基于生物信息技術(shù)研究陳士鐸治療不孕的用藥規(guī)律與作用機(jī)制

石權(quán)芳

何有中中醫(yī)門診部,廣東省廣州市 510091

陳士鐸,字敬之,號(hào)遠(yuǎn)公,浙江山陰(今浙江紹興)人,約生于明天啟年間,卒于清康熙年間[1]。陳士鐸著作頗多,上精岐黃,下通百家,學(xué)術(shù)思想鮮明,尊古旨而創(chuàng)新法,臨床多運(yùn)用五行理論闡釋病機(jī)所在以及處方用藥,對(duì)于不孕的認(rèn)識(shí)另辟蹊徑,獨(dú)樹一幟,故本研究就在于整理陳士鐸治療不孕醫(yī)案的理論以及處方規(guī)律,旨在探討陳士鐸治療不孕疾病學(xué)術(shù)思想、處方用藥規(guī)律以及運(yùn)用現(xiàn)代的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段闡釋物質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制,以饗同道。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究選自《陳士鐸醫(yī)學(xué)全書》[2]中有關(guān)不孕治驗(yàn)的記載,最終納入20首方劑和50味中藥。

1.2 數(shù)據(jù)整理 中藥名稱、分類等參照《中華人民共和國藥典:2015年版》[3]和《中藥學(xué)》[4]進(jìn)行規(guī)范。譬如“金釵石斛”統(tǒng)一為“石斛”,“破故紙”統(tǒng)一為“補(bǔ)骨脂”,“甘菊花”統(tǒng)一為“菊花”等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將不孕醫(yī)案的藥物按標(biāo)準(zhǔn)錄入 Microsoft Excel,建立“《陳士鐸醫(yī)學(xué)全書》治療不孕疾病用藥數(shù)據(jù)庫”,所有數(shù)據(jù)均雙人負(fù)責(zé)審核,確保數(shù)據(jù)無誤;應(yīng)用SPSS 25.0聚類分析,聚類方法采用質(zhì)心聚類,度量標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間采用 Pearson 相關(guān)性度量,應(yīng)用SPSS Modeler 14.1 Apriori進(jìn)行藥物關(guān)聯(lián)分析,支持度>20%,置信度>80%。生物學(xué)機(jī)制通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine, TCMIP) v2.0分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻次 總結(jié)《陳士鐸醫(yī)學(xué)全書》中的所有關(guān)于不孕的相關(guān)醫(yī)案,排除重復(fù)醫(yī)案以及方藥,總計(jì)納入20首方劑、50味中藥,總計(jì)用藥151頻次,頻次≥3的中藥有20味,其貢獻(xiàn)度為75.50%。治療不孕中藥中使用頻次位居前10 的分別是白術(shù)、人參、茯苓、巴戟天、肉桂、當(dāng)歸、杜仲、熟地、山藥、白芍,見表1。

表1 陳士鐸治療不孕高頻中藥及頻率

2.2 藥物的氣味歸經(jīng)分布 對(duì)治療不孕疾病的所有藥物進(jìn)行氣味歸經(jīng)的分布統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示四氣以“溫”為主;五味以“甘”為主;歸經(jīng)以“脾”為主,依次是脾(87頻次)、腎(74頻次)、肺(52頻次)、肝(50頻次)、胃(44頻次)、心(38頻次)、大腸(5頻次)、三焦(3頻次)、膽(3頻次)、心包(2頻次)。

2.3 聚類分析 聚類分析結(jié)果顯示,可將治療不孕的藥物分為14組,見表2。

表2 陳士鐸治療不孕藥物聚類分析結(jié)果

2.4 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析顯示,對(duì)藥有8組,涉及8味中藥,山茱萸、熟地黃、白術(shù)、肉桂、巴戟天、人參、茯苓、杜仲。角藥有6組,涉及5味中藥,白術(shù)、肉桂、巴戟天、茯苓、人參,見表3。

表3 藥物之間的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.5 中藥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制挖掘結(jié)果 本研究將關(guān)聯(lián)規(guī)則支持度、置信度最高的角藥(人參—巴戟天—白術(shù))進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究,通過TCMIP v2.0中的“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊的藥物選擇“人參—巴戟天—白術(shù)”,疾病選擇“female infertility”進(jìn)行生物分子機(jī)制研究。中藥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制挖掘結(jié)果共計(jì)195個(gè)節(jié)點(diǎn),包括CYP19A1、ESR1、ESR2。核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)及其拓?fù)涮卣髦倒灿?jì)198個(gè),見表4。

表4 核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)及其拓?fù)涮卣髦盗斜?/p>

2.6 GO分析與KEGG分析 基于TCMIPv2.0對(duì)“人參—巴戟天—白術(shù)”與不孕進(jìn)行GO分析和KEGG分析。GO-生物過程前10的包括氧化還原過程、乙醇氧化、細(xì)胞醛代謝過程、電子傳遞鏈、輔因子代謝過程、碳水化合物代謝過程、對(duì)毛喉素的細(xì)胞反應(yīng)、草酰乙酸代謝過程、cAMP 生物合成過程、脂肪酸代謝過程;GO-細(xì)胞成分前10 的包括線粒體基質(zhì)、線粒體、髓鞘、線粒體內(nèi)膜、胞質(zhì)溶膠、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、膜筏、核質(zhì)、線粒體膜;GO-分子功能前10的包括醛脫氫酶 (NAD) 活性、氧化還原酶活性、氧化還原酶活性,作用于供體的醛或氧代基團(tuán),NAD 或 NADP 作為受體、3-磷酸甘油醛脫氫酶 (NAD+)(非磷酸化)活性、NAD綁定、3-氯烯丙醛脫氫酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、3-羥?；o酶A脫氫酶活性、電子轉(zhuǎn)移活性、腺苷酸環(huán)化酶活性。

反應(yīng)組通路前10的包括乙醇氧化、PKA激活、辛酰輔酶A的β氧化為己酰輔酶A、癸酰輔酶Aβ氧化為辛酰輔酶A-CoA、呼吸電子傳輸、RA生物合成途徑、腺苷酸環(huán)化酶激活途徑、四氫生物蝶呤 (BH4) 的合成、回收、回收和調(diào)節(jié)、eNOS 激活、腺苷酸環(huán)化酶抑制途徑。

2.7 藥物—成分—靶標(biāo)—通路分析 基于TCMIP v2.0對(duì)“人參—巴戟天—白術(shù)”與不孕進(jìn)行構(gòu)建自定義多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化圖。3味中藥,53個(gè)有效化學(xué)成分,51個(gè)核心靶標(biāo),14條通路發(fā)揮治療不孕的藥理作用,見表5。

表5 排名前14的信號(hào)通路

3 討論

本研究基于《陳士鐸醫(yī)學(xué)全書》的不孕醫(yī)案進(jìn)行用藥規(guī)律分析,共計(jì)納入20首方劑和50味中藥。高頻使用的藥物以補(bǔ)氣、溫陽、補(bǔ)腎為主,中醫(yī)證候特征分析不孕多以腎虛血瘀、腎氣不足多見[5]。陳士鐸認(rèn)為,后天資助先天,只有脾胃健運(yùn)才能補(bǔ)益腎水。目前臨床多認(rèn)為不孕癥宜從腎虛血瘀入手,但療效差強(qiáng)人意,呂春英指出,臨床使用健脾益氣、健脾溫陽、健脾養(yǎng)陰之法,重視脾的作用,往往會(huì)有意想不到的療效,但仍然要尊重中醫(yī)辨證原則[6]。陳士鐸注重五行理論的運(yùn)用,水侮土,往往會(huì)出現(xiàn)中焦失運(yùn),中焦脾胃受損則水谷精微不能輸布,導(dǎo)致五臟虧虛,腎臟更加失職,因此治療之時(shí)以健脾制水,人參、白術(shù)、茯苓取四君子湯之意,巴戟天、肉桂溫補(bǔ)腎陽,當(dāng)歸、白芍、山藥補(bǔ)虛,熟地、杜仲益腎。本研究的四氣五味歸經(jīng)以“溫”“甘”“脾”為主,結(jié)果也同樣支持重視脾的治療原則,溫中健脾,甘溫補(bǔ)后天以資先天。

陳士鐸重視先天與后天的關(guān)系,同時(shí)也注重辨證原則。聚類分析結(jié)果將藥物分為14類,除了溫陽、健脾、補(bǔ)腎之外,有行氣、清熱、滋陰、祛濕等治法。中醫(yī)素有女子以肝為先天之說,肝藏血、主疏泄瀉影響著生殖機(jī)能,陳士鐸指出,“血藏肝中,精涵腎內(nèi),若肝氣不開,則精不能泄?！蓖瑫r(shí)陳士鐸認(rèn)為濕邪的產(chǎn)生并非外邪,而是責(zé)之于脾土。陳士鐸治療選用補(bǔ)中益氣湯,而非祛濕化痰消克之藥,陳氏認(rèn)為,“提脾氣而升于上,則水濕反利于下行,助胃氣而消于下,則痰涎轉(zhuǎn)易于上化?！薄瓣枤馔?自足以攝精;邪濕散,自可以受?！眰湓兄瞬豢捎霉シブ窊p害正氣,運(yùn)用補(bǔ)中益氣湯以升為降的臨床思維值得我們借鑒。

對(duì)藥、角藥是運(yùn)用中醫(yī)理論的一種配伍方式,藥少而專,配伍的目的有相互協(xié)助而增強(qiáng)藥力、相互制約而展其長(zhǎng)、 兩藥合用而另生新用、兩藥合用有溝通導(dǎo)引作用[7-8]。熟地黃配伍山茱萸以補(bǔ)腎填精,陳士鐸在《本草新編》[8]中指出,“蓋腎水非得酸不能生,山茱萸味酸而性又溫,佐熟地實(shí)有水乳之合。然而山茱萸味過于酸,非得熟地之甘溫,山茱萸亦不能獨(dú)生腎水也。配合相宜,如夫婦之好合,以成既濟(jì)之功也。”白術(shù)利腰臍之濕,與肉桂、巴戟天、杜仲配伍,補(bǔ)瀉相合,腰臍之氣既利,而腎中之濕氣既除,此時(shí)方可補(bǔ)益。陳士鐸認(rèn)為人參為補(bǔ)氣健脾之圣藥,人參氣味陽多于陰,少用則泛上,多用則沉下,人參與肉桂、巴戟天配伍溫補(bǔ)腎陽,人參與白術(shù)、茯苓配伍健脾以制水。陳士鐸在《本草新編》[8]中指出,“蓋人參乃君藥,宜同諸藥共用,始易成功……如健脾也,必加茯苓、白術(shù)……用之補(bǔ)則補(bǔ),用之攻則攻,視乎配合得宜,輕重得法耳?！?/p>

家族19亞家族A成員1 (CYP19A1)基因編碼的酶是細(xì)胞色素P450超家族的成員,CYP19A1基因編碼的芳香酶是催化雌激素生物合成過程中雄烯二酮和睪酮對(duì)雌酮和雌二醇的芳構(gòu)化的最終和限速步驟的主要酶[9]。CYP19A1蛋白質(zhì)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 在雌激素生物合成中起著催化作用。CYP19A1在婦科疾病中的作用已經(jīng)備受關(guān)注,一項(xiàng)臨床研究顯示,55名多囊卵巢綜合征(PCOS)患者與55名未患 PCOS 的女性相比,患有 PCOS 的女性芳香化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)較低(P<0.05)。 PCOS組CYP19A1(芳香酶)mRNA的相對(duì)表達(dá)為0.38±0.25,而非PCOS組為1.00±0.00[10]。也有直接證據(jù)指向CYP19A1與不孕密切相關(guān),一項(xiàng)薈萃研究顯示,雌激素受體2(ESR2)和CYP19A1基因可能是子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕的潛在危險(xiǎn)因素[11]。本研究顯示,疾病—藥物關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)包括CYP19A1、ESR1、ESR2,因此我們推測(cè)角藥“人參—巴戟天—白術(shù)”是通過調(diào)控CYP19A1、ESR1、ESR2來發(fā)揮作用。

本研究運(yùn)用生物信息技術(shù)對(duì)陳士鐸治療不孕的用藥規(guī)律和物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究,從宏觀和微觀兩個(gè)層面為科研和臨床提供了依據(jù);雖然采用整合技術(shù)手段,但仍然存在諸多不足,不能全面展現(xiàn)中醫(yī)的整體思維和辨證論治特色,需要結(jié)合臨床實(shí)際互相彌補(bǔ)。