天麻治療動脈粥樣硬化作用機(jī)制探討

程江豪，陳普，楊麗萍，段小花

云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650500

動脈粥樣硬化（AS）是頸動脈斑塊、冠狀動脈疾病和缺血性中風(fēng)等心血管疾病的病理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致心血管性疾病的主要死亡原因之一。根據(jù)流行病學(xué)研究，超過60%的心血管疾病患者死亡歸因于動脈粥樣硬化性心血管疾病。AS的發(fā)生發(fā)展與血脂異常、內(nèi)皮損傷和免疫性炎癥等有關(guān)，但其具體病理生理機(jī)制仍未闡明。天麻為蘭科天麻屬植物天麻的干燥塊莖，味甘、性平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、平肝潛陽、通絡(luò)、補(bǔ)益之功效［1］。天麻在彝藥“毒邪理論”中屬攆內(nèi)風(fēng)毒藥，風(fēng)毒這種致病因素有“變動不居”之性，可分為外風(fēng)毒與內(nèi)風(fēng)毒兩類，外風(fēng)毒由自然風(fēng)邪所致，常侵襲人體頭、肺及皮膚等處，而內(nèi)風(fēng)毒多深入臟腑［2］。動物實(shí)驗(yàn)表明，天麻和天麻素及其復(fù)方制劑能夠改善早期AS小鼠主動脈病變和脂質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)血脂表達(dá)，穩(wěn)定主動脈斑塊，保護(hù)血管免受炎癥損傷，提示天麻具有潛在的抗AS作用［3-5］。2022年9月—2023年4月，我們基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討天麻治療AS的分子機(jī)制，旨在為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 天麻有效活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 在中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMIP（http：//www.tcmip.cn/）中檢索天麻的有效活性成分，篩選條件為胃腸吸收利用度“高”且藥物相似性“兩個Yes以上”。將檢索獲得的天麻有效活性成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），以分值＞0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取其成分相關(guān)靶點(diǎn)，并通過文獻(xiàn)補(bǔ)充未預(yù)測出的已知靶點(diǎn)，同時導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）標(biāo)準(zhǔn)化其靶點(diǎn)基因。

1.2 AS的疾病靶點(diǎn)篩選 在TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Drug Bank（www.drugbank.ca）、Gene Cards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中，以“atherosclerosis”為檢索詞檢索AS的疾病靶點(diǎn)，取5個數(shù)據(jù)庫的并集并去重。

1.3 藥物—疾病核心靶點(diǎn)篩選 使用Venny2.1.0在線網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將天麻有效活性成分的作用靶點(diǎn)與AS疾病靶點(diǎn)取交集，獲得藥物—疾病交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。基于獲得的交集靶點(diǎn)與天麻有效活性成分對應(yīng)關(guān)系，建立有效活性成分—靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens”，各節(jié)點(diǎn)置信度評分＞0.9，刪除游離節(jié)點(diǎn)后建立PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖。使用CytoScape3.9.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，根據(jù)度值排名篩選藥物—疾病核心靶點(diǎn)；利用CytoScape3.9.1軟件中的Network Analyzer插件從網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)角度分析各節(jié)點(diǎn)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選天麻的關(guān)鍵活性成分，取Degree值排名前5位。

1.4 藥物—疾病交集靶點(diǎn)的功能預(yù)測 使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），借助基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）對藥物—疾病交集靶點(diǎn)的重要生物學(xué)進(jìn)程和信號通路進(jìn)行富集分析。以“OFFICIAL GENE SYMBOL”作為標(biāo)識符，“Homo sapiens”作為物種類別，P＜0.01為條件。使用SRplot云平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線工具進(jìn)行繪圖分析，結(jié)果呈現(xiàn)為氣泡圖。

1.5 天麻關(guān)鍵活性成分與疾病核心靶點(diǎn)的分子對接 將“1.3”篩選獲得的天麻關(guān)鍵活性成分結(jié)構(gòu)與藥物—疾病核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)作三維結(jié)構(gòu)可視化分子對接分析。借由Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點(diǎn)蛋白ID，通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）獲得核心靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，從Pub Chem數(shù)據(jù)庫獲得天麻關(guān)鍵活性成分的三維結(jié)構(gòu)，最后通過Pymol（https：//pymol.org/）、AutoDockTools（https：//autodocksuite.scripps.edu/adt/）、Vina（http：//vina.scripps.edu/）軟件進(jìn)行分子對接，計算結(jié)合能，用來表示天麻關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力。當(dāng)結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表明二者具有較好的結(jié)合能力，＜-7.0 kcal/mol表明二者具有強(qiáng)結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 藥物—疾病交集靶點(diǎn)篩選結(jié)果 共獲得天麻有效活性成分15個，并補(bǔ)充中國藥典2020版中天麻主要指標(biāo)性成分天麻素，共獲得有效活性成分16個（OSID碼表1），預(yù)測作用靶點(diǎn)267個；其中香草醇未預(yù)測到作用靶點(diǎn)，通過文獻(xiàn)［6］補(bǔ)充其靶點(diǎn)基因DRD2，共獲得天麻作用靶點(diǎn)268個。AS疾病相關(guān)靶點(diǎn)共1 336個，將其與天麻的268個作用靶點(diǎn)取交集后，獲得藥物—疾病交集靶點(diǎn)97個，見OSID碼圖1。

表1 天麻關(guān)鍵活性成分與藥物—疾病核心靶點(diǎn)的結(jié)合能（kcal/mol）

2.2 藥物—疾病核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果 將97個藥物—疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape1軟件，建立天麻治療AS的有效活性成分—靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見OSID碼圖2。天麻中的香草醛、棕櫚酸、丁二酸、對羥基苯甲醛、雙（4-羥基苯基）醚等16種有效活性成分作用于97個共同靶點(diǎn)基因，其中棕櫚酸的作用靶點(diǎn)最多，有43個；其次是4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚與4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚，分別作用于40個靶點(diǎn)?；诮患悬c(diǎn)建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖（OSID碼圖3），利用Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行可視化分析（OSID碼圖4），根據(jù)Degree值排名前5名篩選出藥物—疾病核心靶點(diǎn)AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1。

2.3 藥物—疾病交集靶點(diǎn)的富集通路分析結(jié)果對97個藥物—疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，共涉及相關(guān)條目468條，其中生物學(xué)進(jìn)程（BP）240個、細(xì)胞組分（CC）114個、分子功能（MF）114個。生物學(xué)進(jìn)程主要涵蓋對脂多糖的反應(yīng)、一氧化氮合成的正調(diào)控、凋亡的負(fù)調(diào)控、炎癥調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組件包含有薄膜、質(zhì)膜、生物大分子復(fù)合體等；分子功能主要涵蓋RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等（OSID碼圖5）。KEGG通路分析獲得137條相關(guān)通路，主要富集于癌癥通路、血清素能突觸、脂質(zhì)和AS、PPAR信號通路等，見OSID碼圖6。

2.4 天麻關(guān)鍵活性成分與藥物—疾病核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果 以藥物—疾病核心靶點(diǎn)AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1為受體，以天麻關(guān)鍵活性成分棕櫚酸、雙酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚、對羥基芐基乙醚及4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚為配體，進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示，雙酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚、4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚與藥物—疾病核心靶點(diǎn)AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1的結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol，見表1。經(jīng)可視化處理后，均可借助氫鍵等分子間作用力結(jié)合，形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象，見OSID碼圖7。

3 討論

天麻別名為木浦（《彝族醫(yī)藥學(xué)》）、赤箭（《大理中藥資源志》）、定風(fēng)草、白龍皮（《現(xiàn)代臨床中藥志》）等，是常見且名貴的彝藥。彝醫(yī)常用其治療小兒四六風(fēng)、驚厥、抽搐、產(chǎn)后諸癥、破傷風(fēng)等實(shí)證，也可用于治療頭昏眼花、心悸、久病體虛不愈等虛證，提示天麻可能對心腦血管相關(guān)慢性虛勞性疾病有治療作用［1］?！对焖幹尾分杏涊d，彝醫(yī)治療肺源性心臟病中多臟器瘀血證，可選取天麻30 g、三七15 g、滇黨參100 g組成藥方。《醫(yī)學(xué)心悟》云：“濕痰壅遏者，書云，頭旋眼花，非天麻、半夏不除是也。”這些鈣化、沉著及脂質(zhì)堆積在中醫(yī)中常被視為痰濕。此外，因富含生物活性物質(zhì)，天麻一直被公認(rèn)為食療與藥物佳品，在藥理方面具有降壓、降脂、增強(qiáng)免疫力、腦保護(hù)等作用［7］，因此推測天麻或可作為治療AS的潛在藥物。

本研究首先基于ETCM等數(shù)據(jù)庫篩選出雙酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚、4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚等16個天麻有效活性成分及其抗AS的潛在靶點(diǎn)基因97個，構(gòu)建了PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1這5個藥物—疾病核心靶點(diǎn)基因。這表明天麻通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗AS作用，這些藥物—疾病核心靶基因極可能是天麻治療AS的主要靶點(diǎn)基因。在天麻的有效活性成分中，我們分析得出雙酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚、4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚是抗AS的關(guān)鍵成分，且這三種成分為天麻所獨(dú)有。雙酚F是一種可用于制作抗氧劑及表面活性劑的芳香型有機(jī)化合物。研究表明，雙酚F可能通過電壓依賴性Ca2+通道抑制Ca2+的流入，減少細(xì)胞中Ca2+水平，從而發(fā)揮舒張血管作用，改善AS引起的高血壓［8］。一些研究發(fā)現(xiàn)，雙酚F可抑制脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的產(chǎn)生和分泌，可通過下調(diào)類固醇生成相關(guān)基因和蛋白質(zhì)（STAR、CYP11A1和HSD3B1）表達(dá)降低類固醇水平，還可限制IRS-1/PI3K/AKT信號通路激活來抑制4T3-L3脂肪細(xì)胞中葡萄糖的消耗，從而起到降脂降糖作用［9-11］。4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚和4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚作為僅來源于天麻的成分，目前相關(guān)報道很少，有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。上述研究表明，天麻有效活性成分可能在調(diào)節(jié)離子通道、抗氧化及降脂等方面發(fā)揮抗AS作用，這與AS的病理機(jī)制相符。

本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫對藥物—疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測出天麻抗AS的5個核心靶點(diǎn)AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1。FERNáNDEZ-HERNANDO等［12］報道，在AKT1基因敲除小鼠中，內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡增加，促炎基因表達(dá)增強(qiáng)，eNOS磷酸化減少，從而促進(jìn)AS形成。PTGS2是驅(qū)動花生四烯酸代謝過程的重要酶，PTGS2上調(diào)與細(xì)胞黏附增加、細(xì)胞凋亡及炎癥生成密切相關(guān)［13］。AS嚴(yán)重程度與PTGS2表達(dá)呈正相關(guān)，PTGS2可能作為AS的樞紐基因，或可作為其生物標(biāo)志物［14］。ESR1作為主要雌激素受體之一，激活ESR1可減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，通過抗炎、抗氧化及凋亡等起到抗AS作用［15］。動物實(shí)驗(yàn)顯示，AS大鼠PPARG蛋白表達(dá)水平明顯降低，而上調(diào)PPARG蛋白表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞膽固醇外排，維持脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)［16］。另有研究顯示，上調(diào)CASP3表達(dá)能夠抑制氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞具有保護(hù)作用［17］。因此我們認(rèn)為，上述5個核心靶點(diǎn)與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在天麻抗AS過程具有重要作用，這為今后的研究提供了方向。

本研究采用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測的天麻抗AS潛在靶點(diǎn)的作用。GO分析結(jié)果表明，天麻抗AS主要涉及對藥物的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、炎癥應(yīng)答等生物學(xué)進(jìn)程，集中在炎癥、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)調(diào)節(jié)與抗凋亡等方面。已有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、炎癥、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的形成在AS的病理過程中起重要作用，如促炎癥因子IL-6可通過PPARα和PGC-1α等途徑調(diào)節(jié)高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠心臟脂質(zhì)代謝［18-22］。因此，天麻可能通過參與抗炎、抗氧化應(yīng)激、降脂與抗凋亡等生物學(xué)進(jìn)程，發(fā)揮其治療AS的作用。

KEGG富集分析表明，脂質(zhì)和AS通路、癌癥通路、PPAR信號通路與AS的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密。脂質(zhì)和AS通路是富集得到的主要通路之一，共涉及15個靶點(diǎn)，其中PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的天麻抗AS核心靶點(diǎn)AKT1、PPARG、CASP3富集在此通路上。動物研究發(fā)現(xiàn)，天麻中的酸性多糖提取物通過抑制高脂飲食SD大鼠血清膽固醇的合成來抑制動脈粥樣硬化風(fēng)險指數(shù)［23］。癌癥通路與多條信號通路相關(guān)，如NF-κB、AKT/mTOR等信號通路，涉及炎癥、免疫及凋亡等多個環(huán)節(jié)，本研究中PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的5個天麻抗AS核心靶點(diǎn)AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1均富集在此通路上。有報道表明，接受過癌癥治療（包括放療）的癌癥幸存者患動脈粥樣硬化性心血管疾病的風(fēng)險升高，患冠狀動脈疾病的風(fēng)險增加1.3～3.6倍，患動脈粥樣硬化性疾病的風(fēng)險增加1.7～18.5倍［24-25］。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，天麻素可通過AKT/mTOR信號通路對甲基苯丙胺誘導(dǎo)的人多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬具有保護(hù)作用［26］。PPAR信號通路參與脂質(zhì)代謝、炎癥和氧化應(yīng)激［27］。巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白會產(chǎn)生泡沫細(xì)胞，這是AS病變的標(biāo)志。體外研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可通過AMPK/FoxO1/TFEB信號通路誘導(dǎo)溶酶體生物生成和自噬，防止泡沫細(xì)胞形成［28］。此外，天麻素還可通過上調(diào)PPARβ和減輕硝化應(yīng)激保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受高血糖誘導(dǎo)的損傷，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［29］。上述研究驗(yàn)證了本研究的準(zhǔn)確性，為天麻抗AS后續(xù)的研究提供了依據(jù)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對天麻多成分、多靶點(diǎn)治療AS的作用機(jī)制進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分子對接論證，發(fā)現(xiàn)天麻可能通過4-乙氧基甲基苯基-4'-羥基苯基醚、4-（4'-羥基芐氧基）芐基甲醚、雙酚F等天麻關(guān)鍵活性成分作用于PTGS2、ESR1等藥物—疾病核心靶點(diǎn)，通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、降脂與抗凋亡等途徑，調(diào)節(jié)癌癥通路、脂質(zhì)和AS通路及PPAR信號通路等通路發(fā)揮其抗AS作用。