逍遙舒坤顆粒對大鼠盆腔炎性疾病后遺癥的治療作用及其機制

左瑾楠，張兵，于瀟，劉鵬飛，劉金星

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250014；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦一科

盆腔炎性疾?。≒ID）是一組女性上生殖道及周圍組織的感染性疾病，包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔腹膜炎等，若未進(jìn)行及時恰當(dāng)?shù)闹委煟Ｒ鹋枨谎仔约膊『筮z癥（SPID）［1］。SPID可造成盆腔組織破壞、粘連及瘢痕形成，導(dǎo)致輸卵管狹窄、輸卵管卵巢膿腫、慢性盆腔痛，臨床表現(xiàn)為下腹及腰骶痛、白帶增多、不孕、異位妊娠等［2］。Ⅰ型膠原蛋白α1鏈（COL1A1）參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程［4］，與纖維化疾病的發(fā)生關(guān)系密切?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）由成纖維細(xì)胞分泌，可以降解已形成的纖維化組織，在纖維化疾病中起調(diào)節(jié)作用［5］。在SPID的發(fā)生發(fā)展過程中，成纖維細(xì)胞扮演了重要角色，參與調(diào)控ECM合成與重塑，以及組織損傷的修復(fù)，而COLIA1與MMP-9是否參與SPID的組織纖維化、粘連過程尚不明確。逍遙舒坤湯是劉金星教授自制方劑，具有疏肝解郁、活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，臨床用于治療SPID，臨床效果顯著，總有效率達(dá)84.6%［6］。但該藥物治療SPID的具體機制尚不清楚。2022年1月—2023年3月，我們對SPID大鼠給予逍遙舒坤顆粒進(jìn)行治療，觀察其對子宮、輸卵管組織炎癥的改善作用以及子宮組織COL1A1、MMP-9蛋白表達(dá)變化，初步探討逍遙舒坤顆粒治療SPID的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar雌性大鼠39只，體質(zhì)量（220 ± 20）g，有連續(xù)2個以上4～5 d動情周期（陰道涂片可見大量無核角化細(xì)胞）。動物由山東朋悅動物繁育有限公司提供，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)抗病毒中心。飼養(yǎng)條件：SPF級屏障環(huán)境，溫度20～24 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 逍遙舒坤顆粒組方：柴胡12 g、赤芍15 g、白芍12 g、當(dāng)歸12 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、香附12 g、枳殼12 g、路路通12 g、王不留行15 g、皂角刺15 g、敗醬草18 g、大血藤30 g、乳香6 g、沒藥6 g、延胡索18 g、小茴香6 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。大腸埃希菌液由北納生物科技有限公司提供，COL1A1、MMP-9抗體購自愛博泰克生物科技有限公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司提供，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液、PVDF膜由諾唯贊生物科技股份有限公司提供，4%多聚甲醛由賽維爾生物科技有限公司提供。移動電泳槽由賽維爾科技有限公司提供，離心機購自上海DragonLab。

1.2 動物分組與模型制備 將大鼠隨機分為對照組、模型組、藥物干預(yù)組，每組各13只。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組和藥物干預(yù)組以饑餓、疲勞輔助大腸桿菌上行感染法［7］建立SPID模型。大鼠經(jīng)饑餓（斷食24 h/復(fù)食24 h循環(huán)）及疲勞（持續(xù)1 h負(fù)重游泳，1次/天）干預(yù)12 d后，固定大鼠，暴露陰道，移液器探入陰道0.5 cm，少量、多次緩慢注入0.5 mL大腸桿菌菌液，將大鼠倒置30 s后，觀察陰道口無菌液自行流出方可入籠。每日固定時間注入菌液1次，連續(xù)3 d，第6天加強接種1次，然后正常飼養(yǎng)14 d。于造模結(jié)束后的第1、7、14天分別隨機取1只大鼠，麻醉、固定，剪開恥骨聯(lián)合至下頜正中線的皮膚和肌肉，肉眼觀察并評估卵巢、輸卵管、盆腔周圍結(jié)締組織三個部位出現(xiàn)的8種大體形態(tài)：輸卵管增粗，積水；盆腔結(jié)締組織增生，粘連，難分離；輸卵管卵巢粘連，包塊，囊腫。出現(xiàn)上述病理形態(tài)變化中任意一種或一種以上，即為造模成功［8］。

1.3 藥物干預(yù) 根據(jù)人與大鼠體表面積換算方法計算給藥劑量［9］，大鼠劑量（g/kg）=成人劑量（g）/成人體質(zhì)量（kg）×劑量比值，成人體質(zhì)量取60 kg，劑量比值取6.25。從造模成功后第14天開始，每日上午藥物干預(yù)組給予藥物濃縮液2 mL灌胃，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。

1.4 盆腔、輸卵管外觀情況及子宮、輸卵管組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠麻醉、固定、剪開腹腔，肉眼大致觀察盆腔和輸卵管情況。迅速完整剝離大鼠子宮和輸卵管末端，去除子宮和輸卵管上附著的脂肪及結(jié)締組織，生理鹽水洗去殘留血液。取一側(cè)子宮、輸卵管組織加入4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，采用HE染色法進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。梯度濃度乙醇脫水，蘇木素染色細(xì)胞核，伊紅溶液染色細(xì)胞質(zhì)；二甲苯透明，中性樹膠封片后觀察組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.5 子宮組織COL1A1、MMP-9蛋白檢測 采用Western blotting法。將大鼠另一側(cè)子宮組織放入液氮中，-80 ℃冷凍保存。取凍存的子宮組織，加入裂解液冰上充分裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入COL1A1、MMP-9一抗（稀釋比例為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜。ECL發(fā)光顯影，得到蛋白條帶圖片。在Image J軟件中計算蛋白條帶及內(nèi)參β-actin的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料使用t檢驗，以表示；組間兩兩比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠盆腔、輸卵管外觀情況 藥物干預(yù)組輸卵管輕微充血，無積水；與周圍組織粘連少且易分離，盆腔結(jié)締組織大多輕度增生，接近正常盆腔情況。模型組輸卵管增粗，且有積水；與周圍組織粘連邊界不清，不易分離，偶見包塊；盆腔結(jié)締組織增生明顯，且粘連嚴(yán)重。對照組輸卵管及盆腔結(jié)締組織均無明顯變化。

2.2 三組大鼠子宮、輸卵管組織形態(tài)學(xué)改變 對照組子宮、輸卵管組織結(jié)構(gòu)清晰，無增厚和纖維存在，無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組子宮、輸卵管組織結(jié)構(gòu)模糊，內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，藥物干預(yù)組子宮、輸卵管組織未見明顯邊界不清，見少量炎癥細(xì)胞，有少量纖維組織增生。見圖1。

2.3 三組大鼠子宮組織LOL1A1、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組COL1A1表達(dá)升高、MMP-9表達(dá)下降；與模型組比較，藥物干預(yù)組COL1A1表達(dá)下降、MMP-9表達(dá)升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 三組大鼠子宮組織COL1A1、MMP9蛋白表達(dá)水平比較（）

表1 三組大鼠子宮組織COL1A1、MMP9蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別對照組模型組藥物干預(yù)組MMP-9蛋白0.984 ± 0.221 1.292 ± 0.133*1.805 ± 0.299△n 10 10 10 COL1A1蛋白1.262 ± 0.050 1.894 ± 0.081*1.217 ± 0.058△

3 討論

盆腔炎性疾病是婦科常見疾病，也是導(dǎo)致不孕不育、輸卵管妊娠、慢性盆腔痛的重要因素［10］。由于盆腔炎性疾病臨床表現(xiàn)差異較大，臨床診斷準(zhǔn)確率不高，治療不及時、不全面，容易發(fā)展為SPID。目前西醫(yī)治療主要是緩解疼痛、松解粘連，抗生素治療常無明顯療效，甚至有許多不良反應(yīng)，手術(shù)治療往往給患者帶來巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不易被接受，因此尚缺乏對本病的理想療法。近年來，中醫(yī)藥已廣泛應(yīng)用于盆腔炎性疾病的治療，在整體觀念的基礎(chǔ)上，發(fā)揮因人而異、辯證施治、不良反應(yīng)少等獨特優(yōu)勢。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，依據(jù)盆腔炎性疾病的病機及臨床特征，可將其歸屬于“婦人腹痛”“帶下病”“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等疾病范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，SPID的病因病機以氣滯血瘀為主，肝經(jīng)循行少腹，所謂“經(jīng)絡(luò)所過，疾病所生”，因此治療盆腔炎性疾病大多從肝論治。逍遙舒坤顆粒具有疏肝解郁、活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，符合此病氣滯血瘀之病機。方中柴胡作為君藥，疏肝解郁，使肝氣條達(dá)。白芍、當(dāng)歸、赤芍為臣藥，赤芍活血化瘀，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，白芍滋陰柔肝，三者以助君藥行氣活血；柴胡、白芍劑量相同，養(yǎng)肝體以助肝用，白芍又可制約柴胡劫奪肝陰和防止其疏泄太過。白術(shù)、茯苓、香附、枳殼、皂角刺、路路通、王不留行、延胡索、乳香、沒藥、紅藤、敗醬草、小茴香為佐藥，白術(shù)、茯苓，健脾益氣除濕，使?fàn)I血生化有源，白術(shù)、茯苓主要用于白帶量多者；香附、枳殼疏肝理氣；路路通、王不留行活血通絡(luò)止痛，尤其適用于輸卵管不通者；敗醬草、大血藤、皂角刺清熱解毒、活血化瘀，清泄火熱之象，以除濕熱之邪。小茴香可作為引經(jīng)藥入肝經(jīng)，疏肝止痛，亦可防止敗醬草、大血藤等寒性藥物寒凝冰敷之弊；乳香、沒藥、延胡索既可活血化瘀治本，又可止痛以治標(biāo)，標(biāo)本皆顧。整個方藥體現(xiàn)了疏肝理氣、活血化瘀、通絡(luò)止痛的治療思路。氣血同治，以“疏其血氣，令其調(diào)達(dá)”，氣血和，胞脈暢，則瘀痛除，諸證自愈。目前逍遙舒坤顆粒在臨床中主要用于治療SPID。呂殊菡等［6］報道，104例SPID患者服用逍遙舒坤顆粒治療后，總有效率達(dá)84.6%，患者腹痛墜脹、腰痛掣背、胸乳脹痛、白帶異常等臨床癥狀明顯緩解。于瀟［11］研究發(fā)現(xiàn)，逍遙舒坤顆粒在緩解疼痛方面總有效率達(dá)89.5%。這表明逍遙舒坤顆?？擅黠@改善SPID患者臨床癥狀和體征。

SPID常引起子宮、輸卵管等組織破壞、粘連及瘢痕形成，臨床表現(xiàn)為下腹及腰骶痛、白帶增多等。通過疲勞、饑餓輔助大腸桿菌上行感染法建立大鼠SPID模型，可以產(chǎn)生與人體相似的盆腔炎性疾病的病理過程。建模后模型組大鼠表現(xiàn)為輸卵管增粗，與周圍組織粘連邊界不清，不易分離，偶有包塊；盆腔結(jié)締組織增生明顯，且粘連嚴(yán)重，內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤。

在細(xì)胞外基質(zhì)大環(huán)境中，成纖維細(xì)胞不僅分泌基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs），還參與Ⅰ型膠原蛋白合成。COL1A1作為Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈，其主要作用是維持組織的完整性和穩(wěn)定性。膠原蛋白家族的基因編碼有30多種，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可分為非成纖維性與成纖維性兩類［12］。COL1A1屬于成纖維性膠原，參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、腫瘤細(xì)胞黏附轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程［13］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組COL1A1表達(dá)水平明顯上調(diào)，給予逍遙舒坤顆粒干預(yù)后COL1A1表達(dá)明顯下調(diào)，子宮與周圍組織粘連減少且易分離。表明逍遙舒坤顆?？梢酝ㄟ^降低COL1A1的表達(dá)，抑制纖維化，改善SPID。

MMP-9是MMPs家族成員，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞均可產(chǎn)生MMP-9，在眾多纖維化性疾病中起調(diào)節(jié)作用，如創(chuàng)傷愈合、血管生成、骨骼發(fā)育等。其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的結(jié)構(gòu)蛋白Ⅳ型膠原，可破壞基底膜屏障，向周圍組織浸潤［14-15］。本研究結(jié)果顯示，模型組MMP-9表達(dá)較對照組明顯下降；給予逍遙舒坤顆粒干預(yù)后MMP-9表達(dá)明顯上調(diào)。表明逍遙舒坤顆?？纱龠M(jìn)MMP-9分泌，從而降解ECM，減輕SPID大鼠盆腔組織粘連及纖維化進(jìn)程。

綜上所述，逍遙舒坤顆粒能夠減輕盆腔周圍組織粘連增生和纖維化程度，其機制可能與上調(diào)COL1A1表達(dá)、下調(diào)MMP-9表達(dá)有關(guān)，從而達(dá)到治療SPID的作用。這為臨床應(yīng)用逍遙舒坤顆粒治療SPID提供更加完善的理論基礎(chǔ)和用藥依據(jù)。