文蛤MmASS基因克隆及生物信息學(xué)分析

陳素華,陳愛華*,吳楊平,張 雨,曹 奕,張志東,孫雪峰,朱艷青

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通 226007;2.南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 南京 201123)

精氨酸琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase, ASS)能在ATP作用下催化瓜氨酸(L-Citrulline)和天冬氨酸(L-Aspartate)形成精氨琥珀酸(Argininosuccinate),該產(chǎn)物經(jīng)精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase, ASL)裂解形成精氨酸(L-Arginine)和延胡索酸(L-Fumarate);其中精氨酸能被精氨酸酶(Arginase)水解生成尿素(Urea),也可與一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)反應(yīng)生成一氧化氮(Nitric oxide, NO)和瓜氨酸[1-2]。ASS是生成精氨酸、尿素和一氧化氮的關(guān)鍵限速酶,研究報(bào)道ASS調(diào)控產(chǎn)生的這些產(chǎn)物與生物體的免疫功能息息相關(guān),可增強(qiáng)生物體細(xì)胞的殺菌和吞噬能力,提高免疫球蛋白含量,從而起到提高生物體自身免疫功能的作用[3-4]。

在人體中,ASS基因受到炎癥因子、激素等因素的刺激后,其轉(zhuǎn)錄水平會(huì)發(fā)生明顯的變化進(jìn)而影響其他生理功能,ASS基因已成為癌癥、腫瘤等疾病個(gè)體化治療研究的新靶點(diǎn),是醫(yī)療研究的熱點(diǎn)[5-8];植物中僅見棉花(Gossypiumhirsutum)ASS1基因的克隆與鑒定,研究證明該基因具有調(diào)控植物的生長(zhǎng)和耐鹽的能力[9];干酵母(Yeast)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等菌類中也有ASS基因的相關(guān)報(bào)道[10-11];水產(chǎn)動(dòng)物中,ASS基因的相關(guān)研究很少,僅見非洲肺魚(Protopterusannectens)中有報(bào)道,Chng等[12]克隆獲得了非洲肺魚ASS基因的全長(zhǎng)序列,研究分析了該基因結(jié)構(gòu)特征和功能,證明非洲肺魚在高溫、缺水的夏眠期,該基因在肝臟、腎臟、腦、骨骼肌等各組織中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。ASS基因的下游基因精氨酸酶基因(Arg)及下游產(chǎn)物精氨酸卻是水產(chǎn)動(dòng)物研究的熱點(diǎn),Arg基因參與魚類抗感染免疫應(yīng)答過程[13-15];精氨酸作為功能性氨基酸,具有促進(jìn)魚體生長(zhǎng)、改善免疫系統(tǒng)及腸道功能的作用,飼料中添加一定水平的精氨酸有利于魚類的健康養(yǎng)殖[16-17]。ASS處于Arg合成代謝的中心地位,必然也發(fā)揮著重要的作用。而在貝類中,僅見NCBI數(shù)據(jù)庫中上傳的ASS基因序列,具體的基因特征、功能研究等還未見有報(bào)道。

文蛤是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類之一,文蛤養(yǎng)殖尤其是以江蘇省為主產(chǎn)區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)殖推動(dòng)了貝類經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,同時(shí),為響應(yīng)國家綠色健康養(yǎng)殖的號(hào)召,江蘇沿海地區(qū)開展了文蛤與蝦蟹混養(yǎng)模式,取得良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。但由于近年來氣候原因引起的夏季溫度整體上升,文蛤在高溫季節(jié)死亡率明顯上升,給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。水溫是影響貝類攝食、生長(zhǎng)、代謝和免疫反應(yīng)的重要外界環(huán)境因素之一,更甚至?xí)绊懾愵惖拿庖呦到y(tǒng)和抗病能力,進(jìn)而誘發(fā)貝類的高死亡率[18]。本研究篩選獲得了文蛤ASS基因的EST序列,使用RACE克隆技術(shù)獲得該基因的cDNA全長(zhǎng)序列,使用生物信息學(xué)方法分析該基因的結(jié)構(gòu)特征,以期為深入了解文蛤的免疫機(jī)制,也為后續(xù)項(xiàng)目組開發(fā)文蛤抗逆新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MmASS基因克隆

使用RACE技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends)克隆獲得MmASS基因cDNA全長(zhǎng)。根據(jù)RNA提取試劑盒(天根)的說明書提取文蛤肝胰腺的總RNA,根據(jù)Clontech RACE試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。在已知的MmASS基因EST序列上設(shè)計(jì)3’和5’RACE引物,F1:TTGGATCGGGAGGTGAGAAAAAT,R1:CAGCGCCTAGTTTCATAGCTTTC。PCR獲得目的基因產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用膠回收試劑盒(天根)進(jìn)行純化回收,將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接,使用E.coliCompetent Cells DH5α細(xì)胞開展目的基因的陽性克隆,篩選含有目的基因片段的菌液測(cè)序,并拼接獲得目的基因cDNA全長(zhǎng)序列。引物合成和測(cè)序均由上海生工生物有限公司完成。

1.2 MmASS基因生物信息學(xué)分析

使用NCBI的ORF Finder尋找MmASS基因cDNA全長(zhǎng)序列開放閱讀框,并使用blast驗(yàn)證該基因與其他物種的相似性;運(yùn)用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行序列拼接以及理化特性分析;使用ExPASy中的Compute pI/Mw工具計(jì)算分子量和理論等電點(diǎn);使用SMART在線軟件分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域;使用Swiss-Model工具預(yù)測(cè)MmASS蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu);使用ProtParam軟件分析該蛋白序列的親水和疏水性;使用TMHMM-2.0在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域;使用PSORT Prediction在線網(wǎng)頁進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;運(yùn)用MEGA 5.1 軟件,Neighbor-joining方法,采用 Bootstrap 法重復(fù)計(jì)算 1 000次,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.3 MmASS基因的表達(dá)特征分析

試驗(yàn)所用文蛤?yàn)榻K如東天然野生文蛤,運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后水泥池暫養(yǎng),水泥池內(nèi)鋪設(shè)海沙,24 h連續(xù)充氣,定期換水,每日定期投喂金藻(Dicrateria)、扁球藻(Tetraselmis)等人工餌料,半個(gè)月后取樣。選取6個(gè)大小規(guī)格均一、殼色鮮亮、外表無破損的自然文蛤,低溫麻醉后分別取其鰓、外套膜、閉殼肌、足、肝胰腺等不同組織樣品,用1×PBS(磷酸鹽緩沖鹽水, 0.01 mol/L)洗滌后, 液氮速凍, -80 ℃冰箱凍存, 用于RNA提取。使用RNA提取試劑盒分別提取各個(gè)組織樣品的總RNA,使用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳及One Drop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。RNA樣本檢測(cè)合格后,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根)的操作說明合成cDNA,用于熒光定量分析實(shí)驗(yàn)。

使用Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀分析MmASS基因的表達(dá)特征,設(shè)計(jì)并篩選熒光定量特異性引物,qPCR-F:GAGTATGCGAGGGTGAAAGGTAT,qPCR-R:GCATCTGTCTTAACTGTGCCATC。根據(jù)熒光定量試劑盒(Bio-Rad, USA)說明書配置體系:總體積25 μL, 其中cDNA 1 μL(100 ng), SsoFastTMEvaGreenSupermix (BioRad, USA)10 μL,特異性正向和反向引物各0.5 μL(10 μmol/L), ddH2O 13 μL。反應(yīng)條件:95 ℃溫浴15 min, 活化Hot Start Taq DNA聚合酶, 然后按95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用β-actin作為內(nèi)參基因,β-F:TTGTCTGGTGGTTCAACTATG,β-R:TCCACATCTGCTGGAAGGTG。每個(gè)樣品做4個(gè)重復(fù),每次PCR分析結(jié)束時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的解離曲線分析。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算熒光定量數(shù)據(jù)[19],數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 20.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MmASS基因全長(zhǎng)及結(jié)構(gòu)域分析

使用RACE技術(shù)克隆文蛤ASS基因,使用DNAMAN軟件拼接獲得該基因全長(zhǎng)序列,并將該基因命名為MmASS。結(jié)果顯示,該基因cDNA全長(zhǎng)1 588 bp,其中1-59 bp為5’非翻譯區(qū)(Untranslated regions, UTR),60-1 307 bp為開放閱讀框(Open reading frame, ORF),共編碼415個(gè)氨基酸,1 308-1 588 bp為3’非翻譯區(qū),起始密碼為ATG,終止密碼為TGA,3’非翻譯區(qū)包含一個(gè)加尾信號(hào)AATAA和poly(A)尾巴。該基因分子量為46.81 kD,理論等電點(diǎn)pI為5.51。預(yù)測(cè)蛋白序列包含6個(gè)保守序列:(1)[A/S/L]-[F/Y]-S-G-G-[L/V]-D-T-[S/T](13-21 aa),(2)[F/Y/L]-[T/M/L]-A-[D/N]-[V/L/I]-G-Q(37-43 aa),(3)Y-x(3)-T-x(3)-R(90-98 aa),(4)G-x-T-x-[K/R/M]-G-N-D-x(2)-R-F(120-131 aa),(5)S-x-D-x-N-x(6)-E(183-194 aa),(6)E-[N/D]-R-x(4)-K-x(4)-Y-E(273-286 aa)。這些保守結(jié)構(gòu)域主要集中了ATP結(jié)合位點(diǎn)、天門冬氨酸L-Asp結(jié)合位點(diǎn)以及瓜氨酸L-Cit結(jié)合位點(diǎn)(見圖1)。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白序列包含15個(gè)α螺旋和16個(gè)β折疊(見圖2)。ProtParam在線軟件分析結(jié)果顯示MmASS蛋白序列具有親水性(見圖3)。MmASS蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域(見圖4)。

圖2 文蛤ASS蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Three dimensional structure prediction of MmASS

圖3 文蛤ASS蛋白的親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic and hydrophobic properties of ASS in M.meretrix

圖4 文蛤ASS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Analysis of transmembrane structure of ASS in M.meretrix

2.2 MmASS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹及氨基酸序列分析

使用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)化樹分析所用物種及登陸號(hào)見表1,結(jié)果如圖5所示。文蛤MmASS基因與縊蟶(Sinonovaculaconstricta)親緣關(guān)系最近,隨后與長(zhǎng)牡蠣、貽貝、蝦夷扇貝等聚為一支。氨基酸序列相似性結(jié)果顯示,文蛤MmASS基因與縊蟶的ASS基因蛋白序列相似度最高,達(dá)78.31%;其次是長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)72.36%和紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)71.33%。氨基酸序列對(duì)比圖(見圖6)中不同顏色表示氨基酸序列保守性的高低,深藍(lán)色表示序列的高保守性,由圖中可以看出,各物種的ASS基因的保守結(jié)構(gòu)域相似度極高。

表1 系統(tǒng)進(jìn)化樹中各物種ASS蛋白序列登錄號(hào)Table 1 Accession number of ASS proteins sequence in the phylogenetic tree

圖5 ASS系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of ASS proteins

圖6 文蛤ASS基因與其他物種的氨基酸序列對(duì)比圖Fig.6 Multi-sequence alignment of ASS in M. meretrix and other species

2.3 MmASS的亞細(xì)胞定位分析

表2為MmASS蛋白預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位的具體結(jié)果,預(yù)測(cè)MmASS在可能定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及線粒體中,定位于細(xì)胞質(zhì)中的可能性最高。

表2 文蛤ASS亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 2 Predicted subcellular localization of ASS in M.meretrix

2.4 MmASS的組織表達(dá)特征

使用qPCR檢測(cè)MmASS基因在文蛤各個(gè)組織中的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果如圖7所示。在被檢測(cè)的5個(gè)組織中(鰓、外套膜、閉殼肌、足、肝胰腺),MmASS均有表達(dá),且在鰓中的表達(dá)量最高(P<0.05),其次是肝胰腺。

圖7 MmASS基因在不同組織中的表達(dá)Fig.7 Expression levels of MmASS in different tissues

3 討論

ASS是精氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶,同時(shí)也是尿素循環(huán)和NO合成的限速酶,一般分子量約46 kD,是由單肽構(gòu)成的同源四聚體,ASS序列高度保守,主要包括核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、精氨酸琥珀酸合成結(jié)構(gòu)域以及C端多聚化螺旋功能區(qū)域[3, 20]。本文運(yùn)用3’和5’RACE技術(shù)首次克隆獲得文蛤MmASS基因的全長(zhǎng),共包含415個(gè)氨基酸殘基,分子量為46.81 kD。MmASS的預(yù)測(cè)氨基酸序列包含上述三大功能結(jié)構(gòu)域,并存在6個(gè)高度保守片段,富集了ATP結(jié)合位點(diǎn)、天門冬氨酸L-Asp結(jié)合位點(diǎn)以及L-Cit結(jié)合位點(diǎn)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,MmASS的功能結(jié)構(gòu)域與其他物種相似度極高,說明文蛤的ASS基因較為保守,且可能與其他物種的ASS一樣具有相似的基因功能。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,MmASS基因與雙殼類親緣關(guān)系較近,聚為一大支,符合進(jìn)化規(guī)律。貝類中還未見有ASS基因的詳細(xì)報(bào)道,本文首次開展了文蛤MmASS基因的克隆及特征分析,可為后續(xù)貝類的相關(guān)研究提供借鑒。

早期的研究認(rèn)為ASS是一種胞質(zhì)酶[21-22]。Cohen等[23]開展的亞細(xì)胞分離研究表明,該酶的一部分與線粒體的外膜相連。哺乳動(dòng)物的ASS因組織細(xì)胞的不同或發(fā)育階段的不同而具有不同的亞細(xì)胞定位。在人體內(nèi)皮細(xì)胞中,ASS定位于小泡和高爾基體外[24-25];牛的腸上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞中,ASS分布于細(xì)胞質(zhì)中,在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中,ASS分布在質(zhì)膜周圍[26-27];大鼠胎兒時(shí)期,90%的ASS定位于的肝細(xì)胞中的線粒體,到大鼠成年時(shí)期,只有30%的ASS定位在的肝細(xì)胞線粒體中[28]。在大腸桿菌中,ASS定位在細(xì)胞質(zhì)中[29]。本研究中亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),MmASS蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大。

ASS是一種普遍存在的酶,許多研究確定其活性存在于許多組織中。成年大鼠中,ASS的mRNA在各個(gè)組織中均有表達(dá),如肝臟、腎臟、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、眼細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞等,其表達(dá)量和蛋白酶活性在肝臟和腎臟中最高,而在腸中的表達(dá)量最低[20-21,30-31];此外,在人的胰島細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,牛的肝臟、主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞等均檢測(cè)到ASS的存在。Chng等[12]研究發(fā)現(xiàn),ASS基因在非洲肺魚的肝臟、腎臟、腦以及骨骼肌中均有表達(dá)。本研究的結(jié)果顯示,MmASS基因在文蛤的各個(gè)組織中均有表達(dá),這與上述的研究結(jié)果相似。ASS的功能與其所在的組織,細(xì)胞的類型相關(guān),不同的調(diào)控機(jī)制決定了ASS的不同生理功能。MmASS在文蛤的鰓中表達(dá)量最高,其次是肝胰腺。在雙殼貝類中,鰓和肝胰腺是重要的免疫組織,對(duì)調(diào)節(jié)貝類自身的免疫機(jī)制至關(guān)重要,可合成免疫因子啟動(dòng)免疫反應(yīng)以抵抗外來有害物質(zhì)的入侵[32-33]。據(jù)此推測(cè),MmASS參與調(diào)節(jié)文蛤各個(gè)組織的生理活動(dòng),可能在文蛤的免疫防御機(jī)制中發(fā)揮重要功能。本研究對(duì)文蛤ASS基因開展生物信息學(xué)分析,具體的功能還有待深入研究,可結(jié)合細(xì)胞亞細(xì)胞定位等技術(shù)深入開展基因功能的挖掘,以期為文蛤抗逆新品系的選育奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

首次克隆獲得文蛤MmASS基因cDNA序列,該基因共編碼415個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白序列包含的6個(gè)保守功能域與其他物種具有較高的相似度,說明該基因高度保守。文蛤MmASS與縊蟶、貽貝、牡蠣等雙殼貝類的親緣關(guān)系最近。MmASS在文蛤鰓組織中的表達(dá)量最高,該基因可能在文蛤的免疫防御機(jī)制中發(fā)揮重要功能。本研究旨在為深入了解文蛤的免疫機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。