類藥物諾氟沙星,磺胺類藥物新諾明,呋喃類藥物痢特靈以及抗菌增效劑甲氧芐胺嘧啶等。但長期單一使用一種藥物會產(chǎn)生抗性,出現(xiàn)耐藥性菌株[5]。因此,水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)對安全有效的新型抗菌藥的需求日益加劇,尋找新的先導(dǎo)化合物或化合物骨架修飾、簡化并開發(fā)出新型水產(chǎn)抗菌藥已成為當前水產(chǎn)病害防控研究的熱點。

天然產(chǎn)物來源廣泛,生物活性豐富,是發(fā)現(xiàn)藥物或先導(dǎo)化合物的重要來源。隨著分析儀器、分析化學(xué)和實驗手段的迅速發(fā)展,天然產(chǎn)物中的活性成分得到了鑒定及分離純化。研究表明,抑菌、殺菌的有效成分主要包括含氮含硫化合物、生物堿、酰胺、香豆素及醌類化合物等[6-7]。將其中具有開發(fā)前景的化合物作為活性先導(dǎo),再進行結(jié)構(gòu)修飾和簡化,尋找活性更高、更為安全有效的候選藥物,具有很好的研究價值與研究意義。

大黃素(圖1)普遍存在于蓼科植物大黃、虎杖和蘆薈等中藥材中,也能從海洋真菌和海綿體伴生真菌中分離得到,是分布最廣泛的一種天然三羥基蒽醌類化合物[8-11]。大黃素作為一種重要的天然活性成分,其生物活性廣泛,包括保護肝臟[13-14]、導(dǎo)瀉[15]、抗菌[16-17]、抗炎[18]、抗癌[19-20]、抗病毒[21-22]、抗氧化[23]及降糖降脂[24-25]等。

圖1 大黃素的結(jié)構(gòu)

目前,化學(xué)修飾大黃素主要集中在6-位甲基,通常是利用甲基或乙?；Ｗo1-、 3-和8-位的3個羥基,然后再由化學(xué)修飾甲基位,最后選擇性地將保護基脫除。其中,FALK課題組[26]的研究很有代表性,該課題組對大黃素6-位甲基分別進行了鹵代、甲?；鞍被揎?。甲基保護羥基后,對6-位的甲基進行溴代,經(jīng)一系列反應(yīng)后制得核堿基為胞嘧啶腺嘌呤和胸腺嘧啶的ω,ω-二取代金絲桃素衍生物。另外,研究表明,帶有氨基的蒽醌類化合物擁有較強的細胞毒活性[27]。因此,FALK課題組[28]利用Curtius重排,在大黃素甲基位引入氨基,使其成為一個更好的反應(yīng)中間體(圖2)。在大黃素上增加一個環(huán)可以使大黃素的平面結(jié)構(gòu)增大,從而使其紫外吸收波長紅移達到醫(yī)學(xué)需求。FALK課題組[29]將大黃素甲?；?并將其作為關(guān)鍵中間體與雜環(huán)類化合物反應(yīng),在大黃素甲基位上引入一個五元雜環(huán)。研究發(fā)現(xiàn):這類大黃素衍生物最大吸收波長均在600 nm左右,另外還具有一定的生物活性(圖3)。

圖2 大黃素胺的合成

圖3 大黃素雜環(huán)衍生物的結(jié)構(gòu)

STEFANO等[30]將四芳基葉琳類化合物引入大黃素的甲基位,發(fā)現(xiàn)該類化合物作為光敏試劑具有良好的效果,同時測定此化合物對人結(jié)腸腺癌細胞的抑制活性,結(jié)果表明,此類衍生物的IC50值均小于2 μM,活性遠高于母體大黃素(圖4)。

圖4 大黃素四芳基葉琳類衍生物

香豆素類化合物具有抗菌[31-32]、抗癌[33-34]、抗氧化[35]、抗凝血[36]和調(diào)節(jié)植物生長[37]等多種生物活性,是現(xiàn)代藥物研發(fā)的熱點。噻唑環(huán)是眾多活性化合物的核心骨架結(jié)構(gòu),也是新藥研制過程中一個良好的藥效基團。目前,臨床上使用的廣譜抗生素如氨曲南(Ⅰ)、磺胺噻唑(Ⅱ)和頭孢地尼(Ⅲ)等都含有氨基噻唑結(jié)構(gòu)(圖5)。鑒于此,本研究通過酰胺鍵將具有良好抑菌活性的香豆素噻唑與大黃素連接到同一個分子中,設(shè)計并合成了一系列含香豆素噻唑的大黃素酰胺類衍生物(圖6～7)。

圖5 含氨基噻唑結(jié)構(gòu)的藥物分子

圖6 含香豆素噻唑的大黃素酰胺類衍生物的結(jié)構(gòu)

圖7 含香豆素噻唑的大黃素酰胺類衍生物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4B型數(shù)字顯微熔點儀;WFH-204B型紫外分析儀;AVANCE型核磁共振氫譜儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標);WFH-203型紅外光譜儀(KBr壓片);Agilent 6230型液質(zhì)聯(lián)用儀。

大黃素(80%,武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司);氨水(25%,天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成

在250.00 mL圓底燒瓶中,依次加入大黃素1(2.70 g, 10.00 mmol),四丁基溴化銨(1.94 g, 6.00 mmol),無水碳酸鉀(2.10 g, 15.00 mmol), 30.00 mL碳酸二甲酯(DMC)和40.00 mL已干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF),體系加熱至110 ℃,磁力攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液倒入盛有400 mL蒸餾水的大燒杯中,加入12 mol/L的濃鹽酸調(diào)至pH=1,攪拌析出大量固體,減壓抽濾,濾餅為得到的粗產(chǎn)品。經(jīng)柱層析(洗脫劑:二氯甲烷)得黃色固體化合物2,產(chǎn)率73.4%。

(2) 化合物3的合成

首先制備實驗中所用的四丁基高錳酸銨(TBAP)。稱取高錳酸鉀(1.52 g, 9.60 mmol)溶于20.00 mL蒸餾水,攪拌條件下,緩慢滴加溶于10.00 mL蒸餾水的四丁基溴化銨(3.10 g, 9.60 mmol),滴加完畢,室溫繼續(xù)攪拌1 h,大量紫色固體析出,抽濾,水洗3次,用乙醚-丙酮混合溶劑重結(jié)晶得到TBAP。然后,稱取自制的TBAP(3.00 g, 8.30 mmol)和化合物2(0.50 g, 1.60 mmol)置于圓底燒瓶中,加入60.00 mL吡啶,于80 ℃條件下攪拌反應(yīng)2.5 h,反應(yīng)完畢,冷卻,移至冰水浴,加入焦亞硫酸鈉(5.00 g, 26.30 mmol),繼續(xù)攪拌0.5 h后,將反應(yīng)液倒入裝有500.00 mL蒸餾水的燒杯中,用濃鹽酸調(diào)至pH=1,溶液由紫色變?yōu)辄S色,大量固體析出,抽濾,濾餅水洗3次,得黃色固體30.40 g,產(chǎn)率83.0%。

(3) 化合物5的合成

50.00 mL圓底燒瓶中依次加入水楊醛類化合物4(6.40 mmol),乙酰乙酸乙酯(1.00 mL, 7.70 mmol),再加入20.00 mL乙醇使其溶解,室溫攪拌反應(yīng)5 min后,加入6.00 μL哌啶,繼續(xù)攪拌,TLC監(jiān)測反應(yīng),反應(yīng)完畢,析出固體,經(jīng)抽濾得化合物5。

(4) 化合物6的合成

50.00 mL圓底燒瓶中依次加入溴化銅(1.00 g, 4.50 mmol)以及10.00 mL乙酸乙酯,在55 ℃條件下加熱攪拌0.5 h。稱取化合物5(2.30 mmol)溶于10.00 mL氯仿,并緩慢滴加至反應(yīng)液中,在55 ℃條件下繼續(xù)攪拌過夜,反應(yīng)完畢,冷卻至室溫,抽濾,取濾液蒸除溶劑,加入二氯甲烷,水洗3次,分液,取有機相蒸除溶劑得粗品6。

(5) 化合物7的合成

稱取化合物6(1.00 mmol)以及硫脲(1.10 mmol)置于單口燒瓶中,加入20.00 mL乙醇,升溫至80 ℃,攪拌反應(yīng)1.5 h,反應(yīng)完畢,冷卻至室溫,加入氨水中和,析出固體,抽濾,濾餅用乙醇洗滌,干燥得化合物7。

(6) 化合物8a～8f的合成

25.00 mL圓底燒瓶中依次加入化合物3(0.21 g, 0.60 mmol)、 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.34 g, 0.90 mmol)、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)(248.00 μL, 1.50 mmol)以及12.00 mL二氯甲烷,室溫攪拌反應(yīng)0.5 h后,稱取化合物7加入到反應(yīng)液中,繼續(xù)室溫攪拌過夜,反應(yīng)完畢,析出固體,抽濾,所得固體依次用飽和碳酸氫鈉、稀鹽酸以及蒸餾水洗滌數(shù)次得化合物8。

4,5,7-三甲氧基-N-(4-(8-甲氧基-2-氧代-2H-鉻-3-基)噻唑-2-基)-9,10-二氧基-9,10-二氫蒽-2-甲酰胺(8a): 黃色固體,收率62.0%, m.p.>310 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 9.92(s, 1H, NH), 8.57(s, 1H), 8.30(s, 1H), 8.25(s, 1H, Ar-H), 8.03(s, 1H, Ar-H), 7.36(d,J=2.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.24(s, 1H, Ar-H), 7.20(d,J=7.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.10(d,J=7.9 Hz, 1H, Ar-H), 6.81(d,J=1.8 Hz, 1H, Ar-H), 4.11(s, 3H, OCH3), 4.00(s, 3H, OCH3), 3.98(d,J=1.7 Hz, 6H, OCH3);IR(KBr): 3421, 2848, 1727, 1662, 1599, 1466, 1317, 1276, 1072, 1009, 876 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C31H23N2O9S{[M+H]+}599.11188, Found 599.11121。

4,5,7-三甲氧基-N-(4-(8-乙氧基-2-氧代-2H-鉻-3-基)噻唑-2-基)-9,10-二氧基-9,10-二氫蒽-2-甲酰胺(8b): 黃色固體,收率61.0%, m.p.280～282 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 10.51(s, 1H, NH), 8.56(s, 1H), 8.37(d,J=0.9 Hz, 1H), 8.27(s, 1H, Ar-H), 8.07(s, 1H, Ar-H), 7.36(d,J=2.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.25(t,J=7.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.20(d,J=7.2 Hz, 1H, Ar-H), 7.11(d,J=7.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.81(d,J=2.2 Hz, 1H, Ar-H), 4.24(q,J=7.0 Hz, 2H, CH2), 4.14(s, 3H, OCH3), 4.00(s, 3H, OCH3), 3.99(s, 3H, OCH3), 1.28(t,J=3.2 Hz, 3H, CH3). IR(KBr) : 3426, 2970, 2782, 1727, 1664, 1600, 1463, 1316, 1278, 1068, 1019, 883 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C32H25N2O9S{[M+H]+}613.12753, found 613.12746。

4,5,7-三甲氧基-N-(4-(6-氟-2-氧代-2H-鉻-3-基)噻唑-2-基)-9,10-二氧-9,10-二氫蒽-2-甲酰胺(8c): 黃色固體,收率68.0%, m.p.>310 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 9.90(s, 1H, NH), 8.57(s, 1H), 8.32(s, 1H), 8.29(s, 1H, Ar-H), 8.06(s, 1H, Ar-H), 7.39(s, 2H, Ar-H), 7.32(d,J=7.5 Hz, 2H, Ar-H), 6.84(s, 1H, Ar-H), 4.13(s, 3H, OCH3), 4.02(s, 6H, OCH3); IR(KBr) : 3408, 2974, 2779, 1728, 1676, 1600, 1465, 1316, 1254, 1072, 1024, 881 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C30H20FN2O8S{[M+H]+}587.09189, found 587.09124。

4,5,7-三甲氧基-N-(4-(6-甲氧基-2-氧代-2H-鉻-3-基)噻唑-2-基)-9,10-二氧基-9,10-二氫蒽-2-甲酰胺(8d): 黃色固體,收率61.0%, m.p.268～270 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 8.61(s, 1H), 8.37(s, 1H), 8.27(s, 1H, Ar-H), 8.07(s, 1H, Ar-H), 7.37(d,J=2.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.33(s, 1H, Ar-H, Ar-H), 7.16(dd,J=9.0 Hz, 2.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.09(d,J=2.7 Hz, 1H, Ar-H), 6.83(d,J=2.3 Hz, 1H, Ar-H), 4.14(s, 3H, OCH3), 4.02(s, 3H, OCH3), 4.00(s, 3H, OCH3), 3.90(s, 3H, OCH3); IR(KBr) : 3422, 2843, 2778, 1715, 1667, 1599, 1466, 1319, 1259, 1026, 881 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C31H23N2O9S{[M+H]+}599.11188, found 599.11126。

4,5,7-三甲氧基-N-(4-(2-氧代-2H-鉻-3-基)噻唑-2-基)-9,10-二氧代-9,10-二氫蒽-2-甲酰胺(8e): 黃色固體,收率64.0%, m.p.294～295 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 8.53(s, 1H), 8.32(d,J=6.4 Hz, 1H), 8.07(s, 1H, Ar-H), 7.92(s, 1H, Ar-H), 7.74(s, 1H, Ar-H), 7.49(s, 1H, Ar-H), 7.39(s, 2H, Ar-H), 7.07(s, 1H, Ar-H), 6.85(s, 1H, Ar-H), 4.14(s, 3H, OCH3), 4.03(s, 6H, OCH3); IR(KBr): 3420, 2970, 1719, 1648, 1598, 1455, 1318, 1252, 1070, 1028, 878 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C30H21N2O8S:{[M+H]+}569.10131, found 569.10143。

4,5,7-Trimethoxy-N-(4-(6-chloro-2-oxo-2H-chromen-3-yl)thiazol-2-yl)-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-carboxamide(8f): 黃色固體,收率65.0%, m.p.>310 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 8.46(s, 1H), 8.39(s, 1H), 8.24(s, 1H, Ar-H), 8.05(s, 1H, Ar-H), 7.58(d,J=2.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.50(dd,J=8.7 Hz, 2.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.34(d,J=8.7 Hz, 2H, Ar-H), 6.81(d,J=2.3 Hz, 1H, Ar-H), 4.13(s, 3H, OCH3), 4.00(s, 3H, OCH3), 3.99(s, 3H, OCH3); IR(KBr): 3404, 2976, 2901, 1734, 1632, 1598, 1454, 1250, 1087, 1050, 881 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C30H20ClN2O8S{[M+H]+}603.06234, found 603.06228。

1.3 哈氏弧菌活性測試

無菌環(huán)境下,向平板中倒入約20 mL已滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,凝固后,加入200 μL的菌懸液,涂布棒涂布均勻,靜置10 min。將牛津杯垂直均勻放置于培養(yǎng)基上,在杯中加入200 μL的待測樣品,每個樣品進行3次平行實驗,移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后,用電子數(shù)顯卡尺測定抑菌圈直徑,取3次測量結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗哈氏弧菌活性測試

化合物8a～8f的抗菌實驗結(jié)果如表1所示。從表1可以看出,合成的6個含香豆素噻唑的大黃素酰胺類衍生物在濃度為0.25 mg/mL時對哈氏弧菌基本無抑制活性,然而只有化合物8b、8c和8f表現(xiàn)出較弱的哈氏弧菌抑制活性,MIC均為0.25 mg/mL。

表 1 化合物8a～8f體外抑制哈氏弧菌活性測試

本研究以取代水楊醛為原料,通過Knoevengel法制得3-乙?；愣顾?經(jīng)溴化銅溴化后與硫脲反應(yīng),采用經(jīng)典的Hantzsch法關(guān)環(huán)得到香豆素噻唑類衍生物。最后,在HATU的縮合作用下,中間體大黃素羧酸與3-(2-氨基噻唑-4-基)香豆素類化合物反應(yīng),得到6個新型含香豆素噻唑的大黃素酰胺類衍生物。此外,對6個新化合物進行哈氏弧菌活性測試,發(fā)現(xiàn)化合物8b、8c和8f表現(xiàn)出較弱的哈氏弧菌抑制活性,MIC均為0.25 mg/mL,表明該化合物對哈氏弧菌的活性具有一定影響。在今后研究中,有望改善和提高該類衍生物的抗菌活性,為找到更高活性的抗哈氏弧菌化合物作為新型水產(chǎn)抗菌藥提供參考。