LPS-RS、mNGF對致癇幼鼠保護(hù)性研究及TRX、NSE監(jiān)測

陳冬湄

福建省泉州市兒童醫(yī)院 362000

癲癇是一種以反復(fù)抽搐為表現(xiàn)形式的慢性腦部疾病,在兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病中非常常見,其原因多樣復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前大部分國內(nèi)外學(xué)者較認(rèn)可的說法是癲癇發(fā)作的過程出現(xiàn)了腦神經(jīng)元過度的同步化放電,反復(fù)發(fā)作,從而引起慢性的腦功能損傷。在可能導(dǎo)致癲癇的各種機(jī)制中,自由基的產(chǎn)生起著至關(guān)重要的作用,近年來多個(gè)研究表明[1],癲癇的發(fā)作伴發(fā)著自由基的產(chǎn)生,氧化應(yīng)激被認(rèn)為是癲癇腦損傷的發(fā)病機(jī)制之一。本研究采用了PTZ點(diǎn)燃的慢性癲癇幼鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?分別給予LPS-RS與mNGF對PTZ點(diǎn)燃的慢性癲癇幼鼠進(jìn)行干預(yù),通過與正常對照組比較血清及海馬TRX、NSE的表達(dá)差異,從而探討LPS-RS、mNGF對其表達(dá)產(chǎn)生的影響及作用機(jī)制,并比較mNGF與LPS-RS對癲癇相關(guān)腦神經(jīng)損傷保護(hù)作用的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物。清潔級Wistar雄性幼鼠[購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd,許可證號:SCXK(滬)2017-0005],共130只,日齡21d,體質(zhì)量50～65g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品。PTZ:美國Sigma公司,生產(chǎn)批號:MKCC1690;LPS-RS:美國invivogen公司,生產(chǎn)批號:RLP-39-02;mNGF:恩經(jīng)復(fù),廈門未名生物醫(yī)藥有限公司,生產(chǎn)批號:20160311;顯影定影試劑:中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司,生產(chǎn)批號:KGP116;rabbit anti-GAPDH(10B8):中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)批號:KGAA002;羊抗兔IgG-HRP:中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司,生產(chǎn)批號:KGAA35;大鼠TRX酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠NSE酶聯(lián)免疫試劑盒:包括封板膜,密封袋,酶標(biāo)包被板1x96長期-20℃,標(biāo)準(zhǔn)品(凍干粉),標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液,生物素抗原凍干粉,親和素-HRP濃縮液,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液等:上海朗頓生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:S20180318MY。

1.1.3 儀器及設(shè)備。高速冷凍離心機(jī):美國Thermo Sorvall ST 16R;37℃恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒THZ-100;ELISA酶標(biāo)儀:美國MD CMAXPLUS;洗板機(jī):拜爾PR510;pH計(jì):美國OHAUS STARTER 2C;分析天平:中國精密分析天平JA3003。

1.2 建立動物模型

1.2.1 分組前準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)所使用的130只清潔級Wistar雄性大鼠幼鼠置于實(shí)驗(yàn)動物中心隔離檢疫室中檢疫1周。在檢疫期間,檢疫室的室內(nèi)溫度維持在22～26℃,相對濕度40%～60%,12/12h晝夜照明變化,幼鼠均可自由進(jìn)食飼料和水。經(jīng)1周檢疫后無幼鼠死亡,將Wistar雄性大鼠幼鼠轉(zhuǎn)移至屏障環(huán)境中。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組。 使用隨機(jī)數(shù)表法將Wistar雄性大鼠幼鼠隨機(jī)分為4組:A組(空白對照組,n=31只)、B組(EP癲癇組,n=33只)、C組(mNGF組,n=33只)、D組(LPS-RS組,n=33只)

1.2.3 使用PTZ建立慢性癲癇幼鼠模型。建模期間,A組幼鼠給予等劑量9g/L生理鹽水,B、C、D組幼鼠每日均給予40mg/kg(質(zhì)量濃度10g/L)PTZ。給藥時(shí)間:8:00—10:00am;給藥方式:腹腔注射。每次給藥后均觀察幼鼠活動1h,記錄幼鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。幼鼠癲癇發(fā)作程度的分級參照Racine分級[2]標(biāo)準(zhǔn)判定(Ⅳ級及其以上癲癇發(fā)作即視為大發(fā)作):慢性點(diǎn)燃成功標(biāo)準(zhǔn):幼鼠出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級以上癲癇發(fā)作即提示點(diǎn)燃成功,慢性點(diǎn)燃成功后PTZ的給藥頻率改為2～3d給藥1次以維持點(diǎn)燃14d。

1.2.4 干預(yù)方法。A組:每日給予幼鼠相同劑量9g/L鹽水,不給予干預(yù)劑;B組:每日給予幼鼠相同劑量9g/L鹽水,不給予干預(yù)劑;C組:每日給予幼鼠mNGF 4μg/kg;D組:每日給予幼鼠LPS-RS 0.1mg/kg。干預(yù)時(shí)間:8:00—10:00am,連續(xù)給藥7d;干預(yù)方式:腹腔注射。

1.2.5 取材。在最后一次干預(yù)后于A、B、C、D 4個(gè)小組每組隨機(jī)取27只幼鼠進(jìn)行標(biāo)本采集,每組于3h、24h、72h三個(gè)時(shí)段各隨機(jī)采集9個(gè)標(biāo)本。取材流程:麻醉前禁食8～12h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)。麻醉幼鼠。從幼鼠腹主動脈抽取4ml血液至一次性抗凝血清管,靜置10min后,使用高速冷凍離心機(jī)(3 000r/min)離心15min,取標(biāo)本上清液置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。獲取血液標(biāo)本后,立刻予頸椎脫臼法處死幼鼠,將幼鼠腦組織置于冰臺上,使用高溫180℃可滅RNA酶的手術(shù)刀及眼科剪沿矢狀裂將腦組織分離,快速游離出海馬體,置于去RNA酶的凍存管中,放入液氮中速凍1min,并儲存于-80℃超低溫冰箱待ELISA檢測使用。

1.3 ELISA檢測(競爭法) 采用ELISA法(按照試劑盒說明書進(jìn)行)檢測血清及海馬TRX及NSE的濃度。

2 檢測結(jié)果

2.1 各組幼鼠血清不同時(shí)間點(diǎn)TRX濃度比較 結(jié)合表1結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點(diǎn)燃組(B、C、D)3h血清TRX濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清TRX濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05);B組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清TRX濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)C組血清TRX濃度均高于D組,且C、D組血清TRX均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表1 各組血清不同時(shí)間點(diǎn)TRX濃度比較

2.2 各組幼鼠海馬不同時(shí)間點(diǎn)TRX濃度比較 結(jié)合表2結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點(diǎn)燃組(B、C、

表2 各組海馬不同時(shí)間點(diǎn)TRX濃度比較

D)3h海馬TRX濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬TRX濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05);B組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬TRX濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)C組海馬TRX濃度均高于D組,且C、D組海馬TRX均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 各組幼鼠血清不同時(shí)間點(diǎn)NSE濃度比較 結(jié)合表3結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點(diǎn)燃組(B、C、D)3h血清NSE濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清NSE濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05);B組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清NSE濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)C組血清NSE濃度均高于D組,且C、D組血清NSE濃度均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表3 各組血清不同時(shí)間點(diǎn)NSE濃度比較

2.4 各組幼鼠海馬不同時(shí)間點(diǎn)NSE濃度比較 結(jié)合表4結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點(diǎn)燃組(B、C、D)3h海馬NSE濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬NSE濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05);B組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬NSE濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)C組海馬NSE濃度均高于D組,且C、D組海馬NSE濃度均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表4 各組海馬不同時(shí)間點(diǎn)NSE濃度比較

3 討論

3.1 NSE在癲癇治療監(jiān)測中的作用 烯醇化酶是一種二聚體糖酵解酶,有 3 種已知亞基類型和 5 種同工酶(αα、ββ、γγ、αβ 和 αγ),最初這些同工酶被認(rèn)為僅存在于神經(jīng)元中[3],然而,隨后被發(fā)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和一些非神經(jīng)元和非神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞也含有NSE。膠質(zhì)細(xì)胞僅含有 αα-烯醇化酶,而 γγ-烯醇化酶對神經(jīng)元(NSE)具有特異性,它特異性表達(dá)于神經(jīng)元與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi),為糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶,催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐急?正常情況下處于低水平表達(dá)。當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞膜受到損傷時(shí),很容易彌散到細(xì)胞外介質(zhì)和腦脊液中,其血清的半衰期>20h,神經(jīng)元損傷和血腦屏障完整性受損后,NSE 釋放至腦脊液并最終進(jìn)入血液,可對其進(jìn)行檢測,因此,在與中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞損傷相關(guān)的各種疾病中,NSE 被視為神經(jīng)元損傷和預(yù)后的標(biāo)志物。近十年來國內(nèi)外已發(fā)表了多篇關(guān)于癲癇發(fā)作和癲癇持續(xù)狀態(tài)后 NSE 升高的報(bào)道[4-5]。Rituparna Maiti等人[6]也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了卡馬西平及奧卡西平等常見抗癲癇藥物治療后均可以使血清NSE水平下降。因此在臨床癲癇治療過程中,血清NSE既可以作為癲癇輔助診斷的一個(gè)標(biāo)志物,同時(shí),對于抗癲癇藥物治療后的療效判斷也是一個(gè)非常好用的工具。

3.2 TRX在癲癇治療監(jiān)測中的作用 國內(nèi)外已有眾多報(bào)道及實(shí)驗(yàn)[7]證明,氧化應(yīng)激被認(rèn)為是癲癇腦損傷的發(fā)病機(jī)制之一。在癲癇發(fā)作時(shí),由于大腦對氧的高利用率反而更容易受到氧化應(yīng)激損傷,主要表現(xiàn)為自由基的產(chǎn)生增加、細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能障礙[8]等,其中,TRX是一種氧化還原蛋白,一種小型、多功能蛋白,在活性部位含有氧化還原活性二硫醇的保守活性位點(diǎn)序列,TRX以其調(diào)節(jié)氧化還原和清除活性氧中間體的活性,在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的胞內(nèi)和胞外具有多種重要的生物學(xué)作用。TRX是中樞膽堿能神經(jīng)元的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子,在機(jī)械性腦損傷中被上調(diào),當(dāng)癲癇發(fā)作時(shí)出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷,海馬及皮層TRX的蛋白表達(dá)水平可上調(diào)2～3倍,TRX蛋白表達(dá)水平的上調(diào)可活化半胱氨酸蛋白酶-3,活化的半胱氨酸蛋白酶-3在海馬區(qū)可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。相對于皮層,海馬更容易受到氧化損傷,故本實(shí)驗(yàn)除了采集標(biāo)本易得的血液,同時(shí)檢測海馬TRX濃度。

3.3 mNGF對癲癇的干預(yù)作用 神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員之一,在神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長、神經(jīng)遞質(zhì)的合成、神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、炎性痛覺過敏等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[9]。NGF 通過結(jié)合細(xì)胞表面的特異性受體,包括酪氨酸激酶 A (TrkA) 和 p75 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體 (p75NTR) 來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10]。TrkA 對 NGF 具有高親和力,NGF-TrkA 信號通路的激活可促進(jìn)部分細(xì)胞增殖、存活或轉(zhuǎn)移[11-13]。TrkA 的激活對癲癇發(fā)作模型大腦中神經(jīng)元的起保護(hù)作用。mNGF是從小鼠頜下腺提取的純化生物蛋白,相對分子質(zhì)量為26500,由于與人 NGF 具有同源性,mNGF作為藥物應(yīng)用于人類多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周系統(tǒng)疾病的治療,是目前研究最多的外源性神經(jīng)生長因子,尤其是周圍神經(jīng)損傷和顱腦外傷的修復(fù)效果顯著[14]。本實(shí)驗(yàn)中通過對4個(gè)小組血清、海馬TRX及NSE濃度的比較顯示,B組(EP組)即使用PTZ建立慢性癲癇幼鼠未使用任何干預(yù)劑,血清及海馬的TRX及NSE濃度在4個(gè)時(shí)間段監(jiān)測均處于最高水平,比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而C組即采用mNGF對慢性癲癇幼鼠進(jìn)行干預(yù)后的幼鼠血清及海馬的TRX、NSE濃度均較B組下降,但高于A組,比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),由此推測癲癇患兒反復(fù)癲癇發(fā)作,大腦損傷持續(xù)存在,而mNGF對癲癇造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有明顯保護(hù)作用。

3.4 LPS-RS的神經(jīng)保護(hù)性作用 Toll樣受體4(TLR4)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在,神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá),其中在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最多。TLR4在神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,一旦激活,TLR4 可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并最終促進(jìn)生成許多介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的促炎因子[15]。炎癥是癲癇發(fā)生病理生理機(jī)制的重要促進(jìn)因素,減輕炎癥有助于縮小癲癇的范圍和程度,有報(bào)道稱LPS-RS是TLR4的有效抑制劑,是一種來源于紅假單胞菌的脂多糖,可以通過競爭TLR4的受體來阻斷TLR4信號通路引起的炎癥反應(yīng)。有實(shí)驗(yàn)研究[16]已證實(shí)LPS-RS的最佳干預(yù)劑量為0.1mg/kg,故本實(shí)驗(yàn)以此為干預(yù)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過檢測血清及海馬的TRX濃度和NSE濃度來反映LPS-RS對癲癇的干預(yù)作用。結(jié)果顯示D組(LPS-RS組)干預(yù)后幼鼠血清及海馬的TRX濃度及NSE濃度均較B組(EP組)下降,且低于C組(mNGF組),說明LPS-RS對慢性癲癇幼鼠癲癇發(fā)作有抑制作用,通過抑制TLR4介導(dǎo)的信號通路抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥級聯(lián)反應(yīng),從而減輕神經(jīng)損傷,減少癲癇發(fā)作。同時(shí),相較于mNGF對癲癇幼鼠的干預(yù)作用,LPS-RS的作用效果更佳。通過本動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS-RS可能嘗試作為一種新型的抗癲癇藥物應(yīng)用于臨床,但目前仍缺乏大樣本數(shù)據(jù)作為依托,且藥物使用時(shí)間、應(yīng)用于人類的物種差異性等問題皆是下一步我們需要面對的難題,攻克癲癇治療的前路道阻且長。

綜上所述,LPS-RS對癲癇的神經(jīng)損傷起保護(hù)作用,可作為癲癇治療研究的靶點(diǎn)。 mNGF能夠修復(fù)癲癇反復(fù)發(fā)作后的神經(jīng)損傷,對神經(jīng)元起保護(hù)作用。血清TRX、NSE可以作為癲癇治療監(jiān)測的指標(biāo)。